一种苯丙氨酸裂解酶及其在D-色氨酸制备中的应用

摘要

本发明涉及一种苯丙氨酸裂解酶及其在D‑色氨酸制备中的应用，属于生物工程领域，通过定向进化的方法获得高活力的苯丙氨酸裂解酶突变体，构建基因工程大肠杆菌，高效催化(E)‑3‑吲哚丙烯酸加氨反应生成D‑色氨酸，本发明的突变体酶较野生酶的酶活力具有显著提高，通过反应工艺的优化，24小时转化率最高可以达到95%以上，具有非常好的工业应用前景。

权利要求

1.一种苯丙氨酸裂解酶，其特征在于：与野生型苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列SEQ ID NO: 2相比，第309位氨基酸K被替换成T、第400位氨基酸F被替换成L、第508位氨基酸L被替换成M、第511位氨基酸M被替换成L以及第513位氨基酸T被替换成A。

2.如权利要求1所述一种苯丙氨酸裂解酶，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO: 3。

3.一种重组载体，是将编码权利要求1所述的苯丙氨酸裂解酶的核苷酸序列与载体连接得到。

4.一种转化体，通过将权利要求3所述的一种重组载体转化至宿主中获得。

5.如权利要求4所述的一种转化体，其特征在于：所述宿主选自大肠杆菌、酵母或枯草杆菌。

6.如权利要求1-2任意一种所述的苯丙氨酸裂解酶在酶法制备D-色氨酸上的应用，其特征在于：以（E）-3-吲哚丙烯酸为原料，以苯丙氨酸裂解酶为催化剂催化（E）-3-吲哚丙烯酸一步胺化反应生产制备D-色氨酸。

说明书

一种苯丙氨酸裂解酶及其在D-色氨酸制备中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及D-色氨酸的制备，具体地，涉及一种苯丙氨酸裂解酶及其在D-色氨酸制备中的应用。

背景技术

[0002] D-色氨酸可以作为饲料添加剂和非营养性甜味剂，它还是一种有低过敏性和抗药性的优点的非蛋白活性的氨基酸，所以在饲料行业和医药行业都有很大的市场和应用价值。

[0003] 国内D-色氨酸的合成现有酶促拆分法、化学拆分法、酶法合成和不对称合成法的报道，也有少量厂家已有工业化D-色氨酸的生产。在目前D-色氨酸合成方法中，化学拆分法所用的拆分剂多半较贵，且具有分离困难、步骤多、毒性和污染环境等问题；酶促拆分法多具有成本高、不稳定等缺点；化学合成法步骤多、收率低、有机试剂容易污染环境；而酶法合成工艺简单、专一性强，条件温和且不污染环境，符合国内外大规模工业化生产的要求，但所用菌种多为野生菌种，酶活低，生产周期长且产量较小。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种突变的苯丙氨酸裂解酶，目的二在于提供一种重组载体；目的三在于提供一种转化体；目的四在于提供所述突变的苯丙氨酸裂解酶在酶法制备D-色氨酸中的应用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

[0006] 一种苯丙氨酸裂解酶，与野生型苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列SEQ ID NO：2相比，在第51、137、138、170、309、400、488、508、511和513位中的至少一处的氨基酸发生替换，且相应地酶活力提高。

[0007] 作为对上述苯丙氨酸裂解酶的进一步优化，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2相比，第508位氨基酸被替换成M、第511位氨基酸被替换成L以及第513位氨基酸被替换成A。

[0008] 作为对上述苯丙氨酸裂解酶的更进一步优化，其氨基酸序列与与SEQ ID NO：2相比，第309位氨基酸被替换成T以及第400位氨基酸被替换成L；进一步地，相应地，核苷酸序列如SEQ ID NO：3。

[0009] 本发明进一步提供一种重组载体，是将编码上述任意一种苯丙氨酸裂解酶的核苷酸序列与载体连接得到。

[0010] 本发明还进一步提供一种转化体，通过将所述重组载体转化至宿主中获得。进一步地，所述宿主选自大肠杆菌、酵母或枯草杆菌。

[0011] 本发明还请求保护上述苯丙氨酸裂解酶在酶法制备D-色氨酸上的应用。

[0012] 所述应用是指以（E）-3-吲哚丙烯酸为原料，以苯丙氨酸裂解酶为催化剂催化（E）-3-吲哚丙烯酸一步胺化反应生产制备D-色氨酸。

[0013] 有益效果：

[0014] 本发明通过定向进化的方法获得来源于Petroselinum crispum的高活力的苯丙氨酸裂解酶突变体，构建基因工程大肠杆菌，高效催化(E)-3-吲哚丙烯酸加氨反应生成D-色氨酸，本发明的突变体酶较野生酶的酶活力显著提高，通过反应工艺的优化，24小时转化率可以达到95%以上，具有非常好的工业应用前景。

附图说明

[0015] 图1是苯丙氨酸裂解酶表达质粒pSH-PcPAL的图谱；

[0016] 图2是突变苯丙氨酸裂解酶（PcPAL-P2）不同pH相对酶活对比图；

[0017] 图3是突变苯丙氨酸裂解酶（PcPAL-P2）不同温度相对酶活对比图。

具体实施方式

[0018] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

[0019] 本发明的酶法制备D-色氨酸过程中，首先是苯丙氨酸裂解酶的制备，具体步骤如下：

[0020] 1、苯丙氨酸裂解酶基因工程菌构建

[0021] 苯丙氨酸裂解酶来源于Petroselinum crispum，其基因序列为序列1（如SEQ ID NO：01所示），编码的氨基酸为序列2（如SEQ ID NO：02所示） (GenBank: P24481)。通过全基因序列合成序列1，构建到pSH质粒中，pSH-PcPAL图谱如图1所示。

[0022] 2、苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）工程菌发酵

[0023] 从含有PcPAL工程菌种的平板挑选单克隆，接种到5 ml LB培养基中，37℃培养过夜，接种到含有100 mL TB培养基的1000 mL摇瓶中培养4-6小时，OD达到1.2-1.5，加入0.2 mM的IPTG诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

[0024] 3、苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）活力测定

[0025] 苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）酶活测定底物溶液配制：称取(E)-3-吲哚丙烯酸1.5 g，硫酸镁0.006 g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调节pH8.5 后定容至50 mL，即得3%的底物溶液。将大肠杆菌培养液加入到3%底物溶液中，45℃，250rpm，反应1小时，HPLC测定反应体系中D-色氨酸含量，计算酶活。

[0026] 酶活定义：在45 ℃，pH8.5 条件下，每分钟生成1 μmol D-色氨酸产物的酶量为一个酶活力单位U。

[0027] D-色氨酸的HPLC测定：

[0028] 色谱条件：安捷伦1260高效液相，Agilent (250*4.6mm，5um)色谱柱，流速1 mL/min，波长：278 nm，柱温：35℃，进样量20 μL，流动相A：B（90:10）。

[0029] 流动相A相：0.03%的KH2PO4溶液。

[0030] 流动相B相：100%甲醇。

[0031] 4、易错PCR法构苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）随机突变点库构建和筛选

[0032] 4.1、易错PCR法构建苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）随机突变点库构建

[0033] 以序列1模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。 正向引物PcPAL-BamH-F为5’-GGATCCATGGAAAACGGTAACGGTGCTACCAC -3’，反向引物PcPAL-Xho-R为5’-
CTCGAGTTAGCAGATCGGCAGCGGAGCACCG -3’

[0034] 50 μL易错PCR反应体系包括：50 ng质粒模板pSH-PcPAL，30 pmol一对引物PcPAL-BamH-F和PcPAL-Xho-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，（0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM）MnCl2，2.5个单位的Taq酶（fermentas）。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72 ℃ 2min/kbp；30个循环；72℃ 10min。胶回收2.0 kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃ 5min，
98℃ 20s，60℃ 30s，68 ℃ 2min/kbp，25个循环，68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。

[0035] 4.2、突变体库的高通量筛选

[0036] 选取突变体库中的转化子接种到含600 μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含50 μg/mL卡那霉素37℃培养过夜后，取60 μL过夜培养的菌液转接至600 μL 含50 μg/mL卡那霉素LB培养基的96孔深孔培养板中，37℃培养3个小时，加入0.2 mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。5000 rpm离心10 min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30 min，然后进行高通量平板测活。

[0037] 试剂配制：

[0038] 反应母液：100g（E）-3-吲哚丙烯酸，加入约400 mL水，搅拌均匀后，用浓氨水调节PH至8.5，然后加入终浓度为2 mM硫酸镁，搅拌均匀后，定容至1 L。

[0039] 终止反应液：1 M 盐酸

[0040] 反应过程：在冻融菌体中加入200 μL反应母液，45℃的条件下反应3个小时，加入等体积的终止液终止，然后5000 rpm离心10 min，取上清，HPLC检测吸光值。

[0041] 4.3、高酶活突变体复筛及酶活检测

[0042] “4.2 高通量高酶活突变体的筛选”筛选获得高酶活突变酶，通过方法“3. 苯丙氨酸裂解酶（PcPAL）活力测定”进行重复筛选和测定。

[0043] 5、苯丙氨酸裂解酶的定向进化筛选数据

[0044] 在随机突变库，通过对约6000个突变体克隆筛选，结果如表1中突变体酶活显著提高。

[0045] （1）利用易错PCR和定点饱和突变的基因工程方法提高苯丙氨酸裂解酶的活性，构建了不少于100、1000、6000克隆子规模的突变基因库，进行酶活性筛选，获得的基因突变序列相对于序列1的同源性不低于25%，50%，75%，或者，95%，优选不低于75%，95%，特别优选于不低于95%。

[0046] （2）获得氨基酸序列与序列2比较，同源性不低于25%，50%，75%，或者95%，优选不低于75%，95%，特别优选于不低于95%。

[0047] （3）根据对苯丙氨酸裂解酶活力测定获得突变基因，构建表达后的酶比活力见表1。

[0048] 表1：PcPAL突变体的（E）-3-吲哚丙烯酸反应活力

[0049]

[0050] 表中：*酶比活力：以野生酶的发酵活力（U/mL）与菌体浓度OD（OD/mL）的比值为100%。

[0051] 6、定点突变技术构建定向进化突变库

[0052] 根据5中筛选出的P1-39-C1和P1-92-D9相对活力较高，涉及K309T、F400L、L508M、M511L、T513A 5个位点。以P1-92-D9质粒为模板，以39C1F(5’-CTGAAGCTGTTGAAATCATGAAACTGCTGTCTGCCACCTTCCTGGTTGGTCTG-3’)和39C1R(5’-CAGACCAACCAGGAAGGTGGCAGACAGCAGTTTCATGATTTCAACAGCTTCAG -3’)引物对进行PCR扩增。

[0053] 50 μL PCR反应体系包括：10 ng质粒模板，10 pmol的引物对，1×KOD plus buffer，0.2 mM dNTP，1.5 mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

[0054] PCR反应条件为：95℃ 1 min，98℃ 10s，57℃ 30s，68℃ 1 min/kbp，25个循环，68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，化学转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，克隆子测序获得阳性转化子P2。构建表达后的活力见表2。

[0055] 表2：PcPAL突变体的（E）-3-吲哚丙烯酸反应活力

[0056]

[0057] 7、苯丙氨酸裂解酶突变基因P2（DNA序列如SEQ ID NO：03所示）构建到pSH质粒中，获得pSH-PcPAL-P2，然后构建不同的表达系统中，比如大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等，但不仅限于上述微生物；

[0058] 8、利用突变酶PcPAL-P2催化（E）-3-吲哚丙烯酸胺化反应生成D-色氨酸。

[0059] 利用突变酶PcPAL-P2（氨基酸序列如SEQ ID NO：04所示）催化（E）-3-吲哚丙烯酸胺化反应生成D-色氨酸，具体步骤如下：

[0060] 一：构建含有突变酶基因PcPAL-P2的大肠杆菌基因工程菌。

[0061] 将含有PcPAL-P2基因的质粒pSH- PcPAL-P2转化BL21(DE3)感受态细胞中，涂kan+平板培养过夜，挑选10个单菌落，接种到含有LB培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确。

[0062] 二：发酵制备野生酶PcPAL和突变酶PcPAL-P2。

[0063] 从含有PcPAL和PcPAL-P2基因的工程菌种的平板挑选单克隆，接种到50 mL LB培养基中，37℃培养过夜，接种到含有3 L 发酵培养基的5 L上海保兴生物设备工程有限公司发酵罐中培养4-6小时，OD达到1.2-1.5，加入0.2 mM的IPTG诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。

[0064] 三：测定突变苯丙氨酸裂解酶（PcPAL-P2）最适pH值

[0065] 酶活测定底物溶液配制: 称取(E)-3-吲哚丙烯酸1.5 g，硫酸镁0.006 g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，分别控制pH为7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，后定容至50 mL，即得3%的(E)-3-吲哚丙烯酸铵底物溶液。将大肠杆菌培养液加入到不同pH值的3%底物溶液中， 45℃，250 rpm，反应1小时。利用HPLC法测定反应体系中D-色氨酸的量，计算酶活结果如图2。

[0066] 四：测定突变苯丙氨酸裂解酶（PcPAL-P2）最适反应温度

[0067] 酶活测定底物溶液配制：称取(E)-3-吲哚丙烯酸1.5 g，硫酸镁0.006 g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调整pH 为8.5，后定容至50 mL，即得3%的(E)-3-吲哚丙烯酸铵底物溶液。将大肠杆菌培养液加入到3% 底物溶液中，分别控制反应温度30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，控制pH8.5，250 rpm，反应1小时。利用HPLC法测定反应体系中D-色氨酸的量，计算酶活结果如图3

[0068] 五：突变酶PcPAL-P2催化获得D-色氨酸

[0069] 反应体系200 mL，底物(E)-3-吲哚丙烯酸30 g/L，用浓氨水调节pH 8.5加酶量分别为100，200，400，800，1000 U/L， 45℃，控制pH8.5，250 rpm，反应20 h，测定D-色氨酸以计算底物最高转化率，见表3。

[0070] 表3：不同加酶量突变酶PcPAL-P2催化(E)-3-吲哚丙烯酸获得D-色氨酸

[0071]

[0072] 六：突变酶PcPAL-P2大规模催化(E)-3-吲哚丙烯酸反应生产D-色氨酸

[0073] 反应体系50 L，称取底物(E)-3-吲哚丙烯酸1500 g，硫酸镁6 g，加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢加入浓氨水，调整pH 为8.5，加酶量400 U/ L，定容到50 L。45℃，200 rpm，控制pH 8.5，反应20 h，检测体系中产物D-色氨酸生成量，确定最后反应体系的底物转化率超过98.5%。

[0074] 需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。