淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用。本发明的淀粉酶突变体ZDAMYA，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的突变酶酶活力由比野生型提高53％；突变后催化效率较野生型相比提高了1.52倍。因此，本发明提供的淀粉酶突变体能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.淀粉酶突变体ZDAMYA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.淀粉酶突变体ZDAMYA基因，其特征在于，编码权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA。

3.根据权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）用包含淀粉酶突变体ZDAMYA编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导表达淀粉酶突变体ZDAMYA；

（3）分离并纯化淀粉酶突变体ZDAMYA。

7.权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA的用于水解淀粉的应用。

8.权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA在食品、饲料和/或纺织工业领域中的应用。

说明书

淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 淀粉酶是水解淀粉分子内的α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键得到葡萄糖、寡糖或者糊精等产物的一类酶。淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的水解作用，因此可以迅速将淀粉水解，使其粘度降低，流动性增高，利于淀粉的糖化。啤洒是最早用酶酿造的产品之一，在啤洒酿造中添加淀粉酶可使淀粉快速液化以取代一部分麦芽，从而降低成本。此外，淀粉酶还普遍应用在医药、洗涤剂、焙烤、酒精工业、饲料以及纺织等行业。

[0003] 高水解活力的淀粉酶在生产应用过程中有很大的优势，可以节约投资，提高产率，或作为饲料添加剂提高动物对营养物质的吸收效率。目前，国内外已经克隆表达出很多新型的淀粉酶，但这些酶在某些性质上存在一些缺点，从而限制其应用。例如，水解能力差、在酸性条件下稳定性差，或高温条件下稳定性不好等。虽然可以通过定向进化及理性分子改造方法获得淀粉酶工程菌株，但是进化的突变体的性状往往不可控制。因此，找到新的能够满足实际应用需求的淀粉酶，进一步推广其在饲料、食品、医药等行业中应用是产业上的迫切需求。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种淀粉酶突变体ZDAMYA。

[0005] 本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的编码基因。

[0006] 本发明的再一目的在于提供包含上述淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体。

[0007] 本发明的再一目的在于提供包含上述淀粉酶突变体ZDAMYA的重组菌株。

[0008] 本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的制备方法。

[0009] 本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的应用。

[0010] 根据本发明具体实施方式的野生型淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

[0011]

[0012]

[0013] 根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA，将野生型淀粉酶氨基酸序列进行S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K突变，得到的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

[0014]

[0015] 根据本发明具体实施方式的野生型淀粉酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：

[0016]

[0017]

[0018] 根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体编码基因ZDAMY，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：

[0019]

[0020]

[0021] 根据本发明具体实施方式的含有淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体，优选为pHYP16-ZDAMY。

[0022] 根据本发明具体实施方式的含有淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组菌株，菌株优选为SCK6/ZDAMY。

[0023] 根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA的方法，所述方法包括以下步骤：

[0024] (1)用包含淀粉酶突变体ZDAMYA编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

[0025] (2)培养重组菌株，诱导表达淀粉酶突变体ZDAMYA；

[0026] (3)分离并纯化淀粉酶突变体ZDAMYA。

[0027] 根据本发明的具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA的应用，尤其是在食品、医药饲料和/或纺织工业领域中的应用。

[0028] 本发明的淀粉酶突变体ZDAMYA的比活为10480U/mg，较野生型的6835U/mg提高了53％；野生型淀粉酶的Km值为3.578mg/mL，淀粉酶突变体ZDAMYA的Km值为2.498mg/mL；突变后催化效率由1577mL/s/mg升高至3908mL/s/mg，较野生型提高了1.48倍。70℃处理30min，野生型剩余92％酶活，淀粉酶突变体剩余91％酶活。因此，本发明提供的淀粉酶突变体能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0029] 图1显示淀粉酶在枯草芽孢杆菌SCK6中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，1：野生型纯化后蛋白质条带，2：突变体纯化后蛋白质条带，M：蛋白Marker；

[0030] 图2显示野生型及突变体淀粉酶学性质；其中，A显示野生型和突变体的最适温度；B显示野生型和突变体的最适pH；C显示野生型和突变体在70℃稳定性情况；D显示野生型和突变体在80℃稳定性情况。

具体实施方式

[0031] 试验材料和试剂

[0032] 1、菌株及载体：表达宿主Bacillus subtilis SCK6，表达质粒载体pHYP16-ZDAMY。

[0033] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司。

[0034] 3、培养基：

[0035] LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；

[0036] 淀粉培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，1％淀粉，1.5％琼脂，pH 7.0。

[0037] 实施例1定点突变淀粉酶编码基因

[0038] 将突变位点设计为S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K。通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因淀粉酶。所用引物如表1所示：

[0039] 表1突变体淀粉酶特异性引物

[0040]

[0041] 测序结果表明，上述点突变扩增得到具有序列表中SEQ ID No.4的核苷酸序列，共1545bp，该编码区序列编码序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，共515个氨基酸残基。
将该具有序列表中SEQ ID No.4中的核苷酸序列的片段命名为突变体基因ZDAMY；将具有序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白命名为淀粉酶突变体ZDAMYA。

[0042] 实施例2制备淀粉酶突变体ZDAMYA

[0043] 2.1获得重组质粒pHYP16-ZDAMY

[0044] 分别扩增得到载体及目的片段，将二者回收后，按合适的比例混合，加入PCR体系中进行构建，获得含有所述淀粉酶基因的重组质粒。以构建好的野生型质粒作为模板，利用点突变试剂盒引入突变碱基，将上述所得重组质粒送去测序，验证序列的正确性。将所得质粒中插入的外源基因的序列为SEQ ID No：4第1-1545位核苷酸的重组质粒，命名为pHYP16-ZDAMY。

[0045] 2.2获得重组菌SCK6/ZDAMY

[0046] 将重组质粒pHYP16-ZDAMY转化芽孢杆菌SCK6细胞，获得重组菌株SCK6/ZDAMY。

[0047] 2.3制备淀粉酶突变体

[0048] 取上述重组芽孢菌株SCK6/ZDAMYA菌株，接种于50mL培养基的100mL三角瓶中，置于37℃，220rpm摇床培养24h；后将培养液转接于200mL培养基的1L三角瓶中，并再次置于37℃，220rpm条件下培养。离心后收集上清回收和亲和层析纯化淀粉酶突变体ZDAMYA，SDS-PAGE电泳结果如图1所示。

[0049] 实施例3比较淀粉酶突变体ZDAMYA和野生型的性质

[0050] 3.1分析比较酶活

[0051] 采用紫外分光光度计法对淀粉酶酶活进行测定。具体方法如下：在给定条件下进行酶促反应，酶促反应体系为：1mL的反应体系，包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，在一定温度及pH条件下反应20min。在540nm波长处测定吸光度值，计算酶活。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，单位时间内生成1μmol的葡萄糖所需的酶量。

[0052] 将上述实施例2制备的突变体淀粉酶纯化后，在pH 7.0，60℃下测定酶活；野生型淀粉酶在pH 7.0，55℃下进行酶促反应以测定其酶活性。

[0053] 酶活测定结果如图2所示，野生型的酶淀粉酶活力为6835U/mg，淀粉酶突变体的酶活力为10480U/mg。如图2中A所示,野生型最适温度55℃，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K最适温度60℃。如图2中B所示，野生型和突变体的最适pH均为6.0，pH 4-9突变体的酶活均高于野生型。如图2中C所示，70℃处理30min，野生型剩余92％酶活，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K剩余91％酶活。如图2中D所示，80℃处理60min，野生型剩余38％酶活，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K剩余20％酶活。

[0054] 3.2测定动力学常数

[0055] 野生型淀粉酶在pH 7.0，55℃下进行酶促反应以测定其酶活性；突变体在pH 7.0，60℃下测定酶活，测定方法如下：

[0056] 所述野生型和突变体的动力学常数测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)缓冲液体系在55℃或60℃下反应10min，进行剩余酶活性测定。结果如表2所示：

[0057] 表2野生型和突变体的酶活性质

[0058]

[0059] 结果如表2所示，野生型的酶活6835U/mg，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K比活为10480U/mg，比野生型提高了53％；野生型的Km值为3.578mg/mL，突变后S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K的Km值为2.498mg/mL；突变后催化效率由1577mL/s/mg升高至3908mL/s/mg，较野生型相比提高了1.48倍。