一株利迪链霉菌及其在防治火疫病中的应用

摘要

本发明公开了一株利迪链霉菌，其分类命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)，菌株号为M01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月29日，保藏编号为CGMCC No.16840。本发明还公开了上述利迪链霉菌在防治植物火疫病中的应用。本发明的利迪链霉菌对火疫病病原菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)具有显著的拮抗效果，对蔷薇科植物尤其是梨、苹果和海棠等经济作物火疫病具有良好的防治效果，该发明较化学农药对植物病害的防治相比，效果显著，对环境无污染，有利于绿色、无公害产品的生产，是一株应用前景广阔的生防菌株，可用于制备防治火疫病的功能性生防菌剂。

权利要求

1.一株利迪链霉菌在防治植物火疫病中的应用，其中所述的利迪链霉菌，其分类命名为利迪链霉菌（Streptomyces lydicus），菌株号为M01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月29日，保藏编号为CGMCC No. 16840。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述的利迪链霉菌喷洒在植物的病害部位或将其施用于植物的根部土壤中。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的利迪链霉菌为利迪链霉菌发酵液、发酵液上清或发酵液喷雾干燥粉剂中的任意一种或几种的组合。

说明书

一株利迪链霉菌及其在防治火疫病中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于农用微生物技术领域，特别是涉及一株利迪链霉菌及其在火疫病生物防治中的应用。

背景技术

[0002] 解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)是一种具有毁灭性的植物病原细菌，能够侵染梨、苹果和其他蔷薇科40余属的220多种植物引起火疫病，造成严重的经济损失。1780年在美国纽约州首次观察到这种病害，目前已经传播到北美，欧洲，中东以及新西兰等43个国家。梨火疫病影响树木的花、芽、叶、枝和干，其外观像被火烧焦过一样。病原菌首先感染植物鲜花柱头或伤口组织，然后迅速繁殖，引发幼芽、分支和树干溃疡，导致树木死亡。花器被感染后呈萎蔫状，深褐色，并向下蔓延至花柄，使花柄呈水渍状。叶片发病，先从叶缘开始变黑，然后沿叶脉发展，最终全叶变黑、凋萎。病果初生呈水渍状斑，后变暗褐色，并有黄色粘液溢出，最后病果变黑而干缩。枝干被害，初呈水渍状，有明显边缘，后病部凹陷出现溃疡状呈褐色至黑色。梨火疫病被视为最难控制的细菌性病害之一，严重感染可能会杀死一个季节内的全部树木。

[0003] 目前，梨火疫病的防治主要是采用化学药剂链霉素，化学防治尽管能快速消除病原菌，但易造成植株耐药性、污染环境、破坏生态平衡和威胁人畜的健康和安全。因此，寻求绿色、环保的火疫病防治方法是现代农业发展中的一项重要任务。生物防治作为一种绿色安全的防治方法，受到越来越多的关注。

[0004] 利迪链霉菌是近年来备受产业界和学术界关注的一种生防细菌，它习居于土壤和植物根系，能够产生多种抗细菌和真菌活性物质，对多种植物致病菌如镰刀菌(Fusarium)、腐霉菌(Phytium)和丝核菌(Rhizoctonia)等有较好的防治作用。其中最具有代表性的菌株为Streptomyces lydicusWYEC 108，在国外该菌株已被开发成活菌制剂用于防治植物根腐病、腐烂病等病害，2015年丹麦诺维信(Novozymes)公司收购了该技术，并将Streptomyces lydicus WYEC 108开发成生物农药(商品名：Actinovate SP)。在国内，关于利迪链霉菌研究相对较迟，且未有关于其对防治火疫病等细菌性病害的研究与报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一株可用于防治蔷薇科植物火疫病的利迪链霉菌。

[0006] 本发明的另一目的是提供上述利迪链霉菌在防治火疫病害上的应用。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0008] 一株利迪链霉菌，其分类命名为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)，菌株号为M01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月29日，保藏编号为CGMCC No.16840。

[0009] 上述菌株是发明人于2018年3月从南京老山森林公园野生豆梨根系土壤中筛选得到，利迪链霉菌M01表现出对指示菌株：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌、恶臭假单胞菌和枯草芽孢杆菌，以及植物病原细菌：解淀粉欧文氏菌和菠萝泛菌强烈的拮抗作用，具有广谱抗细菌活性。综合利迪链霉菌M01的形态学特征、培养特性和16S rDNA序列分析结果，将其鉴定为利迪链霉菌。具体鉴定结果如下：

[0010] (1)菌体的形态特征

[0011] 革兰氏阳性丝状细菌，具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜。基内菌丝不断裂，气生菌丝发育良好，形成长(有时短)的孢子丝。孢子不能运动，外鞘上常有疣、刺或毛发等状饰物。

[0012] (2)培养特性

[0013] 在ISP-2琼脂培养基上，基内菌丝为黄褐色，气生菌丝为灰白色。

[0014] (3)16S rDNA序列分析

[0015] 利迪链霉菌M01的部分16S rDNA序列如序列表中SEQ ID No.1所示。与Genebank中相关序列Blast比对结果表明其属于链霉菌属，与利迪链霉菌Streptomyces lydicusGS93同源性为99％。

[0016] 上述利迪链霉菌在防治植物火疫病中的应用也在本发明的保护范围之内。

[0017] 其中，所述的植物为蔷薇科植物。

[0018] 其中，所述的蔷薇科植物为梨、苹果或海棠。

[0019] 其中，所述的火疫病由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)引起。

[0020] 具体的应用方式是，将所述的利迪链霉菌喷洒在植物的病害部位或将其施用于植物的根部土壤中。

[0021] 其中，所述的利迪链霉菌为利迪链霉菌发酵液、发酵液上清或发酵液喷雾干燥粉剂中的任意一种或几种的组合。

[0022] 本发明的有益技术效果是：本发明的利迪链霉菌对火疫病病原菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)具有显著的拮抗效果，对蔷薇科植物尤其是梨、苹果和海棠等经济作物火疫病具有良好的防治效果，该发明较化学农药对植物病害的防治相比，效果显著，对环境无污染，有利于绿色、无公害产品的生产，是一株应用前景广阔的生防菌株，可用于制备防治火疫病的功能性生防菌剂。

附图说明

[0023] 图1为本发明的利迪链霉菌M01的菌落形态图；

[0024] 图2为本发明的利迪链霉菌M01培养7天后菌丝图(放大100倍)；

[0025] 图3为本发明的利迪链霉菌M01的16S rDNA的PCR产物电泳图；

[0026] 图4为基于16S rDNA序列的利迪链霉菌M01系统发育树；

[0027] 图5为本发明的利迪链霉菌M01对解淀粉欧文氏菌的平板拮抗实验；

[0028] 图6为利迪链霉菌M01处理对梨花柱头解淀粉欧文氏菌含量的影响图。

具体实施方式

[0029] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

[0030] 以下实施例所采用的培养基具体如下所述：

[0031] 1、改良高氏一号培养基(固体)：硝酸钾1.0g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1L，pH7.2～7.4。

[0032] 2、ISP-2培养基(固体)：麦芽提取物10g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2。

[0033] 3、LB培养基(液体)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，pH 7.4。

[0034] 4、LB培养基(固体)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH 7.4。

[0035] 5、种子培养基(胰蛋白胨大豆肉汤TSB)：麦芽提取物10g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2。

[0036] 6、发酵培养基：葡萄糖20g，可溶性淀粉10g，酵母粉10g，蛋白胨5g，硫酸铵2.5g，七水合硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠5g，碳酸钙4g，蒸馏水定容至1L，pH7.2。

[0037] 实施例1：利迪链霉菌M01的分离与筛选

[0038] 1、从南京老山森林公园野生豆梨根系土壤采样，采用平板稀释涂布法分离放线菌，将风干土样用研钵磨碎，称取10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，于恒温震荡摇床28℃下200rpm/min-震荡30min后静置10min。

[0039] 2、取上述匀浆1mL进行10倍梯度稀释，最终配制成10-3、10-4、10-5的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各100ul加到改良高氏一号培养基平板上，均匀涂布后置于28℃培养，5～7天后挑取不同的单菌落划线纯化。

[0040] 3、以解淀粉欧文氏菌指示菌，采用平板对峙法进行筛选：吸取解淀粉欧文氏菌培养液(约1×107CFU/ml)100μl，并涂布于LB固体培养基平板；并用打孔器在每块平板上打取直径为6mm的圆孔，将上述分离纯化得到的单菌落的菌悬液100μl注入圆孔中，置于28℃培养2天后，观察并测量抑菌圈大小。筛选得到一株抑菌性能优良的菌株，命名为M01。

[0041] 实施例2：利迪链霉菌M01的种属鉴定及生理生化指标测定

[0042] 1、将实施例1得到的菌株M01在ISP-2培养基上划线纯培养后得到其纯培养物(附图1)，革兰氏染色后在显微镜下观察，其属于革兰氏阳性丝状细菌，具有发育良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜。基内菌丝不断裂，气生菌丝发育良好，形成长(有时短)的孢子丝。孢子不能运动，外鞘上常有疣、刺或毛发等状饰物(附图2)。

[0043] 2、测定菌株的形态学及生理生化特征，观察菌株M01在不同固体培养基上的形态，通过明胶液化、淀粉水解、V-P反应、碳源的利用能力、NaCl耐受性等一些列实验，测定其生理生化指标，结果参见表1。

[0044] 表1利迪链霉菌M01的形态学和生理生化指标测定

[0045]

[0046] 3、通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株M01基因组，以细菌16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增。目的产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测(附图3)，切胶回收后送到南京金斯瑞生物有限公司进行测序。

[0047] 4、测序结果与GenBank中已登录的基因序列进行BLAST分析比对，发现与菌株M01同源性高于98％的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16S rDNA序列用MEGA7.0软件基于Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果表明，菌株M01与Streptomyces lydicusGS93(GenBank Accession No.MK0019457.1)属于同一分支(附图4)，其序列最大相似性为99％。结合上述形态特征及生理生化指标，因此将菌株M01鉴定为利迪链霉菌。

[0048] 实施例3：利迪链霉菌M01体外抑菌活性测定

[0049] 1、以金黄色葡萄球菌，大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、菠萝泛菌和解淀粉欧文氏菌为指示菌，采用平板对峙法测定利迪链霉菌M01对细菌的体外抑菌活性。具体实施方式参考实施例1。

[0050] 2、利迪链霉菌M01发酵液对不同指示菌的抑菌圈平均直径参见表2；参见附图5为本发明的利迪链霉菌M01发酵液对火疫病病原菌解淀粉欧文氏菌抑制效果图。

[0051] 表2利迪链霉菌M01对不同指示菌的抑菌直径

[0052]

[0053] “+”：阳性结果positive results；“－”：阴性结果negative results。

[0054] 实验结果表明，利迪链霉菌M01对革兰氏阳性和阴性细菌具有广谱的抑菌效果，进而可以将该菌株应用于植物细菌性病害的防治当中。

[0055] 实施例4：利迪链霉菌M01的发酵液制备方法

[0056] 1、种子液的制备：将菌株M01接种到上述ISP-2斜面培养基上，28C培养7-10天，待其产生足量成熟的孢子后，用无菌环刮取孢子2-3环，接种于装有50mL上述种子液的250mL摇瓶内，置于可控温摇床上，在28℃条件下，180rpm/min恒温振荡培养24-30h；

[0057] 2、发酵液的制备：取上一步种子液，按10％的接种量将种子液接种于装有100mL上述发酵培养基的500mL摇瓶内；接种后的摇瓶在30℃条件下，以220rpm/min的转速培养96-120h，此时的菌体密度可以达到1×109CFU/mL以上，同时产生大量次级代谢产物，具有强烈的抑菌活性。

[0058] 实施例5：利迪链霉菌M01的蔷薇科花序防病实验

[0059] 供试病原菌：解淀粉欧文氏菌

[0060] 供试作物品种：梨

[0061] 参照实施例4的方法制备利迪链霉菌M01发酵液，同时将发酵液稀释至106CFU/mL备用。将解淀粉欧文氏菌在LB固体平板上37℃培养24h，挑取单菌落，接种LB液体培养基中，培养至106CFU/mL。从梨树上采集新开的梨花，将带有花梗的梨花放入含有10％蔗糖溶液的10mL无菌塑料管中。

[0062] 处理1：将1μL菌浓度为106CFU/mL的解淀粉欧文氏菌接种到梨花的五个柱头上(平均每个柱头0.2μL)，16h后，将1μL菌浓度为106CFU/mL的利迪链霉菌M01以同样的方式接种到每个柱头上。在接种利迪链霉菌M01的第8、16、24、32、40h后，分别将一个花柱头剪下，悬于1mL0.5×PBS溶液中，将悬浮液离心，取上清备用。每个处理3次重复。

[0063] 处理2：将1μL菌浓度为106CFU/mL的利迪链霉菌M01接种到梨花的五个柱头上(平均每个柱头0.2μL)，16h后，将1μL菌浓度为106CFU/mL的解淀粉欧文氏菌以同样的方式接种到每个柱头上。在接种利迪链霉菌M01的第8、16、24、32、40h后，分别将一个花柱头剪下，悬于1mL0.5×PBS溶液中，将悬浮液离心，取上清备用。每个处理3次重复。

[0064] 对照处理：用无菌水代替利迪链霉菌发酵液作为阴性对照。

[0065] 通过TaqMan探针实时定量PCR法对悬浮液中的解淀粉欧文氏菌数量进行定量。

[0066] 实验中使用的管家基因引物为：

[0067] amsk120F：5’-CATGCAATTTCCAGTTTCCT-3’；

[0068] amsk120R：5’-GCATGACGGTTAACCAAATC-3’，

[0069] 探针引物为amsk120Probe：5’-TGCGTGACCTGATTCAGCACAA-3’。

[0070] 实验结果：参见附图6，先接种病原菌再接种利迪链霉菌M01和先接种利迪链霉菌M01再接种病原菌的处理，花柱头上的病原菌数量都随着时间的推移呈现显著降低的趋势，且先接种利迪链霉菌M01的处理略优于后接种利迪链霉菌M01的处理，结果表明利迪链霉菌M01可以有效抑制病原菌在梨花上的增殖，从源头处防止梨火疫病的发生。

[0071] 实施例6：利迪链霉菌M01的梨树离体叶片防病实验

[0072] 供试病原菌：梨火疫病菌

[0073] 供试作物品种：梨

[0074] 参照实施例4和实施例5制备利迪链霉菌M01发酵液和解淀粉欧文氏菌培养液。从梨树上采集新鲜的的梨叶，用0.1％的升汞进行表面消毒3分钟，然后用无菌水漂洗3-5次，最后用无菌刀片从梨树叶片中间茎脉处划开约1cm伤口。

[0075] 处理1：在梨叶片划伤处接种10uL上述菌浓度为106CFU/mL的解淀粉欧文氏菌，16h后，将10uL利迪链霉菌M01发酵液同样接种每个叶片的伤口处。

[0076] 处理2：在梨叶片划伤处接种10uL利迪链霉菌M01发酵液，16h后，将10uL上述菌浓度为106CFU/mL的解淀粉欧文氏菌同样接种每个叶片的伤口处。

[0077] 对照处理：用无菌水代替利迪链霉菌发酵液作为阴性对照。每个处理3次重复。

[0078] 将处理好的叶片，置于垫有润湿滤纸的培养皿中，室温孵育。7天后，观察发病情况，计算相对防治效果，计算方法如下。

[0079] 叶片分级方法如下：

[0080] 0级无病斑：

[0081] 1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；

[0082] 3级：病斑面积占整个叶片面积的6％～25％；

[0083] 5级：病斑面积占整个叶片面积的26％～50％；

[0084] 7级：病斑面积占整个叶片面积的51％～75％；

[0085] 9级：病斑面积占整个叶片面积的76％以上。

[0086]

[0087]

[0088] 表3不同处理的病情指数及相对防治效果

[0089]

[0090] 实验结果：参见表3，处理1和处理2中火疫病病情指数均显著低于对照组，其中先接种利迪链霉菌M01的处理1的相对防治效果达到68.4％，后接种利迪链霉菌M01的处理2的相对防治效果达到62.4％。由此可见，本发明的利迪链霉菌M01对蔷薇科植物火疫病有较好的预防以及防治效果。