具有血管扩张功能和/或利尿功能的肽

摘要

本发明涉及具有血管扩张功能和/或利尿功能的肽。特别地，本发明涉及修饰利尿钠肽中的关键氨基酸残基以实现不同的功能和特性。因此，本发明还包括经修饰的利尿钠肽。本发明还涉及这些肽用于调节血压‑血量和/或治疗心脏病的用途。

权利要求

1.一种在哺乳动物中具有血管舒张活性和/或利尿活性的分离的肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：(SEQ ID NO:49)SLRRSSCFDGRMDRIGAQSDLGCNSFRY，其具有利尿活性；以及(SEQ ID NO:51)SLRRSSCFDRRMDRIGAQSDLGCNSFRY，其具有血管舒张活性。

2.根据权利要求1的分离的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1的分离的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1至3中任一项的至少一种分离的肽在制备用于调节血压‑血量和/或用于治疗心脏病的药物中的用途。

5.根据权利要求4的用途，其中所述分离的肽由SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列组成，并且所述药物用于治疗水肿患者，所述患者在肺和外周均具有过量流体但血压较低。

6.根据权利要求4的用途，其中所述分离的肽由SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列组成，并且所述药物用于治疗需要将血量从心脏和胸腔重新分配到外周并避免大量损耗的患者。

7.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。

8.一种组合物，其包含权利要求1至3中任一项的肽。

说明书

具有血管扩张功能和/或利尿功能的肽

技术领域

[0001] 本发明涉及具有血管扩张功能和/或利尿功能的肽。本发明还涉及这些肽用于调节血压‑血量的用途。

背景技术

[0002] 心力衰竭(HF)是世界上主要死因之一(四分之一的死亡)[Roger，V.L.等人，Circulation 123(4)：e18‑e209(2011)]。尽管多种因素如冠状动脉疾病、心肌梗塞、长期高血压、心肌病可引发HF，但综合征的进展与神经体液系统的活化有关，特别是肾素‑血管紧张素醛固酮系统(RAAS)和交感神经系统(SNS)的活化，其提高血量和血压[MacMahon，K.M.；Lip，G.Y.，Arch Intern Med 162(5)：509‑16(2002)]。HF的独特特征包括心脏的功能和结构变化以及血管收缩、不同程度的肾脏嗜水钠保留(avid retention of water and sodium by kidney)[McMurray，J.J.；Pfeffer，M.A.，Lancet 365(9474)：1877‑89(2005)]。
HF患者可大致分为：(a)等容积性或轻度高容量性的高血压性HF，(b)低容量性的正压性HF和(c)高容量或低容量状态的低血压性HF[Packer，M.，Am J Cardiol 71(9)：3C‑11C(1993)；Strobeck，J.E.；Silver，M.A.，Congest Heart Fail 10(2Suppl 2)：1‑6(2004)]。

[0003] 利尿钠肽(NP)是一类重要激素，其通过调节体内血管张力和体液量来赋予心血管保护[Brenner，B.M.等人，Physiol Rev 70(3)：665‑99(1990)]。它们在影响生理和病理条件下的生物体的血液动力学中具有不可或缺的作用。在哺乳动物中鉴定出三个NP同种型，即ANP、BNP和CNP[Kangawa，K.；Matsuo，H.，Biochem Biophys Res Commun 118(1)：131‑9(1984)；Sudoh，T.等人，Nature 332(6159)：78‑81(1988)；Sudoh，T.等人，Biochem Biophys Res Commun 168(2)：863‑70(1990)]。这些肽具有由二硫键和可变的N‑末端和C‑末端尾部保持的进化上保守的17‑残基环。ANP和BNP由心脏壁分泌，以响应心脏腔室中增加的充盈压[de Bold，A.J.，Science230(4727)：767‑70(1985)]，而CNP来自血管内皮[Suga，S.等人，Endocrinology 133(6)：3038‑41(1993)]。这些肽与特异性膜结合的利尿钠肽受体(NPR‑A、NPR‑B或NPR‑C)结合。ANP和BNP活化NPR‑A[Waldman，S.A.等人，JBiol Chem 259(23)：14332‑4(1984)]，并且CNP通过NPR‑B起作用以提高细胞内cGMP水平[Suga，S.等人，Endocrinology 130(1)：229‑39(1992)]。ANP/NPR‑A信号传导的下游活性包括血管舒张、增加水和电解质肾脏排泄、增加内皮通透性和抑制肾素‑血管紧张素醛固酮系统(RAAS)和交感神经系统(SNS)[Brenner，B.M.等人，Physiol Rev 70(3)：665‑99(1990)；Maack，T.等人，Fed Proc 45(7)：2128‑32(1986)；Sasaki，A.等人，Eur J Pharmacol 109(3)：405‑7(1985)]。这些对血流动力学的直接影响和对拮抗因子分泌的抑制有助于抗高血压和抗高血容量作用[Brenner，B.M.等人，Physiol Rev 70(3)：665‑99(1990)]。相反，CNP/NPR‑B信号传导主要通过血管舒张参与组织重塑、繁殖和脑功能以及轻度降血压作用[Chusho，H.等人，Proc Natl Acad Sci USA 98(7)：4016‑21(2001)]。保守的NP环内的残基是受体结合所必需的，而对特定NPR的分子识别是由于它们的序列中的细微差异，如C‑末端延伸[Brenner，B.M.等人，Physiol Rev 70(3)：665‑99(1990)]。

[0004] 目前HF的治疗策略包括使用血管紧张素转换酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、血管紧张素受体抑制剂和利尿剂的RAAS和SNS活化的药理学干预，其降低血量和血压并增加NP活性和cGMP产生(作为次要反应)[Rogers，C.；Bush，N.，Nurs Clin North Am 50(4)：787‑99(2015)]。NP在通过调节血管张力、尿钠排泄、利尿以及抑制RAAS和SNS来恢复血压‑血量稳态上具有至关重要的作用[Lee，C.Y.；Burnett，J.C.，Jr.，Heart Fail Rev 12(2)：131‑42(2007)]。HF患者的ANP和BNP水平均升高，它们未能展现其受益角色，归因于(a)生物活性肽的较低可用性和(b)NP受体的低表达水平[Mukaddam‑Daher，S.，Expert Opin Ther Targets 10(2)：239‑52(2006)]。尽管它们升高，但在HF患者中外源性输注ANP或BNP已显示出改进患者的临床状态[Lee，C.Y.；Burnett，J.C.，Jr.，Heart Fail Rev 12(2)：131‑42(2007)；Mukaddam‑Daher，S.，Expert Opin Ther Targets 10(2)：239‑52(2006)]。尽管存在受益角色，但外源性输注ANP和BNP由于其多种生理作用而与导致窘迫有关。因此，区分NP的血管功能和肾功能的配体对于解决具有明显不平衡的各种HF患者的个性化需求具有重要价值[Strobeck，J.E.；Silver，M.A.，Congest Heart Fail 10(2 Suppl 2)：1‑6(2004)；Volpe，M.等人，Clin Sci(Lond)130(2)：57‑77(2016)]。

[0005] HF可大致分为：(a)等容积性或轻度高容量性的高血压性HF，(b)低容量性的正压性HF和(c)高容量或低容量状态的低血压性HF。利尿钠肽(NP)是通过对血管、肾脏、心脏和交感神经系统的多方面作用来降低血压和血量的关键激素。在HF患者中输注NP是有益的，因为它们在减少血压‑血量超负荷方面具有多方面的作用。然而，NP输注也与严重低血压有关。

[0006] 需要关于心力衰竭中不同张力和容量状态的新药线索。

发明内容

[0007] 本发明提供了通过具有血管扩张活性和/或利尿活性来调节血压的肽。

[0008] 根据第一方面，本发明提供了一种分离的肽，其包含SEQ  ID  NO：1(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X1、X2、X8各自独立地包含任何氨基酸；X3包含R或K；X4包含M、I或L；X5包含G、S或N；X6包含A、H或S；X7包含Q、T、S、M或V；并且X9包含I或L。

[0009] 根据第二方面，本发明提供了根据本发明任一方面的分离的肽，其用于医学；用于疗法；和/或用作药物。

[0010] 根据第三方面，本发明提供了根据本发明任一方面的至少一种分离的肽在制备用于调节血压‑血量和/或用于治疗心脏病的药物中的用途。

[0011] 根据第四方面，本发明提供在受试者中调节血压‑血量和/或治疗心脏病的方法，其包括向受试者给予有效量的根据本发明任一方面的分离的肽。

附图说明

[0012] 图1A‑1C显示K‑Ring是血管扩张剂。图1A：哺乳动物和毒液NP的序列比较。NP具有由二硫键保持的规范17元环。在所有NP中粉色残基是保守的，并且以阴影突出显示的残基对于NP受体结合是重要的。K‑Ring是位置3和14处的两个关键取代，保守的G残基被D替代，并且它具有两个残基C‑末端尾部。用戊巴比妥钠麻醉雄性SD大鼠，并将它们的股动脉和股静脉与膀胱插管。通过实验输注含有肽或不含肽的盐水。阴影区域表示肽的输注。图1B：ANP和K‑Ring对麻醉大鼠的MAP的剂量依赖性作用。图1C：ANP和K‑Ring对麻醉大鼠的尿流速的剂量依赖性作用。数据表示为五次独立实验的均值±SE。

[0013] 对照组、0.2nmol/kg/min ANP和2nmol/kg/min K‑Ring曲线改编自Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。

[0014] 图2A‑2C显示环中的天冬氨酸残基和C‑末端尾部是控制NP的体内活性的分子开关。图2A：K‑Ring变体的序列及其体内反应(取代的残基以绿色显示)。对用戊巴比妥钠麻醉的雄性SD大鼠的股动脉、股静脉和膀胱进行插管，以在输注肽时测量血液动力学和尿量。在整个实验过程中连续输注含有肽或不含有肽的盐水。阴影区域表示肽的输注时间。图2B：K‑Ring及其变体对麻醉大鼠的MAP的剂量依赖性(2nmol/kg/min)作用。图2C：K‑Ring及其变体对麻醉大鼠的尿流速的剂量依赖性作用。数据表示为五次独立实验的均值±SE。

[0015] 对照和2nmol/kg/min K‑Ring曲线改编自Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。

[0016] 图3A‑3C显示ANP支架中天冬氨酸和精氨酸残基的掺入改变了血管功能和肾功能。图3A：ANP变体的序列及其体内反应(取代的残基以绿色显示)。对用戊巴比妥钠麻醉的雄性SD大鼠的股动脉、股静脉和膀胱进行插管，以在输注肽时测量血液动力学和尿量。在整个实验过程中连续输注含有肽或不含有肽的盐水。阴影区域表示肽的输注时间。图3B：ANP及其变体对麻醉大鼠的MAP的剂量依赖性作用。图3C：ANP及其变体对麻醉大鼠的尿流速的剂量依赖性作用。数据表示为五次独立实验的均值±SE。

[0017] 对照和0.2nmol/kg/min ANP曲线改编自Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。

[0018] 图4A‑4F显示ANP和K‑Ring的变体是NPR‑A的部分激动剂。测定用NP类似物处理细胞(瞬时表达NPR‑A)后累积的cGMP的量。图4A、4B：用ANP、K‑Ring及其变体处理30min后cGMP产生的剂量‑反应。图4C、4D：使用EC 50浓度的肽通过时间追踪研究测量的NPR‑A活化动力学。图4E、4F：每皮摩尔NP的NPR‑A活化动力学。数据表示为三次独立实验的均值±SE。

[0019] 图5显示了ANP、K‑Ring及其变体的分子量和同质性。合成的ANP、K‑Ring及其变体是使用基于Fmoc的固相肽化学来合成，并通过反相HPLC纯化。在碱性条件下使用10％DMSO溶液氧化纯化的肽并进行HPLC纯化。通过ESI‑离子阱MS分析纯化的氧化肽的质量。显示了计算的肽质量。

[0020] 图6A‑6D显示响应于剂量依赖性ANP和K‑Ring输注的血管参数变化。

[0021] 在使用戊巴比妥钠麻醉的雄性SD大鼠中对股动脉、股静脉和膀胱进行插管。连续输注含有肽或不含肽的盐水直至实验结束。阴影区域表示肽的输注。图6A：与输注两种不同剂量的ANP和K‑Ring相关的心率变化；图6B：与输注两种不同剂量的ANP和K‑Ring相关的脉压变化；图6C：与输注两种不同剂量的ANP和K‑Ring相关的收缩压变化；图6D：与输注两种不同剂量的ANP和K‑Ring相关的舒张压变化。

[0022] 图7A‑7D显示响应于剂量依赖性K‑Ring变体输注的血管参数变化。

[0023] 在使用戊巴比妥钠麻醉的雄性SD大鼠中对股动脉、股静脉和膀胱进行插管。连续输注含有肽或不含肽的盐水直至实验结束。阴影区域表示肽的输注。图7A：与输注K‑Ring变体相关的心率变化；图7B：与输注K‑Ring变体相关的脉压变化；图7C：与输注K‑Ring变体相关的收缩压变化；图7D：与输注K‑Ring变体相关的舒张压变化。

[0024] 显示的数据是五次独立试验的平均值，并且表示为均值±SE。对照和2nmol/kg/min K‑Ring曲线改编自Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。

[0025] 图8A‑8D显示响应于剂量依赖性ANP变体输注的血管参数变化。

[0026] 在使用戊巴比妥钠麻醉的雄性SD大鼠中对股动脉、股静脉和膀胱进行插管。连续输注含有肽或不含肽的盐水直至实验结束。阴影区域表示肽的输注。图8A：与输注ANP变体相关的心率变化；图8B：与输注ANP变体相关的脉压变化；图8C：与输注ANP变体相关的收缩压变化；图8D：与输注ANP变体相关的舒张压变化。

[0027] 显示的数据是五次独立试验的平均值，并且表示为均值±SE。对照组、0.2nmol/kg/min ANP和2nmol/kg/min K‑Ring曲线改编自Sridharan等人，[Biochem J469(2)：255‑66(2015)]。

[0028] 定义

[0029] 为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。

[0030] 如本文所用，术语″氨基酸序列″是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。

[0031] ″保守性氨基酸取代″是其中用具有类似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下项的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β‑分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在利尿钠肽的17‑残基环的位置2、3和/或14处被取代以实现肽活性变化的氨基酸残基本身可被类似的氨基酸替代而不显著改变活性。例如，如果将D(Asp)取代到利尿钠肽的17‑残基环中以实现肽活性的改变，则可以将它用来自相同(酸性残基)侧链家族的另一个氨基酸残基替代，如E(Glu)。同样，可以使用K(Lys)代替R(Arg)，因为两者都是碱性残基。此外，已知C‑末端NSFRY与受体相互作用。氨基酸Q(Gln)相当于N(Asn)(均为亲水性、中性残基)，T(Thr)相当于S(Ser)(均为具有羟基侧链的亲水性、中性残基)，并且Y(Tyr)和W(Trp)相当于F(Phe)(均为疏水性、芳香族残基)。这些残基的置换也可能有助于修饰C‑末端尾部。

[0032] 如本文所用的这些术语″包含给定多核苷酸序列的组合物″或″包含给定氨基酸序列的组合物″泛指含有本发明的给定多核苷酸或氨基酸序列的任何组合物。组合物可以包含无水配制品或水溶液。

[0033] 如本文所用，短语″核酸″或″核酸序列″是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任何片段；基因组或合成起源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以表示正义链或反义链)；肽核酸(PNA)；或任何DNA样或RNA样材料。

[0034] 术语″受试者″在本文中被定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究目的，受试者可以特别地是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。特别地，用于治疗或预防血压相关疾病，受试者可以是人。

[0035] 在本发明的上下文中使用的术语″治疗″是指改善性、疗法性或治愈性治疗。

[0036] 如本文所用，术语″包含(comprising)″或″包括(including)″应被解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组成部分的存在，但不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组成部分或其组。然而，在本公开内容的上下文中，术语″包含(comprising)″或″包括(including)″还包括″由......组成(consisting of)″。″包含(comprising)″一词的变体(如″comprise″和″comprises″)以及″包括(including)″(如″include″和″includes″)具有相应变化的含义。

具体实施方式

[0037] 为了方便，以参考文献列表的形式列出在本说明书中提及的参考文献并附加在实施例的末尾处。

[0038] 本发明提供一种分离的肽，其包含SEQ ID NO：1(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X1、X2、X8各自独立地包含任何氨基酸；X3包含R或K；X4包含M、I或L；X5包含G、S或N；X6包含A、H或S；X7包含Q、T、S、M或V；并且X9包含I或L。

[0039] 在一个优选的实施方案中，本发明的分离的肽和/或核酸不包括天然存在的肽和/或核酸分子，除非它们以某种方式通过本领域已知的标准方法进行修饰，例如出于增加其体内和/或体外稳定性的目的。

[0040] 在另一个优选的实施方案中，复制编码天然存在肽的天然存在外显子序列的分离的cDNA分子也被排除在本发明之外。

[0041] 天然存在的肽的例子是：

[0042] 具有以下序列的心房利尿钠肽(ANP)：

[0043]

[0044] 具有以下序列的金环蛇毒液利尿钠肽(KNP)：

[0045]

[0046] 具有以下序列的B型利尿钠肽(BNP)：

[0047]

[0048] 具有以下序列的C型利尿钠肽(CNP)：

[0049]

[0050] 具有以下序列的树眼镜蛇利尿钠肽(DNP)：

[0051]

[0052] 任意使用cDNA分子；天然存在的肽和/或天然存在的核酸分子将被视为本发明的一部分。

[0053] 应理解，本发明包括分离的肽，其包含利尿钠肽的17‑残基环的序列或由其组成。

[0054] 应理解，本发明还包括分离的肽，其包含利尿钠肽的17‑残基环的序列，在利尿钠肽的17‑残基环的位置2、3和/或14处包含至少一个经修饰的氨基酸。术语″修饰″旨在包括在利尿钠肽的17‑残基环中一个氨基酸被另一个氨基酸取代。例如，氨基酸G(Gly)可以替代位置2处的氨基酸D(Asp)。

[0055] 还应理解，本发明包括分离的全长利尿钠肽，在其17‑残基环的位置2、3和/或14处包含至少一个经修饰的氨基酸。此外，应当理解，在位置2、3和/或14处进行的氨基酸取代可以通过保守氨基酸替代。例如，如果将R(Arg)取代到位置3中，则另一个类似的(保守的)氨基酸可以复制R对肽活性的影响；如用K(Lys)取代。

[0056] 本发明进一步由发明的以下实施方案描述。

[0057] 根据第一方面，本发明提供了在哺乳动物中具有血管扩张活性和/或利尿活性的分离的肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X1、X2、X8各自独立地包含任何氨基酸；X3包含R或K；X4包含M、I或L；X5包含G、S或N；X6包含A、H或S；X7包含Q、T、S、M或V；并且X9包含I或L，其中该肽不是由SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56所述的氨基酸序列组成。

[0058] 根据优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ  ID  NO：2(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X1包含D或G。X1可包含E，代替D。

[0059] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：3(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X2包含R或G。X2可包含K，代替R。

[0060] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：4(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)，其中X8包含D或G。X8可包含E，代替D。

[0061] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第一优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：5(CFDX2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0062] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第一优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：6(CFGX2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0063] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第二优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：7(CFX1RX3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0064] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第二优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：8(CFX1GX3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0065] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第三优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：9(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SDX9GC)。

[0066] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面或第三优选实施方案的分离的肽包含SEQ ID NO：10(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SGX9GC)。

[0067] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：11(CFDRX3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0068] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：12(CFGRX3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0069] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：13(CFDGX3X4DRIX5X6X7SX8X9GC)。

[0070] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：14(CFGGX3X4DRIX5X6X7Sx8X9GC)。

[0071] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：15(CFDX2X3X4DRIX5X6X7SDX9GC)。

[0072] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：16(CFGX2X3X4DRIX5X6X7SDX9GC)。

[0073] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：17(CFDX2X3X4DRIX5X6X7SGX9GC)。

[0074] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：18(CFGX2X3X4DRIX5X6X7SGX9GC)。

[0075] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：19(CFX1RX3X4DRIX5X6X7SDX9GC)。

[0076] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：20(CFX1RX3X4DRIX5X6X7SGX9GC)。

[0077] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：21(CFX1GX3X4DRIX5X6X7SDX9GC)。

[0078] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：22(CFX1GX3X4DRIX5X6X7SGX9GC)。

[0079] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：1，其中X1是G或D、X2是G或R且X8是G或D。

[0080] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：1，其中X1、X2和X8分别选自G、R和D；D、R和G；D、G和D；以及D、R和D。

[0081] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含SEQ ID NO：23(CFX1X2X3X4DRIX5X6X7SX8X9GCNSFRY)。可以理解，在NSFRY尾部内，氨基酸N相当于Q(均为亲水性、中性残基)，S相当于T(均为具有羟基侧链的亲水性、中性残基)，并且F相当于W和Y(均为疏水性、芳香族残基)。用这些保守残基取代不应显著改变C‑末端尾部的活性。

[0082] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽包含选自以下的序列：

[0083] SEQ ID NO：24(CFDRRIDRISHTSDIGC)；

[0084] SEQ ID NO：25(CFGRRIDRISHTSDIGC)；

[0085] SEQ ID NO：26(CFDGRIDRISHTSDIGC)；

[0086] SEQ ID NO：27(CFDRRIDRISHTSGIGC)；

[0087] SEQ ID NO：28(CFGGRIDRISHTSDIGC)；

[0088] SEQ ID NO：29(CFGRRIDRISHTSGIGC)；

[0089] SEQ ID NO：30(CFDGRIDRISHTSGIGC)；和

[0090] SEQ ID NO：31(CFGGRIDRISHTSGIGC)。

[0091] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽选自：

[0092] SEQ ID NO：32(GLLISCFDRRIDRISHTSDIGCRH)；

[0093] SEQ ID NO：33(GLLISCFDRRIDRISHTSGIGCRH)；

[0094] SEQ ID NO：34(GLLISCFGRRIDRISHTSDIGCRH)；

[0095] SEQ ID NO：35(GLLISCFDGRIDRISHTSDIGCRH)；

[0096] SEQ ID NO：36(GLLISCFGRRIDRISHTSGIGCRH)；

[0097] SEQ ID NO：37(GLLISCFDRRIDRISHTSDIGCNSFRY)；

[0098] SEQ ID NO：38

[0099]

[0100] SEQ ID NO：39

[0101]

[0102] SEQ ID NO：40

[0103]

[0104] SEQ ID NO：41

[0105]

[0106] SEQ ID NO：42

[0107]

[0108] SEQ ID NO：43

[0109]和

[0110] SEQ ID NO：44

[0111]

[0112] 根据另一个优选的实施方案，根据第一方面的分离的肽选自：

[0113] SEQ ID NO：45(SLRRSSCFDGRMERIGAQSGLGCNSFRY)；

[0114] SEQ ID NO：46(SLRRSSCFGRRMDRIGAQSGLGCNSFRY)；

[0115] SEQ ID NO：47(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSDLGCNSFRY)；

[0116] SEQ ID NO：48(SLRRSSCFDRRMDRIGAQSGLGCNSFRY)；

[0117] SEQ ID NO：49(SLRRSSCFDGRMDRIGAQSDLGCNSFRY)；

[0118] SEQ ID NO：50(SLRRSSCFGRRMDRIGAQSDLGCNSFRY)；和

[0119] SEQ ID NO：51(SLRRSSCFDRRMDRIGAQSDLGCNSFRY)。

[0120] 根据另一个优选的实施方案，提供了根据第一方面的分离的肽，其中当X1是G且X8是G时，或当NSFRY存在于肽的C‑末端时，引发肽的利尿活性。

[0121] 根据另一个优选的实施方案，提供了根据第一方面的分离的肽，其中

[0122] a)当X1是G时，与X1是D时相比，该肽引发心率和脉压降低；

[0123] b)当X2是G时，该肽在低剂量时引发排他性利尿，并且在较高剂量时引发降血压以及利尿；

[0124] c)当X2是R时，该肽引发与b)中所示相反的药理活性偏好；

[0125] d)当X8是G时，与X8是D时相比，该肽引发持续的血管舒张作用；并且

[0126] e)当X1是D且X8是D时，该肽引发排他性降血压而无显著利尿。

[0127] 在本发明的优选的实施方案中，提供了具有血管扩张功能和/或利尿功能的分离的肽。优选地，分离的肽具有根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：51中任一个的氨基酸序列。

[0128] 根据另一个优选的实施方案，提供了根据第一方面的分离的肽，其中来自包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：51的组的肽具有血管舒张活性；来自包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的组的肽具有血管扩张和利尿活性；并且来自包含SEQ ID NO：49的组的肽具有肾活性。

[0129] 本发明包括如本文所公开的分离的肽，其用于医学；用于疗法；和/或用作药物。例如，本发明包括如本文所公开的分离的肽，其用于调节血压‑血量(例如在高血压或低血压中)和/或利尿。本发明还包括如本文所公开的分离的肽，其用于治疗心脏病(例如心力衰竭)。

[0130] 根据第二方面，本发明提供了根据本发明任一方面的分离的肽，其用于医学；用于疗法；和/或用作药物。

[0131] 本发明包括如本文所公开的至少一种分离的肽在制备用于调节血压‑血量(例如在高血压或低血压中)和/或利尿的药物中的用途。本发明还包括如本文所公开的至少一种分离的肽在制备用于治疗心脏病(例如心力衰竭)的药物中的用途。

[0132] 根据第三方面，本发明提供了根据本发明任一方面的至少一种分离的肽在制备用于调节血压‑血量和/或用于治疗心脏病的药物中的用途。

[0133] 本发明包括调节受试者的血压‑血量(例如在高血压或低血压中)的方法，其包括向受试者给予有效量的如本文所公开的分离的肽。本发明包括治疗受试者的心脏病(例如心力衰竭)的方法，其包括向受试者给予有效量的如本文所公开的分离的肽。

[0134] 根据第四方面，本发明提供在受试者中调节血压‑血量和/或治疗心脏病的方法，其包括向受试者给予有效量的根据本发明任一方面的分离的肽。

[0135] 可以使用本发明的纯血管舒张剂(如DRG‑K‑Ring、GRD‑K‑Ring、DGD‑K‑Ring；SEQ ID NO：33‑35)和DRD‑ANP(SEQ ID NO：51)来帮助″暖″和最低限度″湿″的患者，他们需要将血量从心脏和胸腔重新分配到外周并避免大量损耗。这些患者BP保持良好，并且没有极大的体积膨胀，并且可以耐受BP的降低。

[0136] 本发明的仅利尿剂(如DGD‑ANP；SEQ ID NO：49)将应用于体积膨胀(水肿)患者，其在肺和外周均具有过量流体但血压较低。这种″湿冷″子组非常难以治疗，因为需要排出超额体积(钠和水)，同时避免进一步降低BP，这可能会促成恶化休克并发肾衰竭。

[0137] 本发明的化合物通常作为药物配制品与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载剂(其可在适当考虑给药的预期途径和标准药学实践的情况下进行选择)混合给药。这些药学上可接受的载剂对活性化合物来说可以是化学惰性的，并且在使用条件下可能无有害副作用或毒性。合适的药物配制品可以在例如Remington The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.，Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania(1995)中找到。对于胃肠外给药，可以采用胃肠外可接受的水溶液，其为无热原的并且具有必需的pH、等渗性和稳定性。合适的溶液是本领域技术人员公知的，文献中描述了许多方法。药物递送方法的简要综述也可以在例如Langer，Science(1990)249，1527中找到。

[0138] 另外，本领域技术人员可以使用常规技术和/或根据标准和/或接受的药学实践常规地实现合适的配制品的制备。

[0139] 根据本发明使用的任何药物配制品中化合物的量将取决于各种因素，如待治疗病症的严重性、待治疗的特定患者以及采用的一种或多种化合物。在任何情况下，配制品中化合物的量可以由技术人员常规确定。

[0140] 例如，固体口服组合物如片剂或胶囊可含有1％至99％(w/w)活性成分；0至99％(w/w)稀释剂或填料；0至20％(w/w)崩解剂；0至5％(w/w)润滑剂；0至5％(w/w)流动助剂；0至50％(w/w)造粒剂或粘合剂；0至5％(w/w)抗氧化剂；和0至5％(w/w)颜料。控释片剂可另外含有0至90％(w/w)的控释聚合物。

[0141] 肠胃外配制品(如用于注射的溶液或悬浮液或用于输注的溶液)可含有1％至50％(w/w)活性成分；50％(w/w)至99％(w/w)的液体或半固体载剂或运载体(例如溶剂，如水)；和0‑20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂，如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮稳定剂、张力调节剂和防腐剂。

[0142] 取决于待治疗的障碍和患者以及给药的途径，化合物可以以不同的治疗有效剂量给予有需要的患者。

[0143] 然而，在本发明的上下文中给予哺乳动物(特别是人)的剂量应足以在合理的时间范围内在哺乳动物中实现治疗反应。本领域技术人员将认识到精确剂量和组合物以及最合适的递送方案的选择还将受到尤其以下的影响：配制品的药理学特性，所治疗病症的性质和严重性，以及身体状况的影响和接受者的精神敏锐度，以及特定化合物的效力，待治疗患者的年龄、状况、体重、性别和反应，以及疾病的阶段/严重程度。

[0144] 因此，在优选的实施方案中，本发明包括含有本发明的给定多核苷酸或氨基酸序列的任何组合物。

[0145] 本发明还包括编码如本文所公开的分离的肽的分离的核酸分子。

[0146] 根据第五方面，本发明提供了分离的核酸分子或多核苷酸，其编码根据本发明任一方面的分离的肽。优选地，核酸分子或多核苷酸包含在表达构建体内以产生本发明的肽。

[0147] 现在已经一般性地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。

[0148] 实施例

[0149] 本领域已知的并且未具体描述的标准分子生物学技术一般遵循如Green and Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(2012)中所述。

[0150] 实施例1

[0151] 材料和方法

[0152] ANP、K‑Ring和变体的合成和纯化

[0153] 使用人工的基于Fmoc的肽合成来合成所有肽。使用预装Tyr的Wang树脂合成ANP和变体，而使用Novasyn TGR树脂合成K‑Ring和变体。关于合成、纯化和折叠所采用的方法如Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]所述。

[0154] 动物

[0155] 雄性Sprague‑Dawley(SD)大鼠(220‑280g)获得自新加坡Invivos公司。在实验前将动物置于NUS动物留置单元中适应3天。实验在NUS机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(041/12)的指导和批准下进行。

[0156] 体内活性测定

[0157] 如Sridharan等人，[Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]所述进行实验。简而言之，用戊巴比妥钠(60‑70mg/kg)麻醉动物，并对股动脉、股静脉和膀胱进行插管。使用37℃的恒温热垫维持动物的体温。通过股静脉连续输注(2ml/h)0.2％BSA盐水(含或不含肽)，同时附着于股动脉的压力传感器记录动脉压均值(MAP)、心率(HR)和脉压(PP)的实时变化情况。收集尿液并且每隔10min测量尿量。实验包括对照期(2X10min)、实验期(1X10min)和恢复期(4X10min)。在实验结束时，在二氧化碳室内对所有动物实施安乐死。

[0158] 组胞培养和转染

[0159] 如Sridharan等人，[Biochem J469(2)：255‑66(2015)]所述进行实验。使用补充了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔培养基，以使CHO‑K1细胞在37℃与5％CO2下在潮湿培养箱中生长。通过每三天使用0.5％胰蛋
5
白酶进行传代培养来维持细胞。在24孔板中每孔接种(1X10个)细胞并使其生长16h。使用2TM
μl的Lipofectamine 2000转染试剂，用0.8μg编码大鼠NPR‑A的质粒转染各孔中的细胞。在转染后，将细胞用肽处理24h。

[0160] 全细胞cGMP测定

[0161] 用不同浓度的肽(在含有0.5mM IBMX的基础培养基中溶解10nM至10μM)处理NPR‑A转染的CHO‑K1细胞30min。在细胞裂解后，使用Enzo life sciences cGMP ELISA试剂盒(制造商的方案)，用200μl的0.1N HCl测量cGMP的终点累积。

[0162] 通过用EC50浓度的肽处理细胞来进行时间追踪研究。通过用0.1N HCl处理细胞，在指示的时间点(0、2、5、10、20和30min)终止反应。使用cGMP ELISA试剂盒(Enzo life sciences)测量细胞裂解物中的cGMP浓度。

[0163] 统计分析

[0164] 该数据表示为均值±SEM。使用单因素方差分析使用双尾t检验进行统计学分析。p值＜0.5被认为是显著的。

[0165] 实施例2

[0166] K‑Ring中的功能开关负责血液动力学效应

[0167] 为了解K‑Ring和C‑末端尾部异常取代的作用，我们评价了几种突变体的药理活性。第一代单突变体包括在K‑Ring内用G取代D3、R4和D14(图2A)。合成这些单点突变体，GRD DGD DRG即 K‑Ring、 K‑Ring和 K‑Ring(′突变′残基加下划线)(图5，表3)，并且在麻醉的大鼠中评价它们的体内活性(图2B、2C)。与K‑Ring相比，所有三种单突变体的2nmol/kg/min输注都诱导MAP(≈12mmHg)的类似下降，而尿量没有任何显著变化(图2B、2C，表1)。与K‑Ring(‑GRD
22.2±12.1BPM)相比， K‑Ring引起心率(HR)较大下降(‑44.8±20.2BPM)，这与输注
0.2nmol/kg/min ANP(‑47.0±13.5BPM)类似(图6A，6B，表1)。此外，与K‑Ring(‑4.5±
1.7mmHg)和ANP(‑7.7±3.9mmHg)相比，这种肽还引发脉压(PP)较大下降(‑11.5±2.3mmHg)DGD
(6A、6B，表1)。 K‑Ring输注导致与K‑Ring类似的HR和PP变化(‑21.8±9.5BPM，‑5.8±DRG
0.97mmHg)(表1)。当输注肽时，该突变体显示BP和HR的初始降低较慢(图6A、6B)。 K‑Ring输注虽然显示出与K‑Ring类似的血管反应(HR：‑18.1±3.1BPM且PP：‑3.2±3.0mmHg)(表
1)，但MAP和HR的变化未恢复到实验期内基线(图2B、6A、6B)。随后，我们合成了双突变体GRG
K‑Ring，其中两个D残基被G取代。该肽引发MAP、HR和尿流速的类似变化(MAP：‑11.8±GRG
1.5mmHg，HR：‑39.1±11.5BPM 11.4±3.8μl/min)。尽管对ANP的反应类似，但 K‑Ring对PPGRD
(‑12.9±0.7mmHg)的影响比 K‑Ring更大(图2、6A、6B)。因此，结果指示，对于MAP的类似变化，D3G取代导致HR和PP的较高下降，而D14G取代延迟了MAP和HR的恢复。有趣的是，用G取代D3和D14引入了K‑Ring肽中的肾活性。因此，D3和D14残基都充当控制开关，其将功能从经典NP(肾活性和血管活性)切换到仅血管扩张肽。

[0168] 为了理解C‑末端尾部在NP的体内功能上的作用，将K‑Ring(RH)的C‑末端尾部由NSFRYANP(NSFRY)的替代。对于2nmol/kg/min输注，该变体K‑Ring 展现出MAP中约等于15mmHg的下降。它显示与ANP类似的HR和PP变化(‑37.5±15.1BPM和‑7.3±0.7mmHg；图2B，6A，6B)NSFRY
以及利尿(12.3±3.8μl/min)。利尿峰值延迟10min(图2C)。因此，嵌合体K‑Ring 显示出ANP的主要特征，具有延迟的肾反应。因此，NSFRY尾部的存在显现克服了环内D3、R4和D14残基的存在。因此，C‑末端尾部似乎起到替代物的作用，但是是′有力的′分子开关，其控制体内药理作用。因此，通过系统突变研究，我们鉴定了利尿的两个功能开关：环内的两个Gly残基和NSFRY尾部。使用这些开关，我们可以操纵K‑Ring的药理作用。

[0169] 实施例3

[0170] 功能开关是可转移的

[0171] 为了进一步了解这些开关的重要性，我们在ANP中系统地引入了Asp残基(替代G3DGD和G14)和Arg残基(替代G4)。输注2nmol/kg/min ANP诱导尿流速显著增加(7.9±2.1μl/min)，与ANP(8.8±1.3μl/min)类似，但与接受0.2nmol/kg/minANP的动物(分别为‑10.1±
0.8mmHg，‑47.1±13.5BPM和‑7.7±1.8mmHg)相比，MAP、HR和PP的变化少了许多(分别为‑DGD
4.8±2.3mmHg，‑7.8±9BPM和‑4.3±1.4mmHg)(图3B、3C，图7A、7B，表1)。 ANP的利尿峰值NSFRY
延迟10min，与K‑Ring 类似。因此，该变体具有与ANP类似的活性特征曲线；利尿活性优先于降血压，但D3和D14的引入扩大了诱导利尿和血管舒张所需肽的有效浓度之间的差距。相DRD
反，与ANP相比，输注2nmol/kg/min ANP展示出有效的血管效应(MAP为‑18.3±2.3mmHg，HR为‑66.6±14.6BPM，PP为‑7.9±1.8mmHg)，以及意义深远的肾功能(18.7±0.7μl/min尿流DRD
速)(图3B、3C、8A、8B，表1)。在等摩尔输注ANP时，在较低剂量(0.2nmol/kg/min)下， ANP表现出类似的BP、HR和PP降低(分别为‑12.9±1.5mmHg，‑37.5±9.5BPM，‑5.8±2.8mmHg)，但DRD
未能诱导利尿(表1)。因此， ANP输注在肾功能之前表现出血管活性(图3B、3C、8A、8B)。这些观察支持D3和D14残基作为功能开关的作用。残基R4以及D3和D14似乎以剂量依赖性方式逆转体内活性；在低剂量下降血压，随后血管活性和肾活性，随后肽浓度增加(图3B、3C)。这些结果指示在K‑Ring中鉴定的功能开关可转移到ANP。

[0172] 实施例4

[0173] 刺激NPR‑A的鸟苷酸环化酶活性

[0174] 在生理学上，ANP与NPR‑A相互作用并刺激其鸟苷酸环化酶活性以提高细胞内cGMP水平[Oliver，P.M.等人，Proc Natl Acad Sci USA 94(26)：14730‑5(1997)]。先前，我们发现K‑Ring是一种NPR‑A激动剂，其效力比ANP低10倍[Sridharan，S.；Kini，R.M.，Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。为了解各残基在K‑Ring和ANP突变体中的作用，我们评价了它们在瞬时表达大鼠NPR‑A受体的CHO‑K1细胞中引起cGMP反应的能力(图4A、4B，表2)。在K‑Ring的GRD DRG DGD
单点突变体中， K‑Ring展现出高5倍的效力，而 K‑Ring和 K‑Ring与K‑Ring相比展现出GRG
效力下降3至4倍。与K‑Ring相比，双突变体 K‑Ring也展现出高4倍的效力(图4A，表2)。这些结果指示D3G取代导致效力增加，而在其他位置处的取代导致效力降低。在双突变体中，NSFRY
D3的取代导致效力增加，而D14处的第二次取代导致效力损失20％。在K‑Ring 中引入ANP的C‑末端尾部导致活性改进5倍。因此，显而易见的是，在ANP的位置3或C‑末端尾部存在第一Gly残基改进了受体活化的功效。

[0175] 与ANP相比，ANP突变体DRDANP和DGDANP的活性下降3倍和8倍(图4B，表2)。K‑RingNSFRYDRD DGD DRD DGD和 ANP都引发了等效力反应。 ANP和 ANP之间的效力差异类似于K‑Ring和 K‑Ring，这意味着 变化在两种NP中均等地贡献。

[0176] 我们还评价了在突变型ANP和K‑Ring存在下的NPR‑A活化动力学，以了解cGMP生成中的动态变化，其将影响第二信使的时空分布。评估了EC50浓度的肽的情况下cGMP累积的时间追踪研究。ANP引起cGMP水平的瞬时增加，而K‑Ring展现出较慢的活化动力学(2min与DRG DGD30min，以产生类似水平的cGMP(图4C‑4F)。单点突变体 K‑Ring、 K‑Ring的cGMP生成速率GRD GRG
比K‑Ring慢，而 K‑Ring诱导cGMP产生速率略有增加。与K‑Ring相比，双突变体 K‑Ring展GRD GRG
现出改进的活化动力学(3倍)，在10min内cGMP最大累积。尽管 K‑Ring和 K‑Ring具有相NSFRY
当的EC50浓度，但活化动力学明显不同(cGMP产生的峰值分别为10min和20min)。K‑RingGRG
显示出与 K‑Ring类似的活化动力学改进；在10min时具有峰值反应，随后cGMP缓慢衰减以DRD DGD
达到饱和值。与野生型相比，ANP的变体显示出较慢的活化动力学； ANP和 ANP均显示出DRD DGD
慢2.6和7.8倍的动力学(10min时最大cGMP升高)。与 ANP相比， ANP展现出更快的细胞内cGMP衰减。这些观察表明D残基确实影响受体结合和第二信使生成。展现出更快的活化动力学的变体似乎在峰值反应后显示cGMP的衰减。由于将细胞用磷酸二酯酶抑制剂(0.5mM IBMX)处理，因此cGMP的降解速率很可能是微不足道的。用EC50浓度的肽处理细胞确保了细胞GTP没有限制。因此，在某些变体中观察到的cGMP产生的衰减表明这些肽最可能引起受体的脱敏。

[0177] 总的来说，NPR‑A活化动力学清楚地区分了各NP突变体；血管活性NP展现出较慢的动力学，相比之下，血管活性和肾脏活性NP展现出相对较快的动力学。

[0178]

[0179] 表2.ANP、K‑Ring及其变体的受体活化效力和动力学概况

[0180]

[0181] 表3.ANP、K‑Ring及其变体的质量

[0182]

[0183] 表4.ANP、K‑Ring和变体的按MAP单位变化计的HR和PP变化速率

[0184]

[0185] 除了ANP(0.2nmol/kg/min)之外，对于输注2nmol/kg/min的肽，数据以MAP和其他血管参数之间的相互关系表示

[0186] 讨论

[0187] ANP的抗高血压和抗高血容量特性是浓度依赖性的；排他性肾功能在较低剂量(0.02‑0.1nmol/kg/min)下表现，并且两种活性均在略高的剂量(＞0.1nmol/kg/min)下展现[Morice，A.等人，Clin Sci(Lond)74(4)：359‑63(1988)]。因此，使对肾和循环的活性分离的阈值浓度上的差异小于5倍，并且在不同的研究中是可变的[Soejima，H.等人，Am J Physiol 255(3Pt2)：R449‑55(1988)；Morice，A.等人，Clin Sci(Lond)74(4)：359‑63(1988)]。虽然这种剂量依赖性可归因于靶标组织(肾脏＞血管)中的NPR‑A表达水平[Uhlen，M.等人，Science 347(6220)：1260419(2015)]，但确切的分子机制尚不清楚。ANP的结构活性研究已经鉴定了NPR‑A结合[Olins，G.M.等人，J Biol Chem 263(22)：10989‑93(1988)]和赋予生理活性所必需的重要残基(环内的F8、M13、D14和R15以及C‑末端NSFRY)。一些研究利用噬菌体展示来增加ANP变体对NPR‑A的特异性并改进利尿钠/利尿反应[Jin，H.；Li，B.等人，J Clin Invest 98(4)：969‑76(1996)]。然而，NP中血管功能和肾功能的分子决定因素仍未鉴定出来。

[0188] 最近，我们从金环蛇毒液(KNP)中鉴定并表征了外源NP[Sridharan，S.；Kini，R.M.，Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。该肽具有保守的NP环，具有38个残基长的C‑末端尾部(图1A)，其具有形成α‑螺旋的倾向。我们的结构‑功能研究显示，KNP有两个药效团：K‑Ring和Helix。这些功能区段通过正交途径诱导血管舒张。与经典NP一样，K‑Ring通过活化NPR‑A提高细胞内cGMP水平，比ANP效力低10倍，而Helix使用NO依赖性机制[Sridharan，S.；Kini，R.M.，Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。

[0189] 此外，我们观察到在麻醉大鼠中输注2nmol/kg/min K‑Ring显示动脉压均值(MAP)下降12mmHg(在实验期内恢复至基线)，尿量没有显著变化[Sridharan，S.；Kini，R.M.，Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。高5倍剂量的K‑Ring显示出MAP的进一步下降(‑19.1±2.5mmHg，没有恢复)，而不影响尿量(图1B、1C)。因此，K‑Ring诱导血管舒张，而具有最小或没有利尿作用。这与ANP诱导利尿和血管扩张活性的能力形成对比；低剂量(0.08nmol/kg/min)的ANP显示尿量增加而MAP没有任何改变，而稍高剂量(0.2nmol/kg/min)显示MAP和利尿一起降低(图1B、1C)，正如先前所观察到的[Soejima，H.等人，Am J Physiol 255(3Pt2)：
R449‑55(1988)]。因此，观察到的这些肽的体内活性差异表明，与ANP相比，K‑Ring具有不同的血液动力学和利尿作用，并且它可以充当描绘NP中降血压和利尿功能的决定因素的分子路线图。

[0190] 对ANP的结构活性研究显示，17‑元环内的某些保守残基(F2、M6、D7、R8、I9和L15)及其C‑末端尾部(NSFRY)对NPR‑A结合和体内活性至关重要[Li，B.等人，Science 270(5242)：1657‑60(1995)；Olins，G.M.等人，J Biol Chem 263(22)：10989‑93(1988)；Ogawa，H.等人，J Biol Chem 279(27)：28625‑31(2004)]。在环内受体结合所必需的所有关键残基在K‑Ring中是保守的，但其C‑末端尾部仅具有两个残基(RH)。与ANP相比，K‑Ring在环内具有几处取代(G3D、G4R、G9S、A10T、Q11H和G14D)。其中，位置9、10和11处的残基在几种NP中是可变的(图1A)。因此，我们假设观察到的ANP和K‑Ring的血液动力学和利尿作用的差异的原因可能是不同的结构差异，G3D、G4R和G14D取代，以及较短的C‑末端尾部。在本研究中，我们讨论了它们使用系统取代赋予NP体内功能的作用。此外，使用译解的结构细节，我们工程化了具有血管功能或肾功能的ANP类似物。具有排他性功能的这些变体作为治疗心力衰竭患者的治疗剂具有巨大价值。这些结构‑功能关系研究还鉴定了影响NP诱导的血管舒张、心率和利尿的关键残基。

[0191] K‑Ring有助于描绘血管扩张和利尿作用

[0192] 我们先前的研究表明，K‑Ring(与ANP 70％相同)在不改变肾脏输出的情况下排他性地诱导降血压作用，尽管是NPR‑A激动剂[Sridharan，S.；Kini，R.M.，Biochem J 469(2)：255‑66(2015)]。即使在比诱导排他性利尿的ANP高100倍的浓度下，该肽也未能引起肾反应(图1B、1C)。因此，K‑Ring结构似乎编码支配NP的组织特异性反应的分子信息，并且因此提供了鉴定残基的推动力，其在确定对血管功能和/或肾功能的选择性中起关键作用并且充当功能开关。

[0193] G3的作用：G3几乎在所有NP中都是保守的。但该残基被K‑Ring中的Asp替代(图1A)。我们的结果表明，G3是NP环内的一个重要残基，赋予有力的血管功能。用带负电荷的Asp取代该残基使活化NPR‑A的效力降低约3至10倍(图4A、B，表2)并降低活化动力学(5倍)(图4C、D，表2)。对于类似的BP变化，G3D取代也似乎降低了对HR和PP的影响(图2A、6A、B)；与G3变体(分别为3.0倍和0.8倍)相比，D3变体显示按每毫米Hg的BP下降计较小的HR和PP变化(分别为1.5倍和0.3倍)(表4)。因此， 变化充当了控制NP的HR和PP变化的分子开关。

[0194] G14的作用：在K‑Ring支架内，D14取代为G显现使NPR‑A的效力降低10倍(表2)，并且活化动力学降低3倍(图4C)。位置14处的变异似乎在整个实验期间维持BP和HR的变化，最GRG DRG低限度恢复。因此，可能表明G14是引发持续血管活性所必需的关键残基。在 K‑Ring、 K‑GRD
Ring和 K‑Ring之间的比较中，显而易见的是，G14控制NP的肾功能。G3和G14的存在对于保证NP的肾功能是必需的。

[0195] 残基D3和D14似乎降低了NP引起cGMP反应的能力。从ANP‑NPR‑A复合物的晶体结构A B来看，G3和G14似乎与带负电荷的口袋(受体亚基的E169和E169)非常接近[Ogawa，H.等人，J Biol Chem 279(27)：28625‑31(2004)]。在位置G存在D可以在NPR‑A的带负电荷口袋之间引入构象限制以及静电排斥，与高亲和力天然配体相比，其可能脱离关键的分子相互作用并通过一组不同的结构框架介导活化。由不同配体施加于细胞外结构域的构象选择性的差异可以改变细胞内鸟苷酸环化酶结构域的变构活化的中继，从而导致独特的活化动力学。
先前的研究显示，G3A和G14A的突变并没有显著改变结合效率，这表明在缺失Gly残基的情况下构象灵活性的丧失没有影响[Li，B.等人，Science 270(5242)：1657‑60(1995)；
Watanabe，T.X.等人，Eur J Pharmacol 147(1)：49‑57(1988)]。因此，我们的结果指示Asp残基在3和14处的掺入以及庞大和带电侧链的引入可能降低配体活化NPR‑A的能力并影响其体内活性。

[0196] G4的作用：G4取代为Arg似乎将NPR‑A活化效力改进了3倍。在DGDK‑Ring和K‑Ring以DGD DRD及 ANP和 ANP之间观察到活性的差异，表明由于在两个支架中引入带负电荷的残基，R4对于补偿脱离与NPR‑A的相互作用可能是重要的。在ANP框架中，该残基似乎对于逆转功能DRD DGD
选择性(血管活性，随后是肾脏活性)是重要的。与 K‑Ring相比， K‑Ring诱导较慢的BP降低速率，表明对系统的影响较小(图2B，2C)。与在这些位置具有Asp的变体相比，具有G3和G14的NP变体展现出10倍改进的NPR‑A活化效力和快3倍的动力学。G3和G14似乎都是K‑Ring支架中展示肾活性所必需的，并且因此被鉴定为′利尿切换残基′。

[0197] C‑末端NSFRY的作用：C‑末端NSFRY作为替代物，但是是强有力的利尿功能开关，其在排他性降血压的多肽中引入了肾功能。向K‑Ring添加C‑末端尾部改进了NPR‑A活化效力(5倍)和动力学(10倍)。ANP‑NPR‑A的晶体结构显示C‑末端尾部的残基N、S、F、R形成氢键以B B B及pi‑pi与受体的Q186 、E187 和F188 相互作用。早前的突变研究还揭示，C‑末端尾部缺失削弱了引发ANP的血管舒张(30倍)和尿钠排泄(3倍)的能力[Watanabe，T.X.等人，Eur J Pharmacol 147(1)：49‑57(1988)]。因此，C‑末端尾部显现是一个重要的分子开关。C‑末端尾部的存在增加了对HR和PP的影响(图3A‑3C、7A‑7D)。因此，C末端尾部的添加改进了血管DRD NSFRY
活性并赋予了肾功能。尽管 ANP和K‑Ring 均引发了等效的NPR‑A活化效力和动力学，但NSFRY
与K‑Ring 相比，输注相同摩尔的这些多肽产生了对HR(2倍)和利尿(2倍)展现影响的DRD
ANP(表1)。

[0198] 与DRDANP相比，在K‑Ring支架中包含NSFRY作为C‑末端尾部显示利尿峰值延迟(图3C)。这些体内效应差异可归因于两种NP之间在位置9、10和11(ANP中的G、A、Q与K‑Ring中的S、H、T)中的结构差异。一项使用噬菌体展示文库的先前研究显示，G9R、A10E和Q11A突变似乎可以改进利钠和利尿功能[Cunningham，B.C.等人，EMBO J 13(11)：2508‑15(1994)]。因此，需要进一步研究以评价这些残基在NP的肾功能中的作用。

[0199] NPR‑A受体活化动力学和功能

[0200] NpNP变体的药理学功能的差异可以通过以下解释：(a)不同靶标组织中NPR‑A的表达水平；(b)清除受体(NPR‑C)的表达模式；(c)配体的结合和活化动力学；和(d)信号的区室化。基因表达水平和组织化学染色实验揭示，与血管平滑肌相比，肾脏中NPR‑A表达水平更高[Uhlen，M.等人，Science 347(6220)：1260419(2015)]。尽管NPR‑C表达遵循类似的趋势(与血管平滑肌相比，肾脏中表达更高)，但这些组织中NPR‑A和NPR‑C的比例(其决定活化特征曲线)是不同的[Uhlen，M.等人，Science 347(6220)：1260419(2015)]。低剂量ANP时肾功能的发作可归因于靶标组织中受体表达模式的差异。所有NP类似物均活化NPR‑A，但它们的活化动力学显著不同(表2)。数据显示(i)与利尿和血管舒张肽相比，排他性降血压肽展现出缓慢的活化动力学，并且(ii)展现出更快活化的肽在峰值反应后显示cGMP信号的衰减。cGMP合成速率的这种差异将改变扩散速率，这可能引入信号的差异时空分布和区室化(以仅活化某些下游效应物)，导致选择性下游功能[Piggott，L.A.等人，J Gen Physiol 128(1)：3‑14(2006)]。两种细胞类型中的关键下游效应物是蛋白激酶G(胞质)、磷酸二酯酶(胞质和膜相关)和环状核苷酸门控离子通道(膜结合)[Potter，L.R.等人，Handb Exp Pharmacol(191)：341‑66(2009)]。这些蛋白质的差异定位需要第二信使的扩散以启动信号传导级联。有大量证据表明磷酸二酯酶在区室化环状核苷酸信号中的作用[Fischmeister，R.等人，Circ Res 99(8)：816‑28(2006)]，并且2006年的该研究表明扩散增强的信号轮廓空间隔离可能有助于归属特定的下游功能。因此，进一步表征由本文所述的天然配体(ANP和BNP)或NP类似物施加的细胞内信号的差异可以帮助我们理解这些肽如何展现出不同的生理学或药理学特征曲线。

[0201] 解除NP的血管扩张功能和利尿功能的联系

[0202] 我们的研究描绘了NP的突出特征，并鉴定了决定NP的血管扩张功能和/或利尿功能的分子功能开关。在缺失C‑末端尾部的情况下位置3和14处的Asp残基是仅发展血管活性NP的关键显著特征。残基G3似乎导致HR和PP的更大下降，并且将其用Asp取代降低了关于MAP的类似变化的这些参数的减小。G3和G14的存在或C‑末端尾部的存在导致利尿功能。如上所述，HF情况需要个性化的药物，取决于血压‑血量超负荷。这些功能开关有助于产生可根据HF患者的个性化治疗进行调整的NP。因此，本研究提出了可能有助于开发关键治疗分子的潜在NP类似物的设计。本研究调查了这些肽在麻醉大鼠中的药理作用。

[0203] 总之，这项研究已经查明了控制NP对平滑肌和肾脏的活性的分子开关。该研究拓宽了特定需要的配体的设计范围，并且为探索NPR‑A的受体‑效应物系统提供了平台。工程化NP类似物可以作为关键的治疗线索，可以帮助调节不同队列的HF患者中的血压或血量。

[0204] 总结

[0205] 利尿钠肽在心力衰竭中恢复平衡具有重要作用。ANP引发浓度依赖性利尿功能和/或降血压功能；在低剂量时，它仅引发肾功能，并且在略高的剂量下它引发血管功能和肾功能。K‑Ring是金环蛇毒液NP的保守环，展现出排他性血管舒张作用，在100倍的ANP浓度下不会改变尿量。在这里，我们已经描绘了通过系统取代环中位置3、4和14处的残基和C‑末端尾部来控制其血管扩张功能和利尿功能的分子开关。在麻醉的大鼠中输注各种NP类似物指示[0206] (a)与D3类似物相比，G3类似物显著降低了心率和脉压；

[0207] (b)G4类似物在低剂量时展现出排他性利尿，并且在较高剂量时展现出降血压和利尿，而R4类似物引发相反的药理活性偏好；

[0208] (c)与D14类似物相比，G14类似物显示出持续的血管舒张作用；

[0209] (d)具有G3和G14取代的类似物引发利尿，而D3和D14类似物展现出排他性降血压而没有显著的利尿，从而充当′血管扩张‑利尿切换′开关；并且

[0210] (e)具有C‑末端尾部(NSFRY)的类似物覆盖了D3和D14残基的影响，以在原本仅血管扩张的肽中诱导利尿，从而充当′强力利尿′开关。这些肽的NPR‑A活化效力和动力学区分了观察到的药理学曲线特征；具有缓慢活化动力学的部分激动剂仅展现出血管舒张特性，而具有较快动力学的那些激动剂引发血管扩张作用和利尿作用。

[0211] 参考文献

[0212] 在本说明书中对明显在先公布的文件的任何列表或讨论不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。

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