抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于微生物菌种改造领域。所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，生物量得到明显提高，与未改造地衣芽孢杆菌相比，自溶率降低了11.2％，在一定程度上改善了地衣芽孢杆菌菌体自溶现象，可有效的提高目标淀粉酶的发酵生产，具有良好的应用前景。

权利要求

1.抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，其特征在于，应用于淀粉酶及其制剂的生产；

所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述敲除pcf基因的方法为同源重组单交换方法；所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的培养基为添加质量百分比为0.1%葡萄糖、体积百分比为2.5%甘油的LB培养基；

所述地衣芽孢杆菌工程菌为地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) DL-1购自美国模式菌种收集中心(ATCC)菌种编号27811。

2.根据权利要求1所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，其特征在于，所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法包括：步骤1：提取地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）DL-1基因组DNA，以DNA为模板，设计上下游引物pcfF和pcfR，进行PCR扩增，获得pcf基因片段，pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2：提取pHT01质粒DNA，以该DNA为模板，设计上下游引物CmrF和CmrR，进行PCR扩增，获得氯霉素抗性Cmr基因片段，Cmr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤3：将步骤1制备得到的pcf基因片段与步骤2制备得到的Cmr基因片段，采用重叠延伸PCR进行融合，获得同源重组pcf-Cmr片段；

步骤4：将步骤3获得的同源重组pcf-Cmr片段，酶切，浓缩后，电转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞；

步骤5：将步骤4获得的感受态细胞，复苏后，涂布含氯霉素的琼脂固体培养基上，筛选具有氯霉素抗性的阳性重组菌，制得具有抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌。

3.根据权利要求2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，其特征在于，所述步骤1中，pcfF和pcfR引物序列为：pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATGpcfR：TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAACAGPCR扩增体系为：地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）DL-1基因组模板1.5 μL，上游引物pcfF 1.5 μL，下游引物pcfR1.5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O 20.5 μL，总体积50 μL；

PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸

20 s，30循环，72 ℃终延伸10 min；

所述步骤2中CmrF和CmrR引物序列为：

CmrF：CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACCmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGPCR 扩增体系为：pHT01质粒模板1.5 μL，上游引物CmrF 1.5 μL，下游引物CmrR 1.5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O 20.5 μL，总体积50 μL ；

PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸

40 s，30循环，72 ℃终延伸10 min。

4.根据权利要求2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，其特征在于，所述步骤3中，重叠延伸PCR所使用的引物为pcfF和CmrR；

重叠延伸PCR扩增分为初次PCR扩增和二次PCR扩增；

所述初次PCR扩增的体系为：pcf基因片段2 μL，Cmr基因片段2 μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，总体积25 μL；

初次PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，5循环，72 ℃终延伸5 min；

所述二次PCR扩增的体系为：在初次PCR扩增体系中补加如下试剂，上游引物pcfF 1.5 μL，下游引物CmrR 1.5 μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL；

所述二次PCR扩增的反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，

72 ℃延伸1 min，30循环，72 ℃终延伸10 min。

5.根据权利要求2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，其特征在于，所述步骤4中，酶切的体系及反应条件如下：pcf-Cmr同源重组片段20 μL，BamHⅠ内切酶2 μL，10×FastDigest Buffer 4μL，ddH2O 4μL，总体积30μL；37 ℃，酶切2 h，获得酶切后产物；

浓缩的步骤为：向酶切后的产物中，加入1/10体积3 mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20 min，12000 r/min离心5 min得DNA沉淀，加入70%乙醇重悬DNA沉淀，12000 r/min离心5 min除去乙醇，37 ℃风干，加入25μL ddH2O重悬，得到pcf-Cmr浓缩重组片段；

电转化的步骤为：将地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）DL-1感受态细胞与pcf-Cmr浓缩重组片段于冰上以10:1比例轻轻混匀，将混合物移入2 mm电转杯，2100 V、5 ms电转，然后立即加入1 mL RM培养基，37 ℃，180 r/min复苏4 h后涂布于含浓度25 μg/mL氯霉素的LB固体培养基中培养。

说明书

抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物菌种改造领域，具体涉及一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] 地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的生产菌种之一，能够发酵生产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶，在纺织、食品、医药等行业有广泛应用。

[0003] 酶高效生产最重要的条件之一就是高浓度的菌体，而本发明所涉及的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1合成酶能力强，但菌体易自溶，在进行目标酶高效表达的基因工程改造后，菌体自溶现象更加明显，菌体生长的稳定期及有效产酶时间缩短。为了保证生产菌株的连续高密度发酵，提高发酵生产效率，需要采取有效措施对菌体自溶进行控制。

[0004] 菌体自溶主要和外部环境以及菌体自身的某些特定的基因表达有关。基因表达调控是菌体自溶的一个关键性内因，其中，原噬菌体基因与芽孢杆菌菌体自溶关系密切，它以一种潜伏的形式整合在细菌基因组上，通常控制其表达的基因处于关闭状态，特定条件诱导后，它就会大量复制，最后将细菌裂解。PBLB是地衣芽孢杆菌中的一种原噬菌体，在正常情况下也会有少量复制，在丝裂霉素C等条件诱导下会进行大量复制，最终使地衣芽孢杆菌裂解自溶。

发明内容

[0005] 为解决地衣芽孢杆菌菌体存在自溶不足，本发明的目的在于提供一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

[0007] 本发明，一方面提供一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得，所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] PBLB的结构蛋白以及与裂解细胞壁相关的酶是由pcf因子控制表达的，通过对pcf基因进行敲除，结合营养条件控制可以抑制地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1菌体自溶，提高生物量的积累，提升发酵产物的生产能力。

[0009] 进一步的，所述敲除pcf基因的方法为同源重组单交换方法；所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的培养基为添加0.1％葡萄糖、2.5％甘油的LB培养基。

[0010] 另一方面，本发明还提供上述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括：

[0011] 步骤1：提取地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1基因组DNA，以DNA为模板，设计上下游引物pcfF和pcfR，进行PCR扩增，获得pcf基因片段，pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0012] 步骤2：提取pHT01质粒DNA，以该DNA为模板，设计上下游引物CmrF和CmrR，进行PCR扩增，获得氯霉素抗性Cmr基因片段，Cmr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

[0013] 步骤3：将步骤1制备得到的pcf基因片段与步骤2制备得到的Cmr基因片段，采用重叠延伸PCR进行融合，获得同源重组pcf-Cmr片段；

[0014] 步骤4：将步骤3获得的同源重组pcf-Cmr片段，酶切，浓缩后，电转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞；

[0015] 步骤5：将步骤4获得的感受态细胞，复苏后，涂布含氯霉素的琼脂固体培养基上，筛选具有氯霉素抗性的阳性重组菌，制得具有抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌。

[0016] 其中，所述步骤1中，pcfF和pcfR引物序列为：

[0017] pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG

[0018] pcfR：TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAA-

[0019] CAG

[0020] PCR扩增体系为：(B.licheniformis)DL-1基因组模板1.5μL，上游引物pcfF1.5μL，下游引物pcfR1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 20.5μL，总体积50μL；

[0021] PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30循环，72℃终延伸10min。

[0022] 其中，所述步骤2中CmrF和CmrR引物序列为：

[0023] CmrF：CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTC-

[0024] AC

[0025] CmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG

[0026] PCR扩增体系为：pHT01质粒模板1.5μL，上游引物CmrF 1.5μL，下游引物CmrR 1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 20.5μL，总体积50μL；

[0027] PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30循环，72℃终延伸10min。

[0028] 其中，所述步骤3中，重叠延伸PCR所使用的引物序列为pcfF和CmrR；

[0029] 重叠延伸PCR扩增分为初次PCR扩增和二次PCR扩增；

[0030] 所述初次PCR扩增的体系为：pcf基因片段2μL，Cmr基因片段2μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL，总体积25μL；

[0031] 初次PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，5循环，72℃终延伸5min；

[0032] 所述二次PCR扩增的体系为：在初次PCR扩增体系中补加如下试剂，上游引物pcfF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH2O9.5μL；

[0033] 所述二次PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸10min。

[0034] 其中，步骤4中，酶切的体系及反应条件如下：

[0035] pcf-Cmr同源重组片段20μL，BamHⅠ内切酶2μL，10×FastDigest Buffer4μL，ddH2O 4μL，总体积30μL；37℃，酶切2h，获得酶切后产物；

[0036] 浓缩的步骤为：向酶切后的产物中，加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min离心5min得DNA沉淀，加入70％乙醇重悬DNA沉淀，12000r/min离心5min除去乙醇，37℃风干，加入25μL ddH2O重悬，得到pcf-Cmr浓缩重组片段；

[0037] 电转化的步骤为：将(B.licheniformis)DL-1感受态细胞与pcf-Cmr浓缩重组片段于冰上以10:1比例轻轻混匀，将混合物移入2mm电转杯，2100V、5ms电转，然后立即加入1mL RM培养基，37℃，180r/min复苏4h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基中培养。

[0038] 进一步的，所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，还包括步骤6：将步骤5制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种到营养条件不同的培养基上，进行营养优化培养。

[0039] 进一步的，接种量为单菌落/50ml培养基，培养条件为37℃，200r/min培养24h；所述培养基分别为含质量百分比为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％甘油的LB培养基；

[0040] 含质量百分比为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％葡萄糖的LB培养基；

[0041] 含质量百分比为0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％葡萄糖的LBG培养基；

[0042] 含质量百分比为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％甘油的LBP培养基；

[0043] 所述LB培养基由以下质量百分比组分组成：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％；用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0；

[0044] 所述LBG培养基由以下组分组成：蛋白胨1％(质量百分比)、酵母浸粉0.5％(质量百分比)、氯化钠1％(质量百分比)、甘油1％(体积百分比)，用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0；

[0045] 所述LBP培养基由以下质量百分比组分组成：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.1％；用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0。

[0046] 优选的，所述培养基为含质量百分比为2.5％甘油的LBP培养基。

[0047] 再一方面，本发明还提供上述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用，应用于淀粉酶及其制剂的生产。

[0048] 本发明具有以下有益效果：

[0049] 本发明首次公开了一种地衣芽孢杆菌自溶相关基因pcf敲除与营养条件结合控制菌体自溶，提高菌体生物量的方法，将重叠的pcf-Cmr片段电转化至B.licheniformisDL-1感受态细胞，仅通过一次同源单交换实现对pcf基因快速敲除，成功获得pcf基因缺失菌株B.licheniformis DL-1Δpcf，在无优化营养条件下重组菌自溶率降低了11.2％，证实通过pcf基因敲除可以控制菌体自溶率；

[0050] 通过优化营养条件，出发菌株与重组菌株菌体自溶率分别降低52.6％与56.3％，重组菌通过自溶基因敲除结合营养条件控制可以进一步提高生物量，降低自溶率，自溶率最大降低71.2％，敲除自溶基因结合营养条件控制可使地衣芽孢杆菌菌体生物量得到提高，有利于高浓度菌体获得；

[0051] 本发明提供的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌在产α-淀粉酶培养基中培养，酶活较未改造菌株提高了19.1％，该方法有益于地衣芽孢杆菌类酶制剂生产菌株的遗传育种及工业化生产。

附图说明

[0052] 图1为本发明实施例1中制备得到的pcf基因片段琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DNA Maker，泳道2～4为pcf基因条带，大小418bp；

[0053] 图2为本发明实施例1制备得到的Cmr基因片段琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DNA Maker，泳道2～4为Cmr基因条带，大小1245bp；

[0054] 图3为本发明实施例1制备得到的pcf-Cmr基因片段琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DNA Maker，泳道2～4为pcf-Cmr基因条带，大小1663bp；

[0055] 图4为实施例5鉴定抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌pcf-Cmr基因片段琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DNA Maker，泳道2～3为pcf-Cmr基因条带；

[0056] 图5为本发明实施例6中未经改造的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DL-1)培养基营养条件与菌体自溶的关系图，其中图(a)为未经改造的地衣芽孢杆菌接种于LB添加不同比例(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％)葡萄糖培养基生长曲线；图(b)为未经改造的地衣芽孢杆菌接种于LB添加不同比例(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％)甘油培养基生长曲线；图(c)为未经改造的地衣芽孢杆菌接种于LBG添加不同比例(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％)葡萄糖培养基生长曲线；图(d)为未经改造的地衣芽孢杆菌接种于LBP添加不同比例(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％)甘油培养基长曲线；

[0057] 图6为实施例6中本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌(B.licheniformis DL-1Δpcf)的培养基营养条件与菌体自溶的关系图，其中图(a)为本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种于LB添加不同比例(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％)葡萄糖培养基生长曲线；图(b)为本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种于LB添加不同比例(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％)甘油培养基生长曲线；图(c)为本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种于LBG添加不同比例(0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1.0％)葡萄糖培养基生长曲线；图(d)为本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种于LBP添加不同比例(0.5％、
1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％)甘油培养基长曲线；

[0058] 图7中(a)、(b)、(c)为未经改造的地衣芽孢杆菌与本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌在不同营养培养基中的生长曲线；(a)图为在LB培养基中的生长曲线，(b)图为在LBG添加0.1％葡萄糖培养基中的生长曲线；(c)图为在LBP添加2.5％甘油培养基中的生长曲线；

[0059] 图8为实施例7中对未经改造的地衣芽孢杆菌与本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌α-淀粉酶酶活测定结果。

具体实施方式

[0060] 为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

[0061] 除特殊说明，本发明所用组分均为市售产品。

[0062] 本发明中采用的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DL-1)购自美国模式菌种收集中心(ATCC)菌种编号27811；pHT01质粒购买于杭州宝赛生物科技有限公司。

[0063] 本发明提供一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，能够有效改善地衣芽孢杆菌菌体自溶现象。

[0064] 实施例1

[0065] 同源重组pcf-Cmr基因片段的制备

[0066] 采用DNA提取试剂盒提取B.licheniformis DL-1基因组，根据pcf基因核苷酸序列设计上、下游引物，以B.licheniformisDL-1基因组为模板，进行pcf基因PCR扩增，上下游引物核苷酸序列如下，其中下划线为BamHⅠ保护碱基及酶切位点：

[0067] pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG

[0068] pcfR：TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAACAG

[0069] PCR扩增体系：

[0070] B.licheniformis DL-1基因组模板1.5μL，上游引物pcfF 1.5μL，下游引物pcfR1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 20.5μL，总体积50μL；

[0071] PCR扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30循环，72℃终延伸10min。

[0072] 1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，400bp左右出现特异性条带，结果见图1，表明成功获得418bp的pcf同源片段，将PCR产物pcf同源片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，所得DNA直接进行下一步实验或-20℃保存。

[0073] 采用DNA提取试剂盒提取含氯霉素抗性pHT01质粒DNA，根据Cmr基因核苷酸序列设计上、下游引物，以pHT01质粒为模板，进行Cmr基因PCR扩增，上下游引物核苷酸序列如下，其中下划线为BamHⅠ保护碱基及酶切位点：

[0074] CmrF：CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAC

[0075] CmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG

[0076] PCR扩增体系：

[0077] pHT01质粒DNA模板1.5μL，上游引物CmrF 1.5μL，下游引物CmrR 1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 20.5μL，总体积50μL；

[0078] PCR扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，30循环，72℃终延伸10min。

[0079] 1％琼脂糖凝胶电泳检测，1200bp左右出现特异性条带，结果见图2，表明成功获得1245bp的Cmr片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，所得DNA直接进行下一步实验或-20℃保存。

[0080] 将胶回收获得的pcf基因片段、Cmr基因片段，通过重叠延伸PCR进行融合，获得pcf-Cmr同源重组片段，重叠延伸PCR所使用的引物核苷酸序列如下，其中下划线为BamHⅠ保护碱基及酶切位点：

[0081] pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG

[0082] CmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG

[0083] 重叠延伸PCR扩增共分初次PCR和二次PCR扩增；

[0084] 初次PCR扩增体系：

[0085] pcf片段2μL，Cmr片段2μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL，总体积25μL；

[0086] 初次PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，5循环，72℃终延伸5min。

[0087] 所述二次PCR扩增的体系为：在初次PCR扩增体系中补加如下试剂，上游引物pcfF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL；

[0088] 所述二次PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸10min。

[0089] 1％琼脂糖凝胶电泳检测，1600bp左右出现特异性条带结果见图3，表明成功获得1663bp同源重组片段pcf-Cmr，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，所得DNA直接进行下一步实验或-20℃保存。

[0090] 实施例2

[0091] 同源重组pcf-Cmr基因片段的酶切及浓缩

[0092] 利用BamHⅠ内切酶对步骤1制备得到的胶回收pcf-Cmr融合片段进行单酶切，其酶切体系及条件如下：

[0093] pcf-Cmr同源重组片段20μL，BamHⅠ内切酶2μL，10×FastDigest Buffer 4μL，ddH2O 4μL，总体积30μL；37℃，酶切2h。

[0094] 对酶切后的pcf-Cmr融合片段，进行浓缩，浓缩步骤如下：

[0095] 向酶切后的产物中，加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min离心5min得DNA沉淀；加入70％乙醇重悬DNA沉淀，12000r/min离心5min除去乙醇，37℃风干，加入25μLddH2O重悬，制得300ng/μL的pcf-Cmr浓缩DNA溶液，直接进行下一步实验或或-20℃保存。

[0096] 实施例3

[0097] B.licheniformis DL-1感受态细胞的制备

[0098] 将B.licheniformis DL-1划线于LB固体平板培养基上，37℃培养24h，挑取单菌落接种50mL LB培养基，37℃、200r/min培养18h传代两次；取二代活化的菌液2mL转接50mLGM(菌体增殖培养基)中，使初始菌液OD600＝0.15，培养至OD600＝0.90；将菌液倒入预冷的50mL离心管中，10min，4℃，5000r/mim离心10min，收集菌体；用预冷的20mL ETM(电转缓冲液)电转缓冲液洗涤3次后，ETM重悬、分装，即为制备好的感受态细胞。

[0099] 其中，涉及到的培养基，其组分如下：

[0100] LB培养基由以下重量百分比组分组成：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，pH7.0。

[0101] GM(菌体增殖培养基)由以下质量百分比组分组成：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，山梨醇9.1％，pH7.0。

[0102] ETM(电转缓冲液)：山梨醇9.1％(质量百分比)，甘露醇9.1％(质量百分比)，10％甘油(体积百分比)。

[0103] 实施例4

[0104] pcf-Cmr同源重组片段的电转化

[0105] 将实施例3制备的B.licheniformisDL-1感受态细胞与实施例2制备得到的pcf-Cmr重组基因片段置于冰上以10:1比例轻轻混匀，将混合物移入2mm电转杯，2100V、5ms电转，然后立即加入1mL RM培养基，37℃，180r/min复苏4h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基中培养。

[0106] RM(菌体复苏培养基)由以下质量百分比组分组成：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，山梨醇9.1％，甘露醇6.9％，调整其pH为7.0。

[0107] 实施例5

[0108] 抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌(B.licheniformis DL-1Δpcf)的阳性筛选与鉴定

[0109] 挑取实施例4制备得到的LB固体培养基单菌落，接种到含氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200r/min培养24h，采用DNA提取试剂盒提取液体培养基中的菌体DNA，以以提取的基因组为模板，pcfF与CmrR为引物，进行PCR扩增。

[0110] 所述涉及的上下游引物核苷酸序列如下，其中下划线为BamHⅠ保护碱基及酶切位点：

[0111] pcfF：CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATG

[0112] CmrR：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGG

[0113] PCR扩增体系：提取菌体基因组模板1.5μL，上游引物pcfF1.5μL，下游引物CmrR1.5μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL；

[0114] PCR扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30循环，72℃终延伸10min。

[0115] 扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果见图4，基因扩增片段大小为1663bp，表明已成功获得具有pcf-Cmr重组基因片段的地衣芽孢杆菌工程菌。

[0116] 实施例6

[0117] 营养条件与菌体自溶率的关系探索

[0118] 将未经改造的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DL-1)与本发明制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌(B.licheniformis DL-1Δpcf)分别接种到不同营养组分的100ml培养基中，37℃，200r/min培养，每隔4～6h分别取样测定菌液OD600，以菌体浓度来衡量B.licheniformis DL-1菌体自溶情况。

[0119] 培养基的组分配方如下表所示：

[0120]

[0121] 注：√表示添加，/表示未添加。

[0122] 其中，LBG培养基：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％(均为质量分数)、甘油1％(体积分数)，pH 7.0。

[0123] LBP培养基：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.1％(均为质量分数)。

[0124] 经过上述不同营养组分培养基的摸索，由图5、图6可知，本发明制备出的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌(B.licheniformis DL-1Δpcf)与未经改造的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis DL-1)生长曲线一致，均最适于添加有2.5％甘油的LBP培养基生长，与常规LB培养基培养相比，出发菌株与重组菌株菌体自溶率分别降低52.6％与56.3％；由图6-(d)可知重组菌通过自溶基因敲除结合营养条件控制可以进一步提高生物量，降低自溶率，自溶率最大降低71.2％(计算公式＝(OD600max1-OD600max2)/OD600max2，其中，OD600max1为B.licheniformis DL-1Δpcf在最适营养条件下600nm的最大吸光度值；
OD600max2为B.licheniformis DL-1在LB培养基条件下600nm的最大吸光度值)[0125] 由图7-(a)可知，在普通LB培养基培养条件下，本发明制备的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌比未改造的地衣芽孢杆菌的菌体自溶率降低了11.2％；由图7-(b)可知，在LBG添加0.1％葡萄糖培养基培养条件下，本发明制备的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌比未改造的地衣芽孢杆菌的菌体自溶率降低了12.8％；由图7-(c)可知，在LBP添加2.5％甘油培养基培养条件下，本发明制备的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌比未改造的地衣芽孢杆菌的菌体自溶率降低了13.3％。

[0126] 由上述数据可知，通过pcf基因敲除获得抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌与培养基营养条件相结合，对B.licheniformis DL-1菌体自溶控制具有协同叠加效应，且最佳的营养条件为LB添加0.1％葡萄糖、2.5％甘油(即LBP培养基+2.5％甘油)。

[0127] 实施例7

[0128] B.licheniformis DL-1与本发明制备的B.licheniformis DL-1Δpcfα-淀粉酶酶活测定

[0129] 将B.licheniformis DL-1和重组菌株B.licheniformis DL-1Δpcf以2％接种量接种于发酵培养基，37℃、200r/min培养，每隔12h取样，4℃、12000r/min离心8min取上清，按照国标GB/T24401-2009所示方法测定淀粉酶酶活。

[0130] 所述发酵培养基由以下质量百分比组分组成：

[0131] 可溶性淀粉2％、蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.1％、甘油2.5％，pH 7.0。

[0132] α-淀粉酶活力定义：1ml液体酶，于70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

[0133] α-淀粉酶酶活测定结果见图8，由该图可知B.licheniformis  DL-1与B.licheniformis DL-1Δpcf均在发酵至48h酶活达到最大，分别为340U/mL和405U/mL，最大酶活提高了19.1％。通过酶活测定可以确定本发明制备的pcf基因缺失的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌，有利于α-淀粉酶酶活的提高。

[0134] 本发明首次公开了一种地衣芽孢杆菌自溶相关基因pcf敲除与营养条件结合控制菌体自溶，提高菌体生物量的方法，将重叠的pcf-Cmr片段电转化至B.licheniformisDL-1感受态细胞，仅通过一次同源单交换实现对pcf基因快速敲除，成功获得pcf基因缺失菌株B.licheniformisDL-1Δpcf。重组菌自溶率较出发菌降低11.2％，证实通过pcf基因敲除可以控制菌体自溶率；重组菌通过自溶基因敲除结合营养条件控制可以提高生物量，降低自溶率，自溶率最大降低71.2％。敲除自溶基因结合营养条件控制可使地衣芽孢杆菌菌体生物量得到提高，有利于高浓度菌体获得；重组菌在产α-淀粉酶培养基中培养，酶活较出发菌株提高19.1％，该方法有益于地衣芽孢杆菌类酶制剂生产菌株的遗传育种及工业化生产。

[0135] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。