RGDS修饰的七环醛,其合成,抗栓活性和应用

摘要

本发明公开了下式的Arg‑Gly‑Asp‑Ser修饰的七环醛,即(2’S,5’S)‑四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R‑亚甲基‑Arg‑Gly‑Asp‑Ser)‑2,3,4,9‑四氢‑1H‑吡啶[3,4‑b]并吲哚}‑1’,4’‑二酮,公开了它的制备方法,公开了它的抗动脉血栓活性，因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物中的应用。

权利要求

1.下式的Arg-Gly-Asp-Ser修饰七环醛,即(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲基-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮，

2.权利要求1的Arg-Gly-Asp-Ser修饰七环醛的制备方法，该方法包括：

1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；

2)在甲醇中(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下氢解脱苄得到(1R,3S)-1-(二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

3)在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTu)存在下，(1R,3S)-1-(二甲氧乙基-2基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中分子间缩合为(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)；

4)采用冰醋酸为溶剂，浓盐酸和水为催化剂(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)转化为(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(4)；

5)采用二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并三唑为催化剂的液相缩合的方法合成HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

6)用氰基硼氢化钠为还原剂将HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl连接到(2’S,

5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-

1’,4’-二酮(4)的醛基上，合成(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)；

7)在三氟醋酸和三氟甲磺酸的混合溶剂中(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)脱除硝基和苄酯得到(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(6)。

3.权利要求1的Arg-Gly-Asp-Ser修饰七环醛在制备抗动脉血栓药物中的应用。

说明书

RGDS修饰的七环醛,其合成,抗栓活性和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲基-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮,涉及它的制备方法,涉及它的抗动脉血栓活性，因而本发明涉及它在制备抗动脉血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 血栓形成是缺血性心脏病,缺血性中风和静脉血栓的共同病理。在全球范围内,缺血性心脏病和缺血性中风导致的死亡人数占全部因病死亡人数的1/4。而静脉血栓则是不发达国家,中等发达国家和高度发达国家主要的疾病负担。血栓可以使得一系列相关的疾病恶化,例如极少出现的生物材料管的堵塞性血栓可以为反复换管,或接受溶栓治疗或长期接受抗凝治疗的患者带来难以预料的后果,可以引起接受经皮冠状动脉内介入治疗后患者再栓塞,可以伴随肝素诱导的血小板减少症状,以及弯曲的冠状动脉血栓可以引起急性冠状综合症。此外,血栓形成是相关疾病的合并症,例如大块的脑静脉血栓是患有癫痫病的早期怀孕妇女的合并症,以及支架血栓是经皮冠状动脉内介入治疗患者的严重合并症。可见,发明新型抗血栓药物具有临床重要性。

[0003] β-咔啉是抑制血栓的重要药效团。然而β-咔啉,例如3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸要得到抗动脉血栓目的,不仅需要静脉注射,而且剂量需要5μmol/kg。从3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸抗动脉血栓的角度看,既期待将静脉注射改变为口服,又期待降低剂量。发明人假设,两个β-咔啉药效团融合,例如两个(1R,3S)-1-羰甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸分子间缩合为(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮应有强的口服抗血栓活性。发明人进一步假设,往这种新型七环醛的醛基连接Arg-Gly-Asp-Ser应有更强的口服抗血栓活性。根据这个假设,发明人提出了本发明。

发明内容

[0004] 本发明的第一个内容是提供下式的(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲基-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮。

[0005]

[0006] 本发明的第二个内容是提供(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲基-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮的制备方法，该方法包括：

[0007] 1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；

[0008] 2)在甲醇中(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下氢解脱苄得到(1R,3S)-1-(二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

[0009] 3)在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTu)存在下，(1R,3S)-1-(二甲氧乙基-2基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中分子间缩合为(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)；

[0010] 4)采用冰醋酸为溶剂，浓盐酸和水为催化剂(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)转化为(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(4)；

[0011] 5)采用二环己基碳二亚胺为缩合剂，1-羟基苯并三唑为催化剂的液相缩合的方法合成HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

[0012] 6)用氰基硼氢化钠为还原剂将HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl连接到(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(4)的醛基上，合成(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)；

[0013] 7)在三氟醋酸和三氟甲磺酸的混合溶剂中(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)脱除硝基和苄酯得到(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(6)。

[0014] 本发明的第三个内容是评价(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮的抗动脉血栓作用。

附图说明

[0015] 图1.(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮的合成路线.(i)二氯甲烷，三氟醋酸；(ii)CH3OH，Pd/C，H2；(iii)HBTu，NMM，无水DMF；(iv)H2O，冰醋酸，浓盐酸；(v)DCC，HOBt，NMM，THF；
(vi)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)；(vii)CH3OH，NaOH溶液(2M)；(viii)二氯甲烷，NaCNBH3，无水MgSO4；(ix)三氟醋酸，三氟甲磺酸。

具体实施方式

[0016] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

[0017] 实施例1制备(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

[0018] 冰浴下180mL二氯甲烷，10mL1,1,3,3-四甲氧基丙烷和10mL三氟醋酸的混合溶液搅拌40min。之后，后加入10.25g(34.86mmol)L-Trp-OBzl。反应混合物室温搅拌14h，TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)显示L-Trp-OBzl消失。反应液分别用饱和NaHCO3水溶液洗(40mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(40mL×3)，分离的二氯甲烷用无水NaSO4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱层析进行纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，得5.12g(37％)标题化合物，-
为棕红色油状物。ESI-MS(m/e):393[M+H]。

[0019] 实施例2制备(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

[0020] 向5.12g(13.00mmol)(1R,3S)-1-(二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯与100mL甲醇的溶液中加入500mg Pd/C，充入氢气并室温搅拌18h，TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)显示1消失，终止反应。滤除Pd/C，滤液减压浓缩至干，得3.63g(92％)标题化合物，为亮黄色油状物。ESI-MS(m/e):303[M-H]-。

[0021] 实施例3制备(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)

[0022] 冰浴搅拌下向6.12g(20.13mmol)(1R,3S)-1-(2,2-二甲氧基乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)与100mL无水DMF的溶液中加入3.00g(22.22mmol)HBTu。然后用N-甲基吗啉将反应液的pH调至8-9，反应24h后点TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)显示2消失，终止反应。反应液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解。之后，分别用饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％KHSO4水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和Na Cl水溶液洗(30mL×3)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h，过滤，滤液减压浓缩。得到的深黄色固体用硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)，得1.14g(10％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e):573[M+H]+；
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝11.08(s,2H),7.39(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,
2H),7.08(t,J＝7.2Hz,2H),6.97(t,J＝7.2Hz,2H),5.93(dd,J1＝3.6Hz,J2＝9.0Hz,2H),
4.62(dd,J1＝3.3Hz,J2＝11.4Hz,2H),4.53(t,J＝4.8Hz,2H),3.34(s,6H),3.26(s,6H),
3.20(m,2H),2.79(m,2H),2.24(m,4H)。

[0023] 实施例4制备(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(4)

[0024] 冰浴与搅拌下向380mg(0.66mmol)(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-二甲氧乙基-2-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3)和9mL冰醋酸的溶液中加入6mL水和3mL浓盐酸，搅拌2h，TLC显示(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)3消失，终止反应。冰浴下，用NaOH水溶液(2M)调节反应液pH值到7。得到的溶液用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并的乙酸乙酯层分别用饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×
3)，乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥12h，滤去硫酸钠，滤液减压浓缩得到288mg(90％)标+ 1
题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e):481[M+H] ；H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝10.95(s,2H),9.79(m,2H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.38(d,J＝7.5Hz,2H),7.10(t,J＝6.9Hz,
2H),6.99(t,J＝6.9Hz,2H),6.22(dd,J1＝3.6Hz,J2＝9.0Hz,2H),4.67(dd,J1＝3.3Hz,J2＝
11.4Hz,2H),3.26(m,2H),3.11(m,4H),2.84(m,2H)。

[0025] 实施例5制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl

[0026] 冰浴下向3.19g(10.00mmol)Boc-Arg(NO2)与150mL无水四氢呋喃的溶液中加入1.35g(10.00mmol)HOBt，搅拌5min后加入2.27g(11.00mmol)DCC，冰浴下搅拌30min，得到反应液A。冰浴下，将3.50g(12.00mmol)HCl·Gly-OBzl加入反应液A中，用N-甲基吗啉调节pH值到9。反应混合物室温搅拌反20h，TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)显示Boc-Arg(NO2)消失。滤除反应液中的不溶物，滤液减压浓缩，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，滤去不溶的无色固体，滤液分别用饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，5％KHSO4水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，得到的乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h，滤去硫酸钠，滤液减压浓缩，得到黄色糖浆，加入30mL二氯甲烷溶解，置于4℃静置12h；析出白色固体，减压过滤，得到+
4.32g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):467[M+H]。

[0027] 实施例6制备Boc-Arg(NO2)-Gly

[0028] 冰浴下向4.32g(9.25mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl与30mL甲醇的溶液中滴加2M NaOH溶液，调节溶液pH值为13-14。反应混合物冰浴搅拌反1h，TLC(二氯甲烷/甲醇,20/1,v/v,含2滴/乙酸)显示Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。于冰浴下滴加饱和KHSO4溶液，调节溶液的pH为7，减压旋除甲醇。残留物于冰浴下滴加饱和KHSO4溶液，调节溶液的pH为2-3，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并乙酸乙酯层，用饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)，得到的乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h，滤去硫酸钠，滤液减压浓缩，3.21g(92％)标题化合物，为无色糖浆。

[0029] 实施例7制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

[0030] 按照实施例5的方法从3.23g(10.00mmol)Boc-Asp(OBzl)和2.78g(12.00mmol)HCl·Ser-OBzl得到4.43g(89％)标题化合物，为黄色糖浆。ESI-MS(m/e):501[M+H]+.[0031] 实施例8制备HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl

[0032] 将4.43g(8.86mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl用20mL无水乙酸乙酯溶解，然后于冰浴下向溶液中加入50mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M),室温搅拌6h，TLC(二氯甲烷/甲醇/乙酸,20/1/2滴,v/v/v)显示Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl消失。将反应液减压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，再用无水乙酸乙酯复溶。该操作至少重复3次。最后残留物用无水乙醚洗，得到3.58g(93％)标题化合物，为黄色固体。

[0033] 实施例9制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

[0034] 按照实施例5的方法从2.50g(6.65mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和3.48g(7.97mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到2.55g(42％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):759[M+H]+。

[0035] 实施例10制备HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

[0036] 按照实施例8的方法从843mg(1.11mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到729mg(94％)标题化合物，为无色固体。

[0037] 实施例11制备(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)

[0038] 将168mg(0.35mmol)(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(4)溶于15mL二氯甲烷，冰浴下以三乙胺调节pH值到9。将729mg(1.05mmol)HCl·Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl用15mL二氯甲烷溶解，冰浴下以三乙胺调节pH值到9，于冰浴下滴加到化合物4的二氯甲烷溶液中，加100mg MgSO4。反应混合物冰浴搅拌1h后，每隔1h加入27mg NaCNBH3，共加入108mg NaCNBH3。之后，在室温搅拌24hTLC(二氯甲烷/甲醇＝7:1)显示化合物4消失，终止反应。反应液分别用饱和NaHCO3水溶液洗(7mL×3)，饱和NaCl水溶液洗(7mL×3)，得到的二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥12h后，滤去硫酸钠，滤液减压浓缩，得到的黄色固体用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得到52mg(8％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):1765[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝11.00(s,2H),8.58(m,2H),8.37(m,6H),7.38～7.30(m,24H),
7.07(t,J＝7.8Hz,2H),6.96(t,J＝7.5Hz,2H),5.93(m,2H),5.12(m,8H),4.80(m,2H),4.57(dd,J1＝3.9Hz,J2＝11.4Hz,2H),4.48(dd,J1＝4.5Hz,J2＝8.4Hz,2H),3.83(m,4H),3.66(m,2H),3.59(m,4H),3.25(m,2H),3.19(m,10H),2.77～2.51(m,10H),2.27(m,2H),2.06(m,
4H),1.62(m,8H)。

[0039] 实施例12制备(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(6)

[0040] 冰浴下将50mg(0.03mmol)(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{[1R-亚甲-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(5)用1.5mL三氟乙酸溶解。之后，加入0.5mL三氟甲磺酸，冰浴下搅拌30min，TLC(二氯甲烷/甲醇＝7:1)显示化合物5消失。冰浴下往反应混合物中加25mL无水乙醚，搅拌10min，静置，倾去上清液。残留物再加25mL无水乙醚，搅拌10min，静置，倾去上清液。该操作至少重复3次。得到的黄黑色固体用1mL 5％醋酸溶解，溶液用Sephadex纯化，得到6mg(16％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):1315[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝12.56(s,4H),10.77(s,2H),9.14(m,2H),8.95(m,2H),8.48(m,2H),8.06(m,2H),7.44(m,8H),7.10(t,J＝7.8Hz,2H),7.03(t,J＝7.2Hz,2H),5.82(m,2H),4.83～4.55(m,6H),3.96(m,4H),
3.87(m,2H),3.63(m,4H),3.27(m,2H),3.14(m,10H),2.87～2.63(m,10H),2.35(m,2H),
2.23(m,2H),1.79(m,4H),1.55(m,4H)。

[0041] 实施例13评价(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(6)的抗动脉血栓作用[0042] 实验材料:阿司匹林(Aspirin,CAS:50-78-2，货号：298969，百灵威科技有限公司)、乌拉坦(CAS:51-79-6，货号：30191228，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS:9041-08-1，货号：542858，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、无水乙醚(北京化学试剂公司)、硅油(北京化学试剂公司)、二水合柠檬酸三钠(CMCNa，货号：
20170713，北京化工厂)。

[0043] 实验动物:SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

[0044] 实验方法:实验采用颈总动脉-颈外静脉体外循环旁路丝线法。

[0045] 分组及剂量:(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(简称化合物6)的剂量为0.1μmol/kg，阳性对照阿司匹林的剂量为167μmol/kg，阴性对照为0.5％CMCNa。

[0046] 试剂的剂型:麻醉剂为乌拉坦的生理盐水溶液(20％),抗凝剂为肝素钠的生理盐水溶液(42mg/100mL)，化合物6为0.5％CMCNa的悬浮液，阿司匹林为0.5％CMCNa的悬浮液。

[0047] 旁路插管:右颈静脉和左颈动脉的旁路插管由内径为1.0mm,外径为2.0mm，长10.0cm的聚乙烯管构成。它们的一端均加热拉成为斜口的细管,以便插入右颈静脉和左颈动脉。它们构成旁路插管的两端。旁路插管的中段由内径为3.5mm，长为8.0cm的聚乙烯管构成。

[0048] 血栓负载线:长为6.0cm，重为4.0±0.1mg的表面毛糙丝线。

[0049] 旁路插管组装:三段聚乙烯管内壁均用硅油的乙醚溶液(1％)硅烷化，完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。

[0050] 实验操作:按照0.1μmol/kg的剂量将化合物6的CMCNa的悬浮液以0.3mL/100g体重给大鼠灌胃，按照167μmol/kg的剂量将阿司匹林的CMCNa的悬浮液以0.3mL/100g体重给大鼠灌胃，以及将CMCNa以0.3mL/100g体重给大鼠灌胃。30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定。按照0.1mL/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体外循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的血后称量并记录血栓重，代表抗动脉血栓活性。数据采用t检验进行统计。实验数据见表1。

[0051] 表1的数据表明，在0.1μmol/kg口服剂量下(2’S,5’S)-四氢吡嗪[1’,2’:1,6]并双{(1R-亚甲-Arg-Gly-Asp-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(简称化合物6)可显著性抑制大鼠形成血栓。这个有效剂量是静脉注射3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸抗血栓的有效剂量5μmol/kg的1/50。本发明的化合物6不仅将3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的静脉注射改变为口服,而且降低了剂量。可见，本发明有意想不到的技术效果。

[0052] 表1化合物6的抗动脉血栓活性

[0053]化合物 剂量 血栓重(均值±SD mg)
0.5％CMCNa 3mL/kg 29.29±4.94
阿司匹林 167μmol/kg 18.98±4.24a
化合物6 0.1μmol/kg 21.08±3.09a

[0054] a)与0.5％CMCNa比P<0.01；n＝8