后发酵茶来源的新山柰酚类化合物

摘要

本说明书涉及从后发酵茶中分离的新化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物，该化合物能够广泛用于后发酵茶相关工业和可使用该化合物的各种领域。

权利要求

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为山柰酚‑3‑O‑[2‑O''‑(E)‑p‑香豆酰基] [β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的制造方法，其中使绿茶发酵，所述发酵通过后发酵方法来进行并且所述后发酵通过接种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来进行。

3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征在于，使绿茶发酵，然后将化合物从发酵的绿茶中分离。

说明书

后发酵茶来源的新山柰酚类化合物

技术领域

[0001] 本发明涉及后发酵茶来源的新山柰酚类化合物。

背景技术

[0002] 绿茶是以叶形式的粗茶或发酵茶而被饮用的，以感受更深的风味。发酵绿茶是指通过对绿茶叶进行氧化处理而获得的茶，包括使用茶叶中存在的氧化酶氧化的发酵茶和使用除茶叶中存在的酶之外的微生物发酵的后发酵茶。根据发酵的程度，发酵绿茶可分为轻发酵茶、半发酵茶和全发酵茶。例如，根据发酵的类型和程度，发酵绿茶被称为各种名称，例如绿茶、乌龙茶、红茶和普洱茶。

[0003] 在世界上中国和日本拥有后发酵茶的制造技术。在中国的有氧发酵茶中，使用真菌作为发酵菌株，其主要产地为云南省西双版纳自治州。在日本的有氧发酵茶中，使用真菌作为发酵菌株，富山是红茶的主要产地。在厌氧发酵茶中，使用厌氧乳杆菌(Lactobacillus Anaerobe)作为发酵菌株，其主要产地是阿波(Awa)。此外，还有红茶，其中使用厌氧真菌(Fungi Anaerobe)作为发酵菌株，其主要产地是石锤(Ishizuchi)。对于起源于中国普洱县的传统普洱茶，在收集绿茶叶时故意损伤绿茶叶，加热和烘烤绿茶叶，然后将适量的水添加至其中，使用空气中的微生物对绿茶叶进行自然发酵。在韩国，发酵茶在智异山和保宁以家庭手工艺品的形式间歇生产和消费。

[0004] 发酵茶不仅在风味方面与粗茶有所不同，而且根据具体的发酵过程和微生物的种类，其在活性成分的种类和含量方面也有很大差异。如上所述，由于可以从绿茶中生产和分离各种化合物，已经进行了各种尝试来使用绿茶分离和鉴定未知的新化合物。

[0005] 同时，山柰酚是类黄酮中的一种，并且已知在自然界中以各种植物中的次级代谢物的形式存在。

发明内容

[0006] 技术问题

[0007] 一方面，本发明的目的是从后发酵茶中发现新化合物并在工业上利用它。

[0008] 另一方面，本发明的目的是提供一种制造该新化合物的方法，从而提高该新化合物的工业实用性。

[0009] 解决方案

[0010] 为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种由以下化学式1表示的化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物：

[0011] [化学式1]

[0012]

[0013] 其中R1可以表示C15H9O6，R2可以表示C6H11O5，R3可以表示C9H7O2。

[0014] 另一方面，本发明还提供了制造该化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的方法。

[0015] 本发明的有益效果

[0016] 在本发明的一个方面，通过从后发酵茶中分离新化合物并在工业上利用该化合物，该化合物可广泛用于后发酵茶相关工业和可使用该化合物的各种领域，并且可满足相关消费者的需求。

附图说明

[0017] 图1展示了根据本发明的一方面的化合物的质谱图；

[0018] 图2展示了根据本发明的一方面的化合物的1H‑NMR(核磁共振)谱图；

[0019] 图3展示了根据本发明的一方面的化合物的13C‑NMR谱图；

[0020] 图4展示了根据本发明的一方面的化合物的1H‑13C HSQC(异核单量子相干)谱图；

[0021] 图5展示了根据本发明的一方面的化合物的1H‑13C HMBC(异核多键相干)谱图；

[0022] 图6展示了根据本发明的一方面的化合物对β淀粉样蛋白聚集的影响。

具体实施方式

[0023] 在本说明书中，“后发酵”包括使用除茶叶中存在的酶之外的微生物或物质的发酵。后发酵茶包括通过上述方法发酵的绿茶。

[0024] 在本说明书中，“级分”包括通过使用某些溶剂对特定物质或提取物进行分级而获得的级分、残留物以及通过使用特定溶剂对其再次提取而获得的级分。分级方法和提取方法可以是本领域技术人员已知的任何方法。

[0025] 在本说明书中，特别地，“异构体”不仅包括光学异构体(例如，基本纯的对映异构体、基本纯的非对映异构体或其混合物)，还包括构象异构体(即，仅在一个或多个化学键的角度上不同的异构体)、位置异构体(特别是互变异构体)或几何异构体(例如顺式‑反式异构体)。

[0026] 在本说明书中，“基本纯的”是指，在与例如对映异构体或非对映异构体结合使用的情况下，具有对映异构体或非对映异构体的特定化合物的存在量为约90％或更多，优选约95％或更多，更优选约97％或更多，或约98％或更多，甚至更优选约99％或更多，更优选约99.5％或更多(w/w)。

[0027] 在本说明书中，“药学上可接受的”是指人们认为，当以能够被或被政府或同等监管机构批准或在药典中列举或在其他一般药典中描述的常规药物剂量使用时，通过避免显著的毒性作用，某一物质可用于动物，更具体地说是人类。

[0028] 在本说明书中，“药学上可接受的盐”是指药学上可接受并且具有期望的母体化合物的药理活性的根据本发明的一方面的盐。所述盐可包括(1)利用无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；或利用有机酸形成的酸加成盐，有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3‑(4‑羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2‑乙烷‑二磺酸、2‑羟基乙磺酸、苯磺酸、4‑氯苯磺酸、2‑萘磺酸、4‑甲苯磺酸、樟脑磺酸、
4‑甲基二环[2,2,2]‑辛‑2‑烯‑1‑羧酸、葡庚糖酸、3‑苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和粘康酸；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子被取代时形成的盐。

[0029] 在本说明书中，“水合物”是指与水键合的化合物，是一种广义概念，包括水和化合物之间不存在化学键合力的包合物。

[0030] 在本说明书中，“溶剂化物”是指溶质的分子或离子与溶剂的分子或离子之间形成的高级化合物(higher order compound)。

[0031] 一方面，本发明提供了一种由以下化学式1表示的化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物：

[0032] [化学式1]

[0033]

[0034] 其中R1可以表示C15H9O6，R2可以表示C6H11O5，R3可以表示C9H7O2。

[0035] 根据一种实施方式，R1可以是由以下化学式2表示的化合物。

[0036] [化学式2]

[0037]

[0038] 根据另一种实施方式，R2可以是由以下化学式3表示的化合物。

[0039] [化学式3]

[0040]

[0041] R3可以是由以下化学式4表示的化合物。

[0042] [化学式4]

[0043]

[0044] 根据另一种实施方式，该化合物可以是山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]。该化合物可以由以下化学式表示。

[0045] [化学式5]

[0046]

[0047] 在本发明的一个方面，该化合物是未知的新物质，本发明人通过对后发酵茶的不断研究，发现并分离了该新物质。根据本发明的一个方面的化合物显示出抑制β淀粉样蛋白聚集的有用性(参见图6)。由于β淀粉样蛋白聚集等是临床上可应用于医学领域和与其相关的领域的性质，因此很明显该化合物可以在工业上使用。当进一步研究其有用性时，预期该化合物可用于各种工业领域。

[0048] 根据一方面，该化合物的含量可以占含有该化合物的组合物的总质量的0.01wt％或更多、0.05wt％或更多、0.1wt％或更多、0.2wt％或更多、0.3wt％或更多、0.4wt％或更多、0.5wt％或更多、0.7wt％或更多、0.9wt％或更多、1.0wt％或更多、1.3wt％或更多、1.5wt％或更多、1.7wt％或更多、2.0wt％或更多、2.2wt％或更多、2.5wt％或更多、2.8wt％或更多、3.0wt％或更多、3.3wt％或更多、3.5wt％或更多、3.8wt％或更多、4.0wt％或更多、
4.5wt％或更多、5.0wt％或更多、5.5wt％或更多、6.0wt％或更多、8.0wt％或更多、10wt％或更多、12wt％或更多、15wt％或更多或20wt％或更多。另外，该化合物的含量可以占含有该化合物的组合物的总质量的18wt％或更少、15wt％或更少、12wt％或更少、10wt％或更少、8.0wt％或更少、6.0wt％或更少、5.5wt％或更少、5.0wt％或更少、4.5wt％或更少、
4.0wt％或更少、3.8wt％或更少、3.5wt％或更少、3.3wt％或更少、3.0wt％或更少、2.8wt％或更少、2.5wt％或更少、2.2wt％或更少、2.0wt％或更少、1.7wt％或更少、1.5wt％或更少、
1.3wt％或更少、1.0wt％或更少、0.9wt％或更少、0.8wt％或更少、0.7wt％或更少、0.5wt％或更少、0.4wt％或更少、0.3wt％或更少、0.2wt％或更少、0.1wt％或更少、0.05wt％或更少或0.03wt％或更少。

[0049] 另一方面，本发明提供了一种制造该化合物、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的方法。该制造方法可以包括合成、从天然产物中分离等。

[0050] 根据一种实施方式，该制造方法可以是使绿茶发酵，然后将化合物从发酵的绿茶中分离。制造方法可包括用发酵生物接种绿茶叶、发酵接种的绿茶叶、使用热空气干燥发酵的绿茶叶、然后使干燥的绿茶叶陈化的步骤，以及陈化后通过提取和分级将化合物从陈化的绿茶叶中分离的步骤。

[0051] 提取和分级可以使用水、有机溶剂等进行，并且可以使用本领域技术人员已知的任何方法。

[0052] 根据另一方面，分级可以在提取之后进行，并且分级可以使用酮进行，并且分级可以通过再次使用醇(例如乙醇)来提取已使用酮分级的成分。所述酮可包括：丙酮、香芹酮、胡薄荷酮、异长叶烷酮、2‑庚酮、2‑戊酮、3‑己酮、3‑庚酮、4‑庚酮、2‑辛酮、3‑辛酮、2‑壬酮、3‑壬酮、2‑十一烷酮、2‑十三烷酮、甲基异丙基酮、乙基异戊基酮、亚丁基丙酮、甲基庚烯酮、二甲基辛烯酮、香叶基丙酮、法尼基丙酮、2,3‑戊二酮、2,3‑己二酮、3,4‑己二酮、2,3‑庚二酮、戊基环戊酮、戊基环戊烯酮、2‑环戊基环戊酮、己基环戊酮、2‑正庚基环戊酮、顺式茉莉酮、二氢茉莉酮、3,4‑二甲基‑1,2‑环戊二酮(methyl corylone)、2‑叔丁基环己酮、对叔丁基环己酮、2‑仲丁基环己酮、芹菜酮、氪(krypton)、对叔戊基环己酮、甲基环己烯基乙酮(methyl cyclocitrone)、神经酮(nerone)、4‑环己基‑4‑甲基‑2‑戊酮、氧化酮、乙基甲基羟基呋喃酮(emoxyfurone)、甲基萘基酮、α‑甲基茴香酰丙酮(α‑methyl anisalacetone)、茴香基丙酮、对甲氧基苯基丙酮、亚苄基丙酮、对甲氧基苯乙酮、对甲基苯乙酮、苯丙酮、苯乙酮、α‑王朝酮(α‑dynascone)、鸢尾香酮(iritone)、紫罗兰酮、假紫罗兰酮、甲基紫罗兰酮、甲基鸢尾香酮、2,4‑二叔丁基环己酮、烯丙基紫罗兰酮、2‑乙酰基‑3,3‑二甲基降冰片烷、马鞭草烯酮、葑酮(fenchone)、环十五烷酮、环十六烯酮等。所述酮可包括作为本领域常用的溶剂的所有酮及其混合物，所述酮可优选为丙酮。

[0053] 根据另一种实施方式，发酵可以通过后发酵方法来进行。后发酵可以通过菌株接种来进行。所述菌株可以是选自酵母属(Saccharomyces sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus  sp.)或肠系膜明串珠菌属(Leuconostoc mesenteroides  sp.)的菌株，并且可以优选地选自酿酒酵母(Saccharomyces 
cerevisiae)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgarius)或肠系膜明串珠菌(Leuconostoc 
mesenteroides)。

[0054] [实施例]

[0055] 下面，将参照实施例和实验实施例更详细地描述本说明书的结构和效果。然而，提供这些实施例仅用于说明目的以便于理解本说明书，本说明书的范围不受以下实施例的限制。

[0056] [实施例1]后发酵茶样品的制备

[0057] 将水加入由绿茶(Camellia sinensis var.Yabukita)叶子制成的绿茶中，并将水6
含量调节至40wt％。将5×10cfu/g的枯草芽孢杆菌接种在绿茶中，在50℃下发酵3天，然后在80℃下发酵4天。

[0058] 将陈化的茶样品粉碎15秒，然后使用筛孔尺寸为1mm的不锈钢筛进行筛分。随后，将50mg粉碎的茶样品置于1.5ml Eppendorf管中，向其中加入1ml去离子水，并将混合物在60℃的恒温水浴中以恒定速度搅拌30分钟，然后在25℃和13,000rpm下离心15分钟。从干燥的发酵绿茶提取物中仅分离出不溶于水的部分。

[0059] [实施例2]获得级分和分离化合物

[0060] 通过使用丙酮对150g后发酵茶样品进行分级来除去儿茶素衍生物和咖啡因，并获得浓缩有其它化合物的可溶性物质。通过硅胶柱色谱法，使用氯仿:甲醇混合物(5:1，v/v)作为溶剂来首先分离出40g可溶于丙酮的物质。

[0061] 通过高效逆流色谱法(HPCCC，Dynamic Extractions Ltd，英国)，分离出8.9g不含咖啡因的氯仿:甲醇(5:1，v/v)级分。此时使用的溶剂是正己烷‑TBME(甲基叔丁基醚)‑BuOH‑MeCN‑水(0.25:3:1:1:5，v/v)，流速设定为25ml/分钟。在上述条件下，总共得到10个亚级分，通过小容量HPCCC(Dynamic Extractions Ltd，英国)、HPLC(高效液相色谱法)、sephadex LH‑20柱(GE Healthcare Bio‑Sciences，瑞典)等分离每个级分中所含的组分。

[0062] 因此，可以从级分中分离出山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]，它是现有技术中未知1 13
的化合物，并通过H‑NMR和 C‑NMR(核磁共振光谱法)、UV(紫外光谱法)和ESI‑MS(电喷雾电
1 13
离质谱法)来鉴定每种化合物的结构。在H和 C核磁共振(NMR)的情况下，溶剂使用甲醇‑d3，仪器使用Bruker Advance DPX‑500(BRUKER，美国)。使用6200系列精确质量飞行时间(6200Series Accurate‑Mass Time‑of‑Flight,TOF)LC/MS(Agilent，美国)来获得每种化合物的质谱。

[0063] 分析结果已经证实，上述每种化合物均为山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]，其分子式为C42H46O22，分子量为902.2481，是现有技术中未知的新化合物。

[0064] 山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]的化学式和NMR数据如下。

[0065]

[0066] [表1]

[0067]

[0068]

[0069] 山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠1 13
李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]的质谱如图1所示，其 H‑NMR谱和 C‑NMR谱分别如图
2和图3所示，其HSQC(异核单量子相干)谱如图4所示，其HMBC(异核多键相干)谱如图5所示。

[0070] [实验实施例1]对β淀粉样蛋白聚集的抑制作用的实验

[0071] 通过荧光分析(硫磺素T试验)证实了山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]对β淀粉样蛋白聚集的抑制作用。

[0072] 具体地，获得了β淀粉样蛋白(Aβ1‑42，AnaSpec Inc.，美国)，以0.1mg/ml的浓度使用，并在使用前在‑80℃下储存。用DMSO分别稀释桑色素(20μM)、酚红(20μM)和山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷](1mg/ml)，以调节至所述浓度。

[0073] 为了详细说明对Aβ1‑42聚集的抑制程度，用50μL0.01M的磷酸钠缓冲液将以上述浓度制备的每种化合物稀释至浓度为10μM，然后向其中加入40μL0.1mg/ml的Aβ1‑42，然后向其中加入10μl 2mM的硫磺素T，并使用荧光光谱仪(RF‑5300PC，岛津公司，日本)在37℃下以5分钟的间隔测量荧光150分钟。

[0074] 结果示于下表2和图6中。

[0075] [表2]

[0076]

[0077] 在上表中，“RFU”表示相对荧光单位，“增加的RFU”表示聚集的β‑淀粉样蛋白的量，“增加的RFU(相对于阳性对照的百分比)”表示聚集的β‑淀粉样蛋白的量相对于阳性对照组的百分比值。“新物质33”表示山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]。

[0078] 换言之，当阳性对照组(用“阳性对照”表示，在不进行化合物处理的情况下，仅β淀粉样蛋白发生聚集)中的聚集取100％时，山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]与阳性对照组相比显示出23.0％的抑制聚集的作用。该结果表明，山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]显示出对β淀粉样蛋白聚集的抑制作用，其优于现有技术中已知的抑制剂桑色素(21.4％)和酚红(6.4％)的作用。因此，该化合物具有如上所述的有用性，因此可用于与其相关的各种工业领域。

[0079] [实验实施例2]累积皮肤刺激实验

[0080] 进行人重复性损伤性斑贴试验(HRIPT)，以确定山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]的累积皮肤刺激，并计算山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]可用于皮肤上的浓度范围。

[0081] 具体地，随机选择15名健康成年受试者，20μl含有0.5wt％、1wt％和3wt％的该化合物的测试组合物(除了化合物之外还含有乳化剂、稳定剂、纯净水等的皮肤组合物)滴在每个室(IQ室，Epitest Ltd，芬兰)中，并将斑贴贴在受试者的上背部右侧，然后在24小时后更换新的斑贴。在斑贴试验之前和之后检查皮肤反应，同时每周进行三次斑贴试验，因此以该方式三周总共进行九次，观察皮肤反应直到去除最后斑贴后48小时为止，并确定平均反应性。

[0082] 结果示于下表3中。

[0083] [表3]

[0084]

[0085]

[0086] 根据国际接触性皮炎研究组(ICDRG)的标准判断皮肤反应。在上表中，“新物质33”表示山柰酚‑3‑O‑[2‑O”‑(E)‑p‑香豆酰基][β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→3)‑O‑α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→6)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷]。换言之，该物质在所有含量范围内都表现出(‑)反应性(没有受试者显示±、+、++或+++反应性)。因此，可以看出，该物质可以安全地使用在皮肤上，不会对皮肤产生累积刺激。

[0087] 上面已经详细描述了本说明书的具体实施方式，对于本领域技术人员来说显而易见的是，该具体描述仅仅是优选实施方式，本说明书的范围不限于此。因此，本说明书的实际范围将由所附权利要求书及其等同物定义。