加快土壤重金属污染修复的微生物菌剂及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由腐殖质呼吸菌和益生菌组成，其中所述所述腐殖质呼吸菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)和海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)组成，所述益生菌由厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(Brocadia anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成。本发明还涉及所述微生物菌剂的制备方法及其用途。

权利要求

1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由腐殖质呼吸菌和益生菌组成，其中所述腐殖质呼吸菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)和海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)组成，所述益生菌由厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(Brocadia anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)组成。

2.权利要求1的微生物菌剂，其中腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(B.anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的质量比为A：B：C：D：E，其中A选自2‑4的数字，B选自2‑4的数字，C选自1‑3的数字，D选自1‑3的数字，E选自3‑5的数字。

3.权利要求1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖和氨基酸组成，所述复合菌剂I，糖和氨基酸组成复合菌剂II。

4.权利要求3的微生物菌剂，其中所述复合菌剂I，糖和氨基酸的质量比为a：b：c，其中a选自60‑80的数字，b选自15‑40的数字，c选自10‑30的数字。

5.权利要求3或4的微生物菌剂，其中所述糖是葡萄糖，果糖，乳糖或麦芽糖。

6.权利要求3‑4任一项所述的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭。

7.权利要求6的微生物菌剂，其中所述生物炭来自植物。

8.权利要求6的微生物菌剂，其中所述植物是松针。

9.权利要求6的微生物菌剂，其中所述生物炭是通过400℃热解松针4～6h，过150～200目筛而制得。

10.权利要求6的微生物菌剂，其中复合菌II占生物炭的质量百分比为6～12％。

11.制备权利要求6所述微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将腐殖质呼吸菌与益生菌培养至对数生长期，后混合均匀，得到复合菌剂Ⅰ，(2)将步骤(1)所得复合菌剂Ⅰ冻干后与生物活性物质混合，得到复合菌剂Ⅱ，(3)将步骤(2)所得复合菌剂Ⅱ，与生物炭混合固定。

12.权利要求11的制备方法，其特征在于腐殖质呼吸菌及厌氧氨氧化布罗卡德氏菌的培养条件为35～38℃，厌氧条件；枯草芽孢杆菌的培养条件为35～38℃，好氧条件。

13.权利要求11‑12任一项所述的制备方法，其特征在于所述对数生长期是指菌液在

600nm波长处的光密度值范围为0.5～0.9。

14.权利要求11‑12任一项所述的制备方法，其特征在于所述生物炭的制备方法为：400℃热解松针4～6h，过150～200目筛。

15.权利要求11‑12任一项所述的制备方法，其特征在于所述固定方法为：将生物炭加入100mL固定化培养基，灭菌后，加入质量比为6～12％的复合菌剂Ⅱ，温度为35～38℃，固定时间为16～20h。

16.权利要求15的制备方法，其中所述生物炭是1～1.2g。

17.权利要求1‑6任一项所述的微生物菌剂在促进土壤重金属污染修复中的应用。

18.权利要求17的应用，其中所述促进土壤重金属污染修复是降低土壤重金属含量。

19.权利要求17或18所述的应用，其中所述重金属选自Cd、Cr、U、Cu、Pb、Hg、Zn及组合。

说明书

加快土壤重金属污染修复的微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境工程领域，具体地涉及一种加快土壤重金属污染修复的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 我国耕地质量总体呈下降趋势，重金属污染是目前土壤污染的主要问题，基于土壤中存在大量电子传递中介体，利用胞外呼吸微生物增强土壤中电子传递与循环能力，可
有效促进多种污染物的还原降解，具有非常显著的环境效应。

发明内容

[0003] 本发明涉及以下一个方面：

[0004] 1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由腐殖质呼吸菌和益生菌组成，其中所述所述腐殖质呼吸菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属
还原地杆菌(Geobacter metallireducens)和海藻希瓦氏菌(Shewanella alga)组成，所述
益生菌由厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(Brocadia anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(Bacillus 
subtilis)组成，优选地，腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌
(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌
(B.anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的质量比为A∶B∶C∶D∶E，其中A选自2‑4的
数字，B选自2‑4的数字，C选自1‑3的数字，D选自1‑3的数字，E选自3‑5的数字。

[0005] 2.上述1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖(例如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，优选葡萄糖)和氨基酸组成，所述复合菌剂I，糖和氨基酸
组成复合菌剂II，优选所述复合菌剂I，糖和氨基酸的质量比为a∶b∶c，其中a选自60‑80的数
字，b选自15‑40的数字，c选自10‑30的数字。

[0006] 3.上述1‑2任一项所述的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭，优选所述生物炭来自植物，更优选来自松针，更优选其是通过400℃热解松针4～6h，过150～200目筛而制
得，进一步优选地，复合菌II占生物炭的质量百分比为6～12％。

[0007] 4.制备上述3所述微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

[0008] (1)将腐殖质呼吸菌与益生菌培养至对数生长期，后混合均匀，得到复合菌剂I。

[0009] (2)将步骤(1)所得复合菌剂I冻干后与生物活性物质混合，得到复合菌剂II。

[0010] (3)将步骤(2)所得复合菌剂II，与生物炭混合固定。

[0011] 5.上述4的制备方法，其特征在于腐殖质呼吸菌及厌氧氨氧化布罗卡德氏菌的培养条件为35～38℃，厌氧条件；枯草芽孢杆菌的培养条件为35～38℃，好氧条件。

[0012] 6.上述4‑5任一项所述的制备方法，其特征在于所述对数生长期是指菌液在600nm波长处的光密度值(OD600)范围为0.5～0.9。

[0013] 7.上述4‑5任一项所述的制备方法，其特征在于所述生物炭的制备方法为：400℃热解松针4～6h，过150～200目筛。

[0014] 8.上述4‑5任一项所述的制备方法，其特征在于所述固定方法为：

[0015] 将生物炭(优选1～1.2g)加入100mL固定化培养基，灭菌后，加入质量比为6～12％的复合菌剂II，温度为35～38℃，固定时间为16～20h。

[0016] 9.上述1‑3任一项所述的微生物菌剂在促进土壤重金属污染修复(优选降低土壤重金属含量)中的应用。

[0017] 10.上述9所述的应用，其中所述重金属选自Cd、Cr、U、Cu、Pb、Hg、Zn及其组合。

[0018] 在本发明的具体实施方案中，固定化培养基的组成为：蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5。

[0019] 在本发明中，生物活性物质用来为微生物提供营养，其中所用的糖是本领域常规用于微生物培养的糖，包括，但不限于葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖。所使用的氨基酸也是本
领域常规用于微生物培养的氨基酸。

[0020] 生物炭是一类比表面积大、疏松多孔、含碳丰富、高度芳香化、抗分解能力强的物质，含有羟基、羧基、羰基等活性官能团，对多种污染物具有较好的吸附效果，且可提高土壤
酸碱度、减少氮素损失和改善土壤微生物特性，已被广泛应用于土壤改良。微生物技术修复
是利用微生物的生命活动，调节或控制生境内的生化反应，降解有机污染物的过程，因成本
低、见效快而具有较大的应用潜力。

[0021] 在本发明的研发过程中，本发明的发明人发现在土壤这个天然的氧化还原体系中，以腐殖质为电子受体的腐殖质呼吸菌，可以在腐殖质存在的条件下，通过电子传递过
程，将大分子的污染物逐步降解转化为无毒或低毒小分子物质，从而实现污染物的去除。此
外，生物炭可作为土壤腐殖质中高度芳香化结构组分的来源，有利于提高堆肥的腐熟度，增
加土壤中的有机质含量。经过大量的实验探究和反复的实践验证，本发明的发明人终于发
现，本发明的微生物菌剂，在加快重金属转化、改善土壤结构等方面均有优异理想的效果，
从而完成了本发明。

[0022] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0023] 与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

[0024] 本发明的优点在于经济高效地处理了松针、秸秆等可能造成环境污染问题的固体废弃物，使之变废为宝，作为有益因子实现环境保护中的再利用，同时避免了二次污染问
题。此外，本发明制得的微生物菌剂兼具吸附能力与还原降解能力，在降解污染物、提升土
壤有机质含量方面都具有非常优异的效果。

具体实施方式

[0025] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。本领域的普通技术人员可以理解，以下实施例仅仅是举例说明的
目的，本发明的保护以后附的权利要求书所记载的为准。

[0026] 下面列举一些具体实施例，以对本发明的实施和技术效果做更进一步的说明。下述各实施例中，如无特别说明，所述百分比均指质量百分比。

[0027] 以下实施例中所用的菌株均均是公众可以获得，例如购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国微生物菌种查询网，北纳生物，中国农业微生物菌种保藏管理中心，或发
表于科技期刊，其它试剂包括氨基酸均是常规购自公司的试剂。

[0028] 实施例1

[0029] 1、微生物菌剂的制备方法：

[0030] (1)将腐败假单胞菌(S.putrefaciens，例如中国微生物菌种查询网，编号bio‑097659)、金属还原地杆菌(G.metallireducens，例如中国微生物菌种查询网，编号bio‑
091064)、海藻希瓦氏菌(S.alga，例如中国微生物菌种查询网，编号bio‑74287)、厌氧氨氧
化布罗卡德氏菌(B.anammoxidans，例如厌氧氨氧化菌的代谢途径及其关键酶的研究进展，
周英杰，王淑梅，张兆基，陈少华，《生态学杂志》，2012,31(3)；738‑744)于液体LB培养基内，
37℃、厌氧环境培养至OD600为0.6，将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)于液体LB培养基内，37℃、
好氧环境培养至OD600为0.5。

[0031] (2)收集腐败假单胞菌(S.putrefaciens) 、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌
(B.anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌体，冻干后按照2∶2∶1∶1∶3质量比的比
例混合，得到复合菌剂I。

[0032] (3)将复合菌剂与生物活性物质混合，得到复合菌剂II。具体配比为：复合菌剂I：葡萄糖：氨基酸质量比为60∶20∶20。

[0033] (4)将复合菌剂II固定于生物炭(400℃热解松针6h，过150目筛制得)上。将1.2g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 
7.0～7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为12％的复合菌剂II，调节转速至
‑1
170r.min ，温度至38℃，固定时间为16h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗2次，即获
得本发明所述微生物菌剂。

[0034] 2、将制得的微生物菌剂应用于湘潭市某矿区附近Cd污染农田土壤(52.69mg/kg)修复试验，以检测该微生物菌剂对Cd的还原能力。结果显示，按质量百分比添加15％本发明
所述微生物菌剂的Cd污染土壤，处理10天，较未添加的样品对Cd的去除率提高了32％，这表
明该微生物菌剂在促进重金属污染修复方面具有显著功效。

[0035] 实施例2

[0036] 1、微生物菌剂的制备方法：

[0037] (1)将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(B.anammoxidans)于液体LB培养基内，
35℃、厌氧环境培养至OD600为0.8，将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)于液体LB培养基内，35℃、
好氧环境培养至OD600为0.6。

[0038] (2)收集腐败假单胞菌(S.putrefaciens) 、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌
(B.anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌体，冻干后按照4∶4∶3∶3∶5质量比的比
例混合，得到复合菌剂I。

[0039] (3)将复合菌剂与生物活性物质混合，得到复合菌剂II。具体配比为：复合菌剂I：葡萄糖：氨基酸质量比为65∶20∶15。

[0040] (4)将复合菌剂II固定于生物炭(400℃热解松针5h，过180目筛制得)上。将1.2g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 
7.0～7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为10％的复合菌剂II，调节转速至
‑1
160r.min ，温度至35℃，固定时间为20h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获
得本发明所述微生物菌剂。

[0041] 2、将制得的微生物菌剂应用于湘潭市某矿区附近Cd和Cr污染农田土壤(Cd含量为48.31mg/kg，Cr含量为29.23mg/kg)修复试验，以检测该微生物菌剂对Cd和Cr的还原能力，
结果显示，按质量百分比添加15％本发明所述微生物菌剂的污染土壤，处理7天，较未添加
的样品对Cd和Cr的去除率分别提高了18％和15％，处理15天，较未添加的样品对Cd和Cr的
去除率分别提高了42％和37％，这表明该微生物菌剂在促进重金属复合污染修复方面具有
显著功效。

[0042] 实施例3

[0043] 1、微生物菌剂的制备方法：

[0044] (1)将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌(B.anammoxidans)于液体LB培养基内，
37℃、厌氧环境培养至OD600为0.9，将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)于液体LB培养基内，35℃、
好氧环境培养至OD600为0.7。

[0045] (2)收集腐败假单胞菌(S.putrefaciens) 、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、海藻希瓦氏菌(S.alga)、厌氧氨氧化布罗卡德氏菌
(B.anammoxidans)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌体，冻干后按照3∶3∶2∶2∶4质量比的比
例混合，得到复合菌剂I。

[0046] (3)将复合菌剂与生物活性物质混合，得到复合菌剂II。具体配比为：复合菌剂I：葡萄糖：氨基酸质量比为70∶15∶15。

[0047] (4)将复合菌剂II固定于生物炭(400℃热解松针4h，过200目筛制得)。将1g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～
‑1
7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为6％的复合菌剂II，调节转速至170r.min ，温
度至37℃，固定时间为19h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获得本发明所述
微生物菌剂。

[0048] 2、将制得的微生物菌剂应用于江西某铀矿附近U污染农田土壤(U含量为10.87mg/kg)修复试验，以检测该微生物菌剂对U的还原能力，结果显示，按质量百分比添加20％本发
明所述微生物菌剂的污染土壤，处理7天，较未添加的样品对U的去除率提高了31％，处理15
天，较未添加的样品对U的去除率分别提高了46％，这表明该微生物菌剂在促进重金属污染
修复方面具有显著功效。

[0049] 实施例4

[0050] 重复实施例1的实验，仅是将土壤中的重金属替换为Cu、Pb、Hg、Zn及组合，以检测该菌剂对重金属降解的促进能力。结果显示，按质量百分比添加20％所述菌剂、修复20天的
土壤中，数据参见下表

[0051]

[0052] 上述各实施例的实施和结果表明，本发明采用生物炭固定微生物菌剂修复重金属污染土壤，可以产生协同作用，提高土壤中的重金属污染去除效率，缩短了修复时间，且无
二次污染问题，也可大面积用于重金属复合污染场地，市场推广价值高，有极好的应用前
景。

[0053] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在
本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护
范围之内。