一种可视标记与单性结实性状连锁的番茄品系制备方法

摘要

本发明公开了一种具有柱头外露性状的单性结实番茄的制备方法，该制备方法为，使用CRISPR/Cas9系统，将番茄的GenBank登录号为NM_001361530.1的番茄基因SlAGL6的第一外显子进行突变，进一步得到纯合突变体，与野生型相比，该纯合突变体具备稳定的单性结实性状，无其它不良性状连锁，逆境下坐果率高，且柱头外露，可作为形态标记方便肉眼识别单性结实植株，同时可在杂交育种过程中省去人工去雄等工序，节省杂交育种时间和成本。

权利要求

1.一种具有柱头外露性状的单性结实番茄的制备方法，所述方法为敲除番茄基因SlAGL6；所述方法为敲除番茄基因SlAGL6的第一外显子；

所述方法为将所述番茄基因SlAGL6的蛋白序列突变成如SEQ ID NO.4所示的蛋白序列。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法为将敲除所述番茄基因SlAGL6的番茄突变体制备成突变纯合体。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述番茄基因SlAGL6的GenBank登录号为：NM_001361530.1。

4.如权利要求1‑3中任一项所述的制备方法，其特征在于，敲除所述番茄基因SlAGL6是使用CRISPR/Cas9系统实现的。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中表达sgRNA的载体中靶序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种基因，所述基因的编码序列能够编码如权利要求6所述的蛋白。

8.如权利要求7所述的基因，其特征在于，所述基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求1‑5中任一项所述的制备方法、如权利要求6所述的蛋白或如权利要求7或8所述的基因在构建番茄杂交制种中的用途。

说明书

一种可视标记与单性结实性状连锁的番茄品系制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于作物育种技术领域，涉及用CRISPR/Cas9敲除SlAGL6基因创制番茄柱头外露的且无不良农艺性状连锁的单性结实种质。

背景技术

[0002] 番茄(Solanum lycopersicum)单性结实具有很多优点：(1)逆境条件下坐果稳定性好；(2)果实品质好：主要表现为畸形果率低，可溶性固形物含量高；(3)省去番茄生产中
点花工序，安全且低成本；(4)番茄加工过程中(如制作番茄酱)省去去籽过程；(5)可作为雄
性不育株，应用于制种，省去去雄工序。

[0003] 目前，已发现单性结实的基因有SlIAA9(Ueta et al,2017)、SlARF7(Jong etal，2009)等，而且已经通过基因敲除技术敲除这些基因获得了单性结实突变体,但获得的突变
体均与不良性状连锁，在实际应用中受限。

[0004] 柱头外露在番茄育种中具有很高的应用价值。它可以省去人工去雄程序，大大节省育种成本，提高育种效率。人们一直努力将柱头外露表型与不育、单性结实优良性状聚合
在一起，应用于育种。但目前尚未获得具有实际应用价值的优良种质。

[0005] 如果将柱头外露与单性结实性状连锁还可以具有较好的应用前景，比如，通过肉眼识别就可判断番茄的基因型，省去了分子检测步骤。是作为很好的形态标记。

[0006] 参考文献：

[0007] Maaike de Jong,MiekeWolters‑Arts,Richard Feron,CelestinaMariani and Wim H.Vriezen.The Solanumlycopersicumauxin response factor 7(SlARF7)regulates 
auxin signaling during tomato fruit set and development.The Plant Journal
(2009)57,160–170。

[0008] RisaUeta,Chihiro Abe,Takahito Watanabe,Shigeo S.Sugano,Ryosuke Ishihara,Hiroshi Ezura,Yuriko Osakabe,Keishi Osakabe.Rapid breeding of 
parthenocarpic tomato plants using CRISPR/Cas9.Scientific Reports,(2017)7:
507.DOI:10.1038/s41598‑017‑00501‑4。

[0009] LDeng,H Wang,etal.,2017.Efficient generationof pink‑fruited tomatoes using CRISPR/Cas9 system.Journal of Genetics and Genomics.1‑4.doi.org/
10.1016/j.jgg.2017.10.002.

发明内容

[0010] 本发明通过CRISPR/Cas9技术敲除SlAGL6基因获得了一种柱头外露的单性结实突变体。

[0011] 较为具体地，本发明第一方面提供了一种具有柱头外露性状的单性结实番茄的制备方法，

[0012] 所述方法为敲除番茄基因SlAGL6。

[0013] 在一些实施方式中，所述番茄种质为：TB0993。

[0014] 在一些实施方式中，所述番茄基因SlAGL6的GenBank登录号为：NM_001361530.1。

[0015] 在一些实施方式中，所述方法为将敲除所述番茄基因SlAGL6的番茄突变体制备成突变纯合体。

[0016] 在一些实施方式中，所述方法为敲除番茄基因SlAGL6的第一外显子。

[0017] 在一些实施方式中，所述方法为将所述番茄基因SlAGL6的蛋白序列突变成如SEQ ID NO.4所示的蛋白序列。

[0018] 在一些实施方式中，敲除所述番茄基因SlAGL6是使用CRISPR/Cas9系统实现的。

[0019] 在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9系统中表达sgRNA的载体中靶序列如SEQ ID NO.1所示。

[0020] 本发明第二方面提供了一种用于实现如本发明第一方面所述的制备方法或制备通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的番茄品种的sgRNA。

[0021] 在一些实施方式中，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

[0022] 本发明第三方面提供了一种用于实现如本发明第一方面所述的制备方法或制备通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的番茄品种的表达sgRNA的载体。

[0023] 在一些实施方式中，所述表达sgRNA的载体的靶序列如SEQ ID NO.1所示。

[0024] 本发明第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第三方面所述的sgRNA或本发明第三方面所述的表达sgRNA的载体。

[0025] 本发明第五方面提供了一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0026] 本发明第六方面提供了一种基因，所述基因的编码序列能够编码如本发明第五方面所述的蛋白。

[0027] 在一些实施方式中，所述基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。

[0028] 本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的制备方法、如本发明第二方面所述的sgRNA、如本发明第三方面所述的表达sgRNA的载体、如本发明第四方面所述的试剂盒、如
本发明第五方面所述的蛋白或如本发明第六方面所述的基因在构建番茄杂交制种中的用
途。

[0029] 相比现有技术，本发明的有益效果如下：

[0030] 1、本发明通过CRISPR/Cas9敲除SlAGL6基因创制出番茄稳定的单性结实材料，无不良农艺性状连锁，同时还表现为柱头外露，是一种新型的单性结实突变材料。突变材料杂
交制种时，不用再跟长柱头性状进行聚合，可直接应用于制种，省去人工去雄工序。另外，由
于单性结实和柱头外露为单一基因突变导致，大大简化了向新材料的转育过程，有利于在
制种上的广泛应用。

[0031] 2、本发明的应用前景潜力巨大：本发明通过CRISPR/Cas9敲除了番茄SlAGL6基因获得新型单性结实番茄材料，一方面在不影响其它商品特性的条件下表现出不受环境条件
影响的单性结实特性，安全、优质、高产，在商品果生产中具有广泛应用前景；另一方面，兼
具单性结实和长柱头特性可直接应用于杂交制种，省去人工去雄工序，大大降低制种成本。
同时由于柱头外露的性状只受单基因控制，将此优良性状通过回交转育到新的遗传背景材
料将变得简单高效，有利于制种中的广泛应用。

附图说明

[0032] 图1为本发明的SlAGL6基因上的CRISPR/Cas9敲除靶点序列Guide2和Guide7示意图。

[0033] 图2为CRISPR/Cas9敲除SlAGL6基因靶点序列Guide2和Guide7获得的突变体序列示意图。

[0034] 图3为SlAGL6基因敲除株#1‑6与野生型植株西红柿切面照片对照，其中左图为野生型，右图为敲除株#1‑6。

[0035] 图4为CRISPR/Cas9敲除SlAGL6基因获得的突变体材料#1‑6(右)相比对照(左)表现出明显的单性结实现象，坐果率高，并且柱头明显外露。A显示出野生型材料TB0993花及
柱头形态，B显示出突变体材料#1‑6花及柱头形态，C为野生型材料TB0993逆境下座果率低，
D显示出突变体材料#1‑6逆境下座果率高，E显示TB0993自交果实内种子产生情况(左)，#1‑
6人工强制授粉后果实内产生种子情况(右)。

[0036] 图5为#1‑6突变株花不同时期对照照片。

[0037] 图6为SlAGL6基因敲除株#1‑6与野生型植株花蕊形态对照照片，其中左图为野生型，右图为敲除株#1‑6。

[0038] 图7为#1‑6突变株推测的突变AGL6蛋白序列与野生型对比图。

具体实施方式

[0039] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

[0040] 1.番茄材料

[0041] 所用番茄品种TB0993。TB0993由2009年荷兰纽内姆公司的杂交品种群体BF001，经8代定向纯化系统选育(单株法选择具有抗番茄黄化曲叶病毒病Ty1和Ty3a位点、座果率高
植株)而成的粉果番茄优良自交系。本发明对TB0993番茄进行了全基因组测序，测序由北京
天一辉远生物科技有限公司公司完成，测序结果未公开。

[0042] 2.基因简介

[0043] 本发明敲除涉及番茄基因SlAGL6，GenBank号为：NM_001361530.1。包括8个外显子，成熟mRNA序列包括1070个核苷酸(其中178‑936共759个核苷酸为编码序列)，蛋白包括
252个氨基酸残基。

[0044] 3.基因敲除系统载体简介

[0045] 载体为CRISPR/Cas9双载体系统PTX041，由中国科学院遗传与发育生物学研究所李传友实验室馈赠。其中用番茄U6启动子表达sgRNA,用2×CaMV 35S启动子表达玉米密码
子优化的Cas9。载体系统具体特性请参考Deng et al.(2017)。

[0046] 4.敲除靶点选择与重组PTX041载体的构建

[0047] 敲除靶点序列在SlAGL6基因上的位置与序列参见图1。

[0048] (1)在SlAGL6基因第一和第二外显子分别选一个靶点，依次分别称为Guide7和Guide2,序列参见图1中Target所示序列，Guide2及Guide7前后加上接头(大写字母的为靶
序列，小写的为接头序列，含有Bal1酶切位点以及pCBC‑DT1T2_tomatoU6载体序列，便于PCR
扩增以及后续的酶切连接)形成引物对：

[0049] Guide2F：atatatggtctcgtttgACAACGTTGGTACCTCTCAAgttttagagctagaaatagc

[0050] Guide7R：attattggtctcgaaacTGCACTACCAAACTCATAGA ccaaactacactgttagattc；

[0051] 其中，针对第一外显子的靶序列为：ACAACGTTGGTACCTCTCAA，如SEQ ID NO.1所示，针对第二外显子的靶序列为：TCTATGAGTTTGGTAGTGCA，如SEQ ID NO.2所示。

[0052] (2)将上述引物Guide2F和Guide7R以质粒pCBC‑DT1T2_tomatoU6为模板进行PCR扩增，以便使得到的扩增产物中同时包含针对Guide2及Guide7两个靶点的序列，当该序列在
靶细胞中表达后，能够表达同时敲除两个靶点，以便提高敲除效率。因此可同时造成双突
变。扩增产物的序列为(黑色斜体下划线为靶点或其反向互补序列)：

[0053]

[0054] (3)将扩增产物和PTX‑041载体(双启动子表达载体，可同时转录两个独立的sgRNA,Deng et al.2017)同时用BSaI酶切并用T4连接酶连接，形成连接产物，称作PTX‑
GUIDE2,7。该重组载体包含两个靶点，两个启动子，可同时转录两个独立的sgRNA。该重组载
体还同时转录Cas9。扩增产物和PTX‑041载体用BSa1切除后，用T4连接酶连接酶切后的片
段，形成了连接产物PTX‑GUIDE2,7。

[0055] (4)将PTX‑GUIDE2,7转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞，挑取单菌落，于含50mg/L卡那霉素(Kan)的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。用引物TST1：
CACACAGGAAACAGCTATGACC进行测序验证阳性克隆，提取阳性质粒转化农杆菌AGL0。

[0056] (5)利用“叶盘法”通过AGL0农杆菌侵染普通番茄子叶，分别获得转化PTX‑GUIDE2,7敲除载体涉载体的抗性芽系，移栽后获得相应植株。

[0057] 5.转化植株的验证

[0058] 针对第二外显子基因敲除植株SlAGL6基因突变情况检测的引物为：

[0059] 上游引物Pu2：TCTCTCCTTAATCGTGTCAC；

[0060] 下游引物Pd2：GATCTTCACCAAGCAAGTGC

[0061] 针对第一外显子基因敲除植株SlAGL6基因突变情况检测的引物为：

[0062] 上游引物Pu7：AGTGGAACTAAAGAGAATAGAG；

[0063] 下游引物Pd7：CCATACAAAGTAAACTTGACAC。

[0064] 使用DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒，货号为:DP350‑03)提取植株基因组DNA。

[0065] 使用Takara公司Takara PrimerSTAR Max DNA聚合酶以及引物Pu2、Pd2以及Pu7、Pd7对基因组DNA进行PCR扩增。反应条件为98℃30s；98℃15s,60℃15s,72℃30s,进行30个
循环；72℃5min。

[0066] 对PCR产物进行测序(交给北京天一辉远生物科技有限公司公司进行的测序)，对多个突变株中SlAGL6基因进行测序拼接。

[0067] 最终发现突变株#1‑6中SlAGL6第一和第二外显子均发生了突变，突变结果参见图2。突变后的编码序列和氨基酸序列分别如下：

[0068] #1‑6编码序列突变后的核酸序列为:

[0069] ATGGGGAGAGGGAGAGTGGAACTAAAGAGAATAGAGAACAAAATCAACCGTCAAGTGACATTTTCTAAGAGGAGGAATGGTTTGTTGAAGAAAGCTTATGAATTATCAGTGCTTTGTGAGGCTGAAGTTGCTCTCATCATCTTCTC
TAGTCGTGGAAAGCTCTATGAGTTTGGTATATATCACTAAAACCCTTGAGAGGTGAGAGGGTGCCTTAATCCTCAAG
ACAATTGTGGTGAAAGAGAAACACAGAGCTGGTACCAAGAGGTCTCTAAATTAAAGGCCAAGTTTGAAGCACTTCAA
CGAACTCAAAGGCACTTGCTTGGTGAAGATCTTGGAGCACTAAGTGTGAAGGAGTTGCAAAATCTTGAAAAACAACT
TGAAGGTGCACTTGCACAAGCTAGACAAAGAAAGACACAAATAATGATGGAACAGATGGAGGAGCTTCGTAGAAAGG
AGCGTCATCTTGGTGATGTGAACAAGCAGTTGAAGATTAAGGTTTCTCTTGAACTATCATCGTTTGAGGGTGAAGGA
CAAGGTGTTCCTTTTCCATGGAGTAATTGTAATGCATCTTTAGATGAAGCAGGAAGCAGCACCTTTCATGTCCACCA
TTCTCAATCAAATCACATGGACTGTGATTTACCTGATCCAGTTCTTCAAATAGGGTATCATCAGTATATGGCTGCAG
ATGGAGCCTCAGGGTCAAGGAACATGGCTGTTGAGAGTAACATTATCCATGGTTGGGGTCTTTAA

[0070] 其中#1‑6编码序列突变后截短的编码序列为(SEQ ID NO.3)：

[0071] ATGGGGAGAGGGAGAGTGGAACTAAAGAGAATAGAGAACAAAATCAACCGTCAAGTGACATTTTCTAAGAGGAGGAATGGTTTGTTGAAGAAAGCTTATGAATTATCAGTGCTTTGTGAGGCTGAAGTTGCTCTCATCATCTTCTC
TAGTCGTGGAAAGCTCTATGAGTTTGGTATATATCACTAA

[0072] #1‑6突变后的蛋白质序列为(SEQ ID NO.4):

[0073] MGRGRVELKRIENKINRQVTFSKRRNGLLKKAYELSVLCEAEVALIIFSSRGKLYEFGIYH*

[0074] #1‑6突变体与野生型植株TB0993氨基酸序列比对图谱参见图7。

[0075] 6.敲除植株的表征

[0076] 对照野生型材料TB0993,#1‑6突变株在表型上的差别，条件1为7‑10月份，北京四季青设施栽培，进行高温胁迫，温度为35‑38℃，每天持续约4小时，持续约50天。条件2为9月
份到次年1月份，北京蔬菜中心设施栽培，白天平均温度为25.8℃，夜间平均温度为13.6度，
持续约145天，其他栽培管理条件基本一致，均为常规操作，样本量为3，记录平均值。该两株
番茄的生产性状具体参见表1。

[0077] 表1野生型材料TB0993与突变体#1‑6番茄性状对照

[0078]

[0079] 通过表1的数据可以看出，相比对照，#1‑6突变株在高温逆境条件下无种子产生，常温条件下只有极少量种子产生，具有稳定和较强的单性结实特性；另外，突变体材料#1‑6
座果率相比野生型材料明显增加(尤其高温逆境条件下)，单果重也略有增加。其他农艺性
状与野生型材料相比未发现明显变化。

[0080] 野生型材料TB0993与#1‑6突变株番茄纵切面参见图4，其中，左侧为野生型材料TB0993番茄，右侧为#1‑6突变株番茄，由此可见，#1‑6突变株番茄未产生可见的种子。突变
体花粉和柱头发育正常，人工强制自交授粉可产生种子。

[0081] 本发明创制的突变体#1‑6还获得一种新的表型：雄蕊柱头由野生型材料的被花药筒包被形态变为明显外露形态。形态见图4，其中A为野生型材料TB0993花及柱头形态，B为
突变体材料#1‑6花及柱头形态，C为野生型材料TB0993逆境下座果率低，D为突变体材料1‑6
逆境下座果率高。#1‑6突变株番茄不同发育时期花蕊长度与柱头外露长度照片参见图5，相
应统计数据参见表2，其中样本量为15，图5为典型花朵照片，表2中数据取平均值。

[0082] 花朵局部对照参见图6，其中左侧是野生型的照片，右侧是突变体#1‑6的照片，从中可以看出，野生型未见柱头，而突变体#1‑6可见明显的外露柱头。

[0083] 表2不同发育时期雄蕊及雌蕊长度变化(北京蔬菜中心农场)

[0084]

[0085] 7.潜在脱靶位点分析

[0086] 根据Guide2和Guide7靶点序列对TB0993全基因组序列进行Blast搜索,同时结合网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html对脱靶位点进行评估。
进一步筛选出Guide2潜在的5个脱靶位点(1‑5)，其中4个序列位点位于基因间区，一个位于
基因编码区。Guide7潜在的5个脱靶位点，其中4个序列位点位于基因编码区，一个位于基因
间区。在10个潜在脱靶位点序列上下游设计引物，PCR扩增后由北京天一辉远生物科技有限
公司测序，通过与野生型基因序列比对发现，#1‑6突变体这些位点未发生序列突变。测序的
靶点序列依次如下，其中方框所示序列为潜在脱靶位点，下划线所示序列为PCR扩增设计引
物的序列，发现#1‑6突变体这些位点未发生序列突变。

[0087] (1)基因间区

[0088]

[0089]

[0090] (2)基因间区

[0091]

[0092] (3)基因间区

[0093]

[0094] (4)基因间区

[0095]

[0096] (5)编码区(SL2.50ch09:62242561..62241743，Solyc09g064820.1)

[0097]

[0098] (6)编码区(SL2.50 ch06:8517491..8513696，Solyc06g011660.1)

[0099]

[0100]

[0101] (7)编码区(SL2.50 ch06:31449108..31446789，Solyc06g048680.1)

[0102]

[0103] (8)编码区(SL2.50 ch12:48723737..48725352，Solyc12g038220.1)

[0104]

[0105] (9)编码区(SL2.50 ch12:48723737..48725352 Solyc01g058360.1)

[0106]

[0107] (10)基因间区

[0108]

[0109]

[0110] 8.自交与杂交

[0111] 将#1‑6突变株的花蕾期去雄，并收集其自身产生的花粉进行授粉，发现#1‑6突变株人工强制自交授粉可产生种子，且与TB0993自交产生的种子差别不明显。这表明#1‑6突
变株花粉和柱头功能均正常，二者差别不明显。因此，该突变株可实现自交留种扩繁，也可
用于与其他番茄株系杂交组配制备杂交种。

[0112] 亲本TB0993自交后果实内种子产生情况参见图4中E的左图。#1‑6突变株通过人工强制授粉后果实内种子产生情况参见图4中E的右图。

[0113] 9.雄性不育与制种应用

[0114] 本专利获得的突变体#1‑6几乎无任何种子产生，不同环境下单性结实特性稳定，且无不良性状连锁。符合杂交育种中雄性不育株的要求，由此认为可以作为母本应用于杂
交种子生产。其自身花粉和柱头功能正常，可自交繁殖，这与其他现有的番茄雄性不育材料
需要与保持系杂交来保持不育特性相比，不育系自身种子扩繁更为简单高效。尤其与单性
结实连锁的柱头外露特性，不仅可以省去杂交制种中的人工去雄工序，大大节省制种时间
和成本，还可以作为形态标记直接通过肉眼对单性结实突变株进行筛选鉴定，省去分子标
记鉴定过程。进一步提高了杂交制种效率。

[0115] 由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所
有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。