新型LL-D49194α1类似物，及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种LL‑D49194α1类似物，及其制法制备方法和应用。具体地，本发明提供了去糖基化和去甲基化的LL‑D49194α1类似物。所获得的LL‑D49194α1类似物具有相较于LL‑D49194α1更好的抗肿瘤活性。

权利要求

1.一种酒红土褐链霉菌NRRL15735(Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735)的突变菌株，其特征在于，所述的突变菌种中，LL-D49194α1生物合成基因簇中选自下组的一个基因被失活敲除：细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10、糖基转移酶基因lldB3，或细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2；

其中，所述突变菌种通过以下制备方法制得，所述制备方法：构建同框敲除质粒，将带筛选抗性的质粒导入野生型菌株，通过质粒上带有的同源臂片段与野生型菌株基因组同源片段发生重组，从而从基因组中替代相应的细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10、糖基转移酶基因lldB3，或细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2，从而获得基因同框敲除或缺失的突变株；

其中，所述同源臂片段用以下正向引物和反向引物扩增获得：(i)用于失活敲除细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10的引物lldO10左臂正向引物：5’-ATAGAATTCACGAGGGTGCGGTCGTCT-3’lldO10左臂反向引物：5’-ATATCTAGAATCGGCGACCAGGGCCTC-3’；

lldO10右臂正向引物：5’-ATATCTAGACAACGCCTGCCGGTCCGGTTC-3’lldO10右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTACGTTCGCGCTGCCCCGGTTC-3’(ii)用于失活敲除糖基转移酶基因lldB3的引物

lldB3左臂正向引物：5’-ATAGAATTCCCTGTTCCAGCTCCGCCTGG-3’lldB3左臂反向引物：5’-ATATCTAGAACCCTGGAGAGGCTCACCGC-3’lldB3右臂正向引物：5’-ATATCTAGAGTGAGCCTGGACGGGCCACA-3’lldB3右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTGGAGCAGCCGCCTCATCAAG-3’(iii)用于失活敲除细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2的引物lldO2左臂正向引物：5’-ATAGAATTCCGCCGGCGTCTGCGGCCA-3’lldO2左臂反向引物：5’-ATATCTAGAGGTGTCGACCTCAGTGGCCAT-3’lldO2右臂正向引物：5’-ATATCTAGACCGGTCCGGATCCGCTGAC-3’lldO2右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTCGTGCCGGACGGCCCCGA-3’。

2.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10被失活敲除。

3.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，糖基转移酶基因lldB3被失活敲除。

4.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2被失活敲除。

5.一种制备LL-D49194α1类似物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，包括步骤：(a)对权利要求1所述的突变菌种进行发酵，得到发酵产物；和(b)从发酵产物中分离出所述的LL-D49194α1类似物，和任选的步骤(c)将所述LL-D49194α1类似物转化为其药学上可接受的盐；

其中，所述LL-D49194α1类似物具有选自下组式Ia、Ib或Ic所示的结构：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵为液体摇瓶发酵。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵包括：对所述菌株进行一级培养，得到发酵种子培养液，然后接种至发酵培养基中进行二级培养。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的二级培养还包括：菌株进入稳定生长期后，添加2％-3％大孔树脂HP20共培养并进行进一步发酵，从而获得LL-D49194α1类似物。

说明书

新型LL-D49194α1类似物，及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术工程领域和药物领域，具体地，本发明涉及一类新型LL-D49194α1类似物及其制法和应用。

背景技术

[0002] 蒽环类抗生素拥有一个蒽环骨架，还包括甲基化、糖基修饰、羟化和其他一些特殊修饰。蒽环类抗生素临床上主要被用于治疗白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等。

[0003] LL-D49194s，是一类具有蒽醌骨架的聚酮类化合物，含氧三元螺环是其结构中的活性单元，能抑制DNA和RNA的合成。早期在对LL-D49194α1分离时，还得到了其余LL-D49194α1类似物，包括LL-D49194β1、LL-D49194β2等，尤以LL-D49194α1产量最高，活性最好，早期药学研究也多以LL-D49194α1为主要研究目标。LL-D49194类化合物多具有良好的抗革兰氏阳性菌活性，癌细胞抑制能力与顺铂相当或更好，相对细胞毒性也更低。

[0004] 大多数蒽环类抗生素主要是边链糖基结构存在差别，而针对蒽环骨架的改造研究则较少。为了提高LL-D49194α1的抗肿瘤活性以及其他特性，本领域一直在尝试改造蒽环骨架从而得到LL-D49194α1的类似物或衍生物，然而迄今为止尚未开发出具有更高活性等优点的LL-D49194α1类似物。因此，本领域迫切需要开发各类新型的LL-D49194α1类似物。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一类具有更高活性的新型LL-D49194α1类似物。

[0006] 本发明的另一目的是提供所述的LL-D49194α1类似物的制法和应用。

[0007] 在本发明的第一方面，提供了一种新型LL-D49194α1类似物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物的结构如式I所示：

[0008]

[0009] 式I中，R1选自：H、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基；

[0010] R2选自：H、羟基、C1-4烷氧基、

[0011] R3选自下组：H、C1-4烷基。

[0012] 在另一优选例中，所述R1选自：H、羟基、C1-4烷氧基；所述R2选自：H、羟基、[0013] 在另一优选例中，所述化合物具有选自下组式Ia、Ib或Ic所示的结构：

[0014]

[0015] 本发明第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明第一方面任一所述的LL-D49194α1类似物，或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。

[0016] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于治疗肿瘤；较佳地，所述的肿瘤选自下组：白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌。

[0017] 本发明的第三方面，提供了一种可用于产生如本发明第一方面所述的LL-D49194α1类似物的酒红土褐链霉菌(Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735)突变菌株，其特征在于，所述的菌种中，LL-D49194α1生物合成基因簇中选自下组的一个基因被失活敲除：
细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO10)、糖基转移酶基因(lldB3)，或细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO2)。

[0018] 在另一优选例中，所述的突变菌株为lldO10、lldB3或lldO2同框缺失的重组菌株。

[0019] 本发明第四方面，一种制备如本发明第一方面所述的LL-D49194α1类似物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括步骤：

[0020] (a)对本发明第三方面所述菌株进行发酵，得到发酵产物；和

[0021] (b)从发酵产物中分离出所述的LL-D49194α1类似物，和任选的步骤(c)[0022] (c)将所述化合物转化为其药学上可接受的盐。

[0023] 在另一优选例中，所述的步骤(b)包括：

[0024] (b1)对发酵产物离心弃上清，得到菌体和HP20吸附树脂混合物；

[0025] (b2)用有机溶剂浸泡所述的混合物，离心取上清；

[0026] (b3)对所述的上清液经减压蒸馏抽干，获得膏状物；

[0027] (b4)对所述的膏状物用预装的200-300目硅胶柱进行柱层析，收集包含目标化合物的流出液，然后用HPLC纯化得到目标产物。

[0028] 在另一优选例中，所述柱层析的洗脱液选自下组：二氯甲烷：甲醇＝75-50：1(v/v)、二氯甲烷：甲醇＝20-10：1(v/v)、二氯甲烷：甲醇＝30-20：1(v/v)。

[0029] 在另一优选例中，当所述的突变菌株为lldO10缺失的重组菌株时，所述的LL-D49194α1类似物为式Ia化合物。

[0030] 在另一优选例中，当所述的突变菌株为lldB3缺失的重组菌株时，所述的LL-D49194α1类似物为式Ib化合物。

[0031] 在另一优选例中，当所述的突变菌株为lldO2缺失的重组菌株时，所述的LL-D49194α1类似物为式Ic化合物。

[0032] 在另一优选例中，所述的发酵为液体摇瓶发酵。

[0033] 在另一优选例中，所述的发酵包括：对所述菌株进行一级培养，得到发酵种子培养液，然后接种至发酵培养基中进行二级培养。

[0034] 在另一优选例中，所述的接种量为5％-10％，以发酵培养基的体积计。

[0035] 在另一优选例中，所述的二级培养还包括：菌株进入稳定生长期后，添加2％-3％大孔树脂HP20共培养并进行进一步发酵，从而获得LL-D49194α1类似物。

[0036] 在另一优选例中，所述的一级培养在无抗的TSB培养瓶中进行。

[0037] 本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的LL-D49194α1类似物或其药学上可接受的盐作为抗肿瘤药物的应用。

[0038] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0039] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

[0040] 图1为酒红土褐链霉菌Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735同框敲除突变株的电泳结果。图1i为sDL05030敲除突变株；图1ii中为sDL05021敲除突变株；图1iii中为sDL05027敲除突变株。

[0041] 图2为LL-D49194α2的1H NMR(600MHz，CDCl3)。

[0042] 图3为LL-D49194α2的13C NMR(600MHz，CDCl3)。

[0043] 图4为LL-D49194α2的COSY(600MHz，CDCl3)。

[0044] 图5为LL-D49194α2的HSQC(600MHz，CDCl3)。

[0045] 图6为LL-D49194α2的HMBC(600MHz，CDCl3)。

[0046] 图7为LL-D49194α2的NOESY(600MHz，CDCl3)。

[0047] 图8为LL-D49194α3的1H NMR(600MHz，CDCl3)。

[0048] 图9为LL-D49194α3的13C NMR(600MHz，CDCl3)。

[0049] 图10为LL-D49194α3的COSY(600MHz，CDCl3)。

[0050] 图11为LL-D49194α3的HSQC(600MHz，CDCl3)。

[0051] 图12为LL-D49194α3的HMBC(600MHz，CDCl3)。

[0052] 图13为LL-D49194α3的NOESY(600MHz，CDCl3)。

[0053] 图14为LL-D49194α4的1H NMR(600MHz，CDCl3)。

[0054] 图15为LL-D49194α4的13C NMR(600MHz，CDCl3)。

[0055] 图16为LL-D49194α4的COSY(600MHz，CDCl3)。

[0056] 图17为LL-D49194α4的HSQC(600MHz，CDCl3)。

[0057] 图18为LL-D49194α4的HMBC(600MHz，CDCl3)。

[0058] 图19为LL-D49194α4的NOESY(600MHz，CDCl3)。

[0059] 图20表示对突变株进行发酵条件优化获得新型LL-D49194α1类似物的HPLC分析结果，其中，图20i为野生型Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的发酵结果；图20ii为突变株sDL05030的发酵结果，sDL05030是产生LL-D49194α2的菌株；图20iii为突变株sDL05021的发酵结果，sDL05021是产生LL-D49194α3的菌株；图20iv为突变株sDL05027的发酵结果，sDL05027是产生LL-D49194α4的菌株。

[0060] 符号说明

[0061] 式Ia中A、B、C、D、E、F代表环的编号，C环即代表编号为C的环，数字1、2、3、4代表化合物碳骨架的编号顺序，C-2位即代表编号为2的碳原子。

[0062] 具体实施方法

[0063] 本发明人通过对LL-D49194α1生物合成机制进行研究，利用构建基因同框缺失突变株的方法，意外地发现，当对缺失了细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO10)、或糖基转移酶基因(lldB3)或细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO2)的突变株进行液体发酵时，分别制备得到C环C-2位去羟基化，C-4位还原的LL-D49194α1类似物LL-D49194α2、LL-D49194α3、LL-D49194α4，通过抗HL-60和B16-F10肿瘤细胞活性实验发现抑制活性提高了2-4倍。在此基础上完成了本发明。

[0064] 活性成分

[0065] 如本文所用，术语“本发明化合物”、“本发明的活性成分”、“本发明的类似物”和“本发明的LL-D49194α1类似物”可以互换使用，都指LL-D49194α1类似物，如式Ia所示的LL-D49194α2、Ib所示的LL-D49194α3和Ic所示LL-D49194α4。

[0066] 应理解，所述术语还意在包括本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

[0067] 在本发明优选的实施方式中，术语“C1-4烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团；术语C1-4烷氧基指甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙基氧基、或类似基团；术语“卤素”指F、Cl、Br和I。

[0068] 一类优选的LL-D49194α1类似物具有下式I所示的化学结构式：

[0069]

[0070] 如本文所用，术语“LL-D 49194α2”，其化学结构式如式Ia所示。

[0071] 如本文所用，术语“LL-D 49194α3”，其化学结构式如式Ib所示。

[0072] 如本文所用，术语“LL-D 49194α4”，其化学结构式如式Ic所示。

[0073] 如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明中化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。

[0074] 本发明人不仅通过对新型LL-D49194α1类似物的发酵、分离纯化和结构解析，确证了化合物的结构。此外，还通过肿瘤细胞抑制实验证实了，本发明的LL-D49194α1类似物比LL-D49194α1天然产物的肿瘤细胞抑制能力有显著提高。

[0075] 菌株

[0076] 如本文所用，术语“本发明出发菌株”指的是酒红土褐链霉菌Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735。应理解，出发菌株不仅包括酒红土褐链霉菌Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的菌株，还包括其衍生菌株及其他产LL-D49194α1的菌株。

[0077] 在本发明的一个优选例中，提供了一种生产本发明LL-D49194α1类似物的酒红土褐链霉菌Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的突变菌株，其中，所述的菌株中LL-D49194α1生物合成基因簇中的细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO10)、或糖基转移酶基因(lldB3)或细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO2)被失活敲除。

[0078] 本发明还提供了一种构建可产生LL-D49194α1类似物突变株的方法，它包括同框敲除质粒的构建，将带筛选抗性的质粒导入野生型菌株，通过质粒上带有的同源臂片段与野生型菌株基因组同源片段发生重组，从而从基因组中替代相应基因，从而获得基因同框敲除或缺失的突变株。缺失LL-D49194α1生物合成基因簇中的细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO10)、或糖基转移酶基因(lldB3)或细胞色素P450氧化还原酶基因(lldO2)的突变株无法正常合成LL-D49194α1。

[0079] 在本发明的一个优选例中，提供了一种构建突变株，并发酵突变株制备LL-D49194α1类似物的方法，其中包括：

[0080] 1.构建lldO10、lldB3和lldO2同框缺失质粒

[0081] PCR分别扩增用于基因敲除lldO10、lldB3和lldO2基因的左臂和右臂片段，将左、右臂两个片段连入温敏型穿梭质粒pKC1139中(US5,955,319)，获得重组质粒。分别将重组质粒转化至E.coli DH5α中，挑取单克隆菌落扩增培养，然后将验证正确的质粒分别转化至E.coli S17-1中。

[0082] 2.制备重组菌株

[0083] 收集野生型的Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的新鲜孢子，用TES缓冲溶液清洗三次。清洗后的孢子重悬于500uL TES缓冲液中，放置于50℃水浴锅中热激10分钟。热激后的孢子转移至37℃萌发4小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4培养基平板上按照一定比例混合涂抹，并30℃中培养16小时后用安普霉素覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选单克隆接合子到安普霉素抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于无抗TSB培养溶液中传代8次以上，再于IWL-4培养基平板上划线筛选单菌落。通过安普霉素抗性筛选，选取不具有安普霉素抗性的菌株进行基因型PCR验证以获得lldO10、lldB3和lldO2同框缺失的重组菌株。

[0084] 3.优化液体发酵方案

[0085] 本发明提供了一种针对LL-D49194α1及其类似物产生菌株的培养方案，采用液体摇瓶的方式进行发酵，同时从通氧量、温度、接种量等方面进行优化，采用一级种子发酵方式，先在无抗的TSB培养瓶中培养36小时制备得到发酵种子培养液，再接种5％-10％(以发酵培养基的体积计)至发酵培养基中，在2-3天菌株进行稳定生长期后，添加2％-3％大孔树脂HP20共培养，发酵6天可以稳定的获得LL-D49194α1及其类似物。

[0086] 4.活性成分的制备

[0087] 本发明还提供了一种制备式I化合物的方法，包括步骤：离心弃去上清得到菌体和HP20吸附树脂混合物，2倍体积丙酮浸泡菌体和HP20吸附树脂后，离心取上清，将上清液经减压蒸馏抽干后，获得的膏状物先用预装的200-300目硅胶柱进行粗分，再用HPLC进一步制备纯化，收集包含式I化合物的流出液并抽干，最终得到目标产物。

[0088] 本发明人不仅通过对式I化合物的大量发酵以及分离纯化确证了化合物的结构，而且通过肿瘤细胞抑制实验证实了本发明的活性产物比LL-D49194α1的肿瘤细胞抑制能力有显著的提高。

[0089] 本发明的主要优点包括：

[0090] (a)提供了一种具有式I结构的新颖的、具有更高活性等优点的LL-D49194α1类似物。

[0091] (b)以本发明的LL-D49194α1类似物为基础，有助于制备其他蒽环类抗生素衍生物。

[0092] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本发明的内容。

[0093] 实施例1.突变菌株sDL05030、sDL05021和sDL05027的构建

[0094] 1.构建lldO10、lldB3和lldO2基因的缺失质粒

[0095] 克隆lldO10同框缺失左臂的引物序列如下：

[0096] lldO10左臂正向引物(SEQ ID NO:1)

[0097] 5’-ATAGAATTCACGAGGGTGCGGTCGTCT-3’

[0098] lldO10左臂反向引物(SEQ ID NO:2)

[0099] 5’-ATATCTAGAATCGGCGACCAGGGCCTC-3’

[0100] 克隆lldO10同框缺失右臂的引物序列如下：

[0101] lldO10右臂正向引物(SEQ ID NO:3)

[0102] 5’-ATATCTAGACAACGCCTGCCGGTCCGGTTC-3’

[0103] lldO10右臂反向引物(SEQ ID NO:4)

[0104] 5’-ATAAAGCTTACGTTCGCGCTGCCCCGGTTC-3’

[0105] 克隆lldB3同框缺失左臂的引物序列如下：

[0106] lldB3左臂正向引物(SEQ ID NO:5)

[0107] 5’-ATAGAATTCCCTGTTCCAGCTCCGCCTGG-3’

[0108] lldB3左臂反向引物(SEQ ID NO:6)

[0109] 5’-ATATCTAGAACCCTGGAGAGGCTCACCGC-3’

[0110] 克隆lldB3同框缺失右臂的引物序列如下：

[0111] lldB3右臂正向引物(SEQ ID NO:7)

[0112] 5’-ATATCTAGAGTGAGCCTGGACGGGCCACA-3’

[0113] lldB3右臂反向引物(SEQ ID NO:8)

[0114] 5’-ATAAAGCTTGGAGCAGCCGCCTCATCAAG-3’

[0115] 克隆lldO2同框缺失左臂的引物序列如下：

[0116] lldO2左臂正向引物(SEQ ID NO:9)

[0117] 5’-ATAGAATTCCGCCGGCGTCTGCGGCCA-3’

[0118] lldO2左臂反向引物(SEQ ID NO:10)

[0119] 5’-ATATCTAGAGGTGTCGACCTCAGTGGCCAT-3’

[0120] 克隆lldO2同框缺失右臂的引物序列如下：

[0121] lldO2右臂正向引物(SEQ ID NO:11)

[0122] 5’-ATATCTAGACCGGTCCGGATCCGCTGAC-3’

[0123] lldO2右臂反向引物(SEQ ID NO:12)

[0124] 5’-ATAAAGCTTCGTGCCGGACGGCCCCGA-3’

[0125] 以Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的总DNA为模板，以DMSO，dNTP，无酶水，正、反向引物，高保真的KOD DNA聚合酶及缓冲液构成PCR反应体系，分别扩增用于lldO10、lldB3和lldO2基因敲除的左臂和右臂片段。将克隆后的左、右臂片段进行凝胶电泳分离，切胶回收纯化，分别加入限制性内切酶EcoRI和XbaI以及XbaI和HindIII消化回收片段，将其连入用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切处理过的载体质粒pKC1139中，随后将连接体系转化至E.coli DH5α中，挑取单克隆菌落于LB培养试管(含有安普霉素抗生素)中过夜振荡培养。提取质粒经过酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化至E.coli S17-1中。

[0126] 2.重组菌株sDL05030、sDL05021和sDL05027的获得

[0127] 收集野生型的Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的新鲜孢子，用TES缓冲溶液清洗三次。清洗后的孢子重悬于500uL TES缓冲液中，放置于50℃水浴锅中热激10分钟。热激后的孢子转移至37℃萌发4小时左右，与含有重组质粒的E.coli S17-1在IWL-4培养基平板上按照一定比例混合涂抹，并于30℃中培养16小时后用安普霉素(50μg/mL)覆盖平板。接合子在温箱培养5到7天后长出，挑选单克隆接合子到安普霉素抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于无抗性TSB培养溶液中传代8次以上，再于平板上划线筛选单菌落。通过安普霉素抗性筛选，分别选取不具有安普霉素抗性的菌株进行基因型PCR验证以获得lldO10、lldB3和lldO2基因同框缺失的重组菌株sDL05030、sDL05021和sDL05027。实验结果如图1所示。

[0128] 图1i中为sDL05030敲除突变株的验证结果，从图1i的电泳图可以看出，sDL05030敲除突变株中sDL05030基因缺失了大约1.15kb，说明本实施例中成功地构建了sDL05030敲除突变株。

[0129] 图1ii中为sDL05021敲除突变株的验证结果，从图1ii的电泳图可以看出，sDL05021敲除突变株中sDL05021基因缺失了大约1.16kb，说明本实施例中成功地构建了sDL05021敲除突变株。

[0130] 图1iii中为sDL05027敲除突变株的验证结果，从图1iii的电泳图可以看出，sDL05027敲除突变株中sDL05027基因缺失了大约1.18kb，说明本实施例中成功地构建了sDL05027敲除突变株。

[0131] 实施例2.LL-D49194α1类似物的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定

[0132] 分别将突变株sDL05030、sDL05021和sDL05027接种于100mL种子培养基中振荡培养(含TSB 30g/L)，转速220rpm，温度30℃培养36小时。将5-10mL种子摇瓶菌液接种于100mL发酵培养基中(含可溶性淀粉60g/L，葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁1g/L，碳酸钙2g/L,微量盐溶液0.1mL(1000倍储存液：五水硫酸铜70g/L，七水硫酸亚铁10g/L，四水氯化锰8g/L，七水硫酸锌2g/L，七水氯化钴0.06g/L)，pH＝
7.3±0.2)，30℃，220rpm培养，接种第2-3天后加入HP20树脂(3g/100mL)，继续培养至接种后第6天后处理发酵液。

[0133] 分别对sDL05030、sDL05021和sDL05027发酵液离心收集沉淀，用2倍体积丙酮分两次浸泡沉淀，旋转蒸发仪旋去丙酮，用乙酸乙酯萃取四次，将乙酸乙酯经减压蒸馏抽干得到深褐色膏状物。分别对膏状物进行分离，用200-300目硅胶预装的正相柱进行粗分，梯度洗脱条件见表1。

[0134] 表1

[0135]

[0136] LL-D49194α1类似物LL-D49194α2(式Ia所示结构)通过分离sDL05030发酵产物得到，出现在75：1和50：1(二氯甲烷：甲醇)的洗脱部分中。

[0137] LL-D49194α3(式Ib所示结构)通过分离sDL05021发酵产物得到，出现在20：1和10：1(二氯甲烷：甲醇)的洗脱部分中。

[0138] LL-D49194α4(式Ic所示结构)通过分离sDL05027发酵产物得到，出现在30：1和20：1(二氯甲烷：甲醇)的洗脱部分中，收集含有LL-D49194α2、LL-D49194α3和LL-D49194α4的洗脱液并进行减压抽干，溶于3ml甲醇，然后使用HPLC制备化合物纯品。

[0139] HPLC的半制备条件为：

[0140] 仪器：岛津LC-20-AT(日本岛津公司)

[0141] 检测波长：UV＝400nm

[0142] 色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ，C18column,10×250mm，5μM(日本YMC公司)[0143] 流动相：A＝H2O；B＝CH3CN

[0144] 流速：2mL/min

[0145] 流动相梯度配比见表2。

[0146] 表2

[0147]时间(min) A％ B％
0 80 20
5 80 20
20 35 65
21 10 90
24 10 90
26 80 20
30 80 20

[0148] 按上述的HPLC的洗脱条件，分别收集LL-D49194α2、LL-D49194α3和LL-D49194α4的流出液，最终得到目标产物LL-D49194α2、LL-D49194α3和LL-D49194α4。对目标产物LL-D49194α2进行鉴定，核磁归属结果见表3(CD3Cl,600MHz)；对目标产物LL-D49194α3进行鉴定，核磁归属结果见表4(CD3Cl,600MHz)；对目标产物LL-D49194α4进行鉴定，核磁归属结果见表5(CD3Cl,600MHz)。

[0149] 表3

[0150]

[0151] HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为457.1129(C23H21O10计算值为457.1129)。

[0152] 图2、图3、图4、图5、图6和图7分别为LL-D49194α2(式Ia所示结构)的1H NMR(CD3Cl,600MHz)、13C NMR(CD3Cl,600MHz)、COSY(CD3Cl,600MHz)、HSQC(CD3Cl,600MHz)、HMBC(CD3Cl,
600MHz)和NOESY(CD3OD,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了LL-D49194α2(如Ia所示结构)。

[0153] 表4

[0154]

[0155] HR-ESI-MS(m/z)：[M+H]+测量值为487.1235(C24H23O11计算值为487.1235)。

[0156] 图8、图9、图10、图11、图12和图13分别为LL-D49194α3(式Ib所示结构)的1H NMR13
(CD3Cl,600MHz)、C NMR(CD3Cl,600MHz)、COSY(CD3Cl,600MHz)、HSQC(CD3Cl,600MHz)、HMBC(CD3Cl,600MHz)和NOESY(CD3OD,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了LL-D49194α3(如Ib所示结构)。

[0157] 表5

[0158]

[0159] HR-ESI-MS(m/z)：[M+Na]+测量值为811.2786(C39H48O17计算值为811.2784)。

[0160] 图14、图15、图16、图17、图18和图19分别为LL-D49194α4(式Ic所示结构)的1H NMR(CD3Cl,600MHz)、13C NMR(CD3Cl,600MHz)、COSY(CD3Cl,600MHz)、HSQC(CD3Cl,600MHz)、HMBC(CD3Cl,600MHz)和NOESY(CD3OD,600MHz)图谱。结构鉴定表明，本发明人成功制备了LL-D49194α4(如Ic所示结构)。

[0161] 实施例3.出发菌株和改造菌株的发酵产物HPLC分析

[0162] HPLC(图20)的检测条件为：

[0163] 仪器：Dionex Ultimate 3000系统

[0164] 检测波长：UV＝400nm

[0165] 色谱柱：Acclaim  PolarAdvantage  II,C18, 4.6×250mm，5μm,(ThermoScientific公司)；

[0166] 流动相：A＝H2O(含1‰HCOOH)；B＝CH3CN(含1‰HCOOH)

[0167] 流速：1mL/min

[0168] 流动相梯度配比见表6。

[0169] 表6

[0170]时间(min) A％ B％
0 10 90
5 10 90
24 90 10
26 90 10
27 10 90
31 10 90

[0171] 发酵产物分别用HPLC进行分析，结果如下：

[0172] 图20表示对突变株进行发酵条件优化获得新型LL-D49194α1类似物的HPLC分析结果，其中，图20i为野生型Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735的发酵结果；图20ii为突变株sDL05030的HPLC分析，发酵结果表明突变株sDL05030可以产生LL-D49194α2(式Ia所示)；图20iii为突变株sDL05021的HPLC分析，发酵结果表明突变株sDL05021可以产生LL-D49194α3(式Ib所示)；图20iv为突变株sDL05027的HPLC分析，发酵结果表明突变株sDL05027可以产生LL-D49194α4(式Ic所示)。结果表明，野生型菌株能够正常产生LL-D49194α1，突变株不具有合成产生LL-D49194α1的能力，但具有产生LL-D49194α1类似物的能力。

[0173] 实施例4.LL-D49194α1类似物的抗肿瘤活性

[0174] 对LL-D49194α1及其类似物进行抗肿瘤活性的测定，方法如下：将细胞调整浓度至3×104个/mL，100μL/well接种于96孔平底透明细胞培养板中，24小时后分别加入含有不同浓度的药物作用一段适当的时间(例如：24或48小时)。向每孔加入10μl的CCK-8试剂作用2小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度OD值(参考波长630nm)。空白组为无细胞的培养基，对照组为加入与药物同体积的DMSO，计算细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。之后计算出化合物对测定细胞的半抑制浓度IC50。

[0175] 选取HL-60和B16-F10细胞进行肿瘤细胞抑制活性实验，半抑制浓度(IC50)测试结果显示，LL-D49194α1类似物的IC50值比对应的原天然产物LL-D49194α1降低了2-4倍(表7)，这表明，C环C-2位去羟基化，C-4位还原的LL-D49194α1类似物具有更高的抗肿瘤活性，其抑制HL-60和B16-F10细胞的活性比对应的原LL-D49194α1天然产物的活性提高2-4倍。

[0176] 表7

[0177]化合物 IC50(HL60，nM) IC50(B16-F10，nM)
LL-D49194α1 5.45±0.01 23.88±0.09
LL-D49194α2 2.84±0.01 10.05±0.08
LL-D49194α3 3.93±0.01 6.35±0.01
LL-D49194α4 6.32±0.01 8.19±0.02

[0178] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。