利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法

摘要

利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7‑表紫杉醇的方法，将碳酸氢盐溶解在无菌水中，等体积加入到紫杉醇的乙腈溶液中。于60℃反应30分钟，产物经纯化鉴定确定为7‑表紫杉醇。本发明采用廉价的碳酸氢盐作为反应物，降低反应成本；选择乙腈/水为反应溶剂，中温反应，可防止紫杉醇和7‑表紫杉醇进一步分解。当碳酸氢钾/紫杉醇浓度比为10:1时，转化效率大于80％。本发明对大量生产7‑表紫杉醇有很高的指导意义。

权利要求

1.一种利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法，其特征是，包括以下工艺步骤：(1)将碳酸氢盐溶于无菌水中震荡混匀，配制成浓度为0.02-10g/L的溶液；

(2)将紫杉醇标品溶解在无水乙腈中，配制成浓度为0.1-10g/L的溶液；

(3)将配制好的碳酸氢盐溶液和紫杉醇溶液等体积混合均匀；

(4)将反应体系加热到40-60℃，恒温反应30-60min；

(5)用制备型HPLC或硅胶柱层析对反应产物进行纯化，得到终产物7-表紫杉醇；

(6)当反应时间为0-20min时，紫杉醇转化效率不能达到最高；20-30min时，反应趋于平衡，30-60min时转化效率不变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的碳酸氢盐为碳酸氢钾或碳酸氢钠；以及在溶剂中能够转化为碳酸氢根的化合物碳酸钾或碳酸钠。

说明书

利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种简单、低成本的从紫杉醇转化到7-表紫杉醇的方法。

背景技术

[0002] 7-表紫杉醇是一种C-7异构化的紫杉醇异构体。7-表紫杉醇最早由Huang等从日本红豆杉树皮中分离得到[1]，是有抗肿瘤活性的紫杉二萜类化合物。其对VA-13、HepG2等肿瘤细胞毒性与紫杉醇相当，但是对于鼻咽癌KB、白血病L1210等肿瘤细胞毒性明显强于紫杉醇[2,3]。

[0003] 目前，7-表紫杉醇主要从红豆杉组织中提取获得，然而，红豆杉紫杉烷提取物中7-表紫杉醇含量不到2％，产量非常低，且生产成本很高。如CN201310098948号发明专利公开的《红豆杉活性提取物的提取方法》，以及CN201310099148号发明专利公开的《红豆杉紫杉醇活性提取物的提取方法》，两个专利所公开的都是一种“紫杉醇”的提取方法，且两个专利中均明确避免“降解或异构生成其它紫杉烷类物质”。另外，CN201010182864号发明专利公开了《一种分离10-去乙酰紫杉醇酰化产物制备紫杉醇的方法》，该方法“以10-去乙酰紫杉醇为半合成前体酰化后的产物作为原料”，经过分离制备紫杉醇，该专利同样是以制备紫杉醇为目的，且尽量分离去除如“7-表紫杉醇”等的其它紫杉烷类物质。到目前为止还没有发现关于“7-表紫杉醇”的制备方法的公开报道。

[0004] 所以，有必要对现有方法进行改进，以更有效地获得7-表紫杉醇。

发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种简单且低成本的从紫杉醇转化获得7-表紫杉醇的方法，该方法条件温和，没有副产物，且得率高。

[0006] 本发明的技术方案：

[0007] 利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法，步骤如下：

[0008] (1)将碳酸氢盐溶于无菌水中震荡混匀，配制成浓度为0.02-10g/L的溶液；

[0009] (2)将紫杉醇标品溶解在无水乙腈中，配制成浓度为0.1-10g/L的溶液；

[0010] (3)将配制好的碳酸氢盐溶液和紫杉醇溶液等体积混合均匀(如溶液分层，不影响后续反应的进行)；

[0011] (4)将反应体系加热到40-60℃，恒温反应30-60min；

[0012] (5)用制备型HPLC或硅胶柱层析对反应产物进行纯化，得到终产物7-表紫杉醇。

[0013] 所述的碳酸氢盐为碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸钠。

[0014] 本发明的优点和有益效果：

[0015] 本发明采用中温反应，防止紫杉醇母环降解；采用廉价的碳酸氢盐作为反应物，降低反应成本；选择乙腈/水为反应溶剂，可以防止紫杉醇和7-表紫杉醇进一步分解；该反应产物单一，除反应物外，只有一个新的产物；纯化方法简单，紫杉醇和7-表紫杉醇极性差异较大，用硅胶柱或制备型HPLC均可达到纯化的目的。经过实验发现，增加碳酸氢盐/紫杉醇浓度比可以增加转化效率，如碳酸氢钾/紫杉醇浓度比为10:1时，转化效率大于80％。本发明为大量生产7-表紫杉醇有很高的指导意义。

附图说明

[0016] 图1是紫杉醇在乙腈溶液中被碳酸氢钾转化为7-表紫杉醇及产物纯化后的HPLC图。(a)，紫杉醇标准品的HPLC图，说明紫杉醇的纯度合格；(b)碳酸氢钾和紫杉醇反应后HPLC图，说明紫杉醇被转化成另外一种化合物；(c)用制备型HPLC将转化后的化合物分离出来进行HPLC检测，该图说明纯化后产物纯度很好。

[0017] 图2-图5分别是7-表紫杉醇结构鉴定核磁氢谱、核磁碳谱、HSQC二维谱和HMBC二维谱，说明紫杉醇转化后的化合物为7-表紫杉醇。

[0018] 图6紫杉醇转化为7-表紫杉醇反应机理。

具体实施方式

[0019] 实施例1：

[0020] 利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法，步骤如下：

[0021] (1)将碳酸氢钾溶于无菌水中配制成10g/L溶液，震荡混匀。

[0022] (2)将紫杉醇标品溶解于无水乙腈中配制成10g/L溶液。

[0023] (3)将配制好的碳酸氢盐溶液和紫杉醇溶液各1mL混合均匀(如溶液分层，不影响后续反应的进行)。

[0024] (4)将反应体系加热到40℃，恒温反应60min。

[0025] (5)用分析型HPLC分析反应产物，并用制备型HPLC将紫杉醇转化后化合物分离出来(图1)。

[0026] (6)对纯化后的化合物进行核磁分析(图2-图5)，鉴定结构为7-表紫杉醇(图6)。

[0027] 实施例2：

[0028] 利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法，步骤如下：

[0029] (1)将碳酸氢钾溶于无菌水中配制成1g/L母液，震荡混匀。

[0030] (2)用无菌水将碳酸氢钾母液稀释成0.02，0.10，0.20，0.50，1.00g/L。

[0031] (3)将紫杉醇标品(纯度＞99％，北京索莱宝生物科技有限公司)溶解在无水乙腈中，配制成0.10g/L溶液。

[0032] (4)将配制好的碳酸氢盐溶液分别和紫杉醇溶液等体积混合均匀(如溶液分层，不影响后续反应的进行)。

[0033] (5)将反应体系加热到60℃，恒温反应30min。

[0034] 用HPLC对反应后产物进行分析。并计算转化效率。

[0035] 表1不同KHCO3对紫杉醇转化效果

[0036] KHCO3浓度(g/L) 紫杉醇峰面积 7-表紫杉醇峰面积 转化效率0 6181.7 0 0
0.05 5987.5 736.2 0.031415
0.1 4468 1115 0.277221
0.2 3257.9 2232.2 0.472977
0.5 1944.9 2957.6 0.685378
1 1116.8 3150.8 0.819338

[0037] 实施例3：

[0038] 利用碳酸氢盐转化紫杉醇生成7-表紫杉醇的方法，步骤如下：

[0039] (1)将碳酸氢钾溶于无菌水中配制成1g/L母液，震荡混匀。

[0040] (2)用无菌水将碳酸氢钾母液稀释成0.10g/L。

[0041] (3)将紫杉醇标品溶解在无水乙腈中，配制成0.10g/L溶液。

[0042] (4)将步骤(1)和步骤(2)中配制好的碳酸氢钾溶液分别和紫杉醇溶液等体积混合均匀(如溶液分层，不影响后续反应的进行)。

[0043] (5)将反应体系加热到40℃，恒温反应5，10，15，20，25，30min。

[0044] (6)用HPLC对反应后产物进行分析。并计算转化效率。

[0045] (7)实验结果发现，反应在20-25min后趋于平衡。

[0046] 表2不同反应时间紫杉醇转化效率

[0047] 反应时间(min) 紫杉醇峰面积 7-表紫杉醇峰面积 紫杉醇转化效率5 6181.7 0 0
10 5087.8 289.8 0.176958
15 4563.2 826 0.261821
20 4537.4 920.6 0.265995
25 3863.1 1524.3 0.375075
30 3894.3 1565.2 0.370028

[0048] 参考文献：

[0049] [1]C.H.Oliver  Huang,David  G.I.Kingston,Neai.F.Magri,G,Samaranayake.New taxanes from Taxus Brevifolia.Journal ofNaturalProducts 
198649(4),pp665-669.

[0050] [2]Jun’ichi Kobayashi,Hideyuki Shigemori.Bioactive Taxoids from the Janpanese Yew Taxol cuspidata.MedicinalResearch Revies 2002,22(3),pp305-328.[0051] [3]孙汉董，黎胜红等。《二萜化学》，化学工业出版社。2012年1月。页数：354-355.