Treg细胞的培养液及其培养方法与应用

摘要

本发明涉及一种Treg细胞的培养液及其培养方法与应用，Treg细胞的培养液的培养方法包括以下步骤：S110：将CD4+CD25+Treg细胞和hUC‑MSCs按照一定比例共同培养48h‑72h，离心取上清液；S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；S330：向S110获得的上清液中加入细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48h‑96h；S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。解决了Treg细胞培养操作复杂和周期过长的问题，解决了外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的含量过低和因自体疾病问题导致自体Treg细胞质量低下的患者而不能进行Treg细胞治疗的问题。

权利要求

1.一种Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S110：将CD4+CD25+Treg细胞和 hUC-MSCs按照一定比例密度共同培养48-72h，然后离心取上清液；

S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；

S330：向S110获得的上清液中加入细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；所述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的组合；所述钙离子载体为A23187；

S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48h-

96h；

S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。

2.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述CD4+CD25+Treg细胞与hUC-MSCs的比例密度为：CD4+CD25+Treg细胞的密度为1×106 -2×106 cells/ml，hUC-MSCs的密度为1×105-2×105cells/ml。

3.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述CD4+CD25+Treg细胞是采用 EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自外周血PBMC中分选制得。

4.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述hUC-MSCs通过以下方法制备：去除脐带中的动静脉和羊膜；取华通氏胶，剪成碎块；用含5-20ng/mlEGF-β的X-VIVO15无血清培养基培养原代hUC-MSCs，培养24h后换液，去除未贴壁的细胞；培养至hUC-MSCs汇合度达到90％，用0.25m/v％胰蛋白酶消化3min，1000rpm离心得到P1代hUC-MSCs；继续传代培养至获得P3代hUC-MSCs。

5.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述外周血PBMC通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层；所述的血浆通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层，获得外周血PBMC的分离液，收集所述外周血PBMC的分离液的上层血浆，将血浆置于50℃-60℃灭活

20-40min，离心后的即得血浆。

6.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述步骤S440中外周血PBMC的密度为1×106 -2×106cells/ml。

7.根据权利要求1所述的Treg细胞的培养液的培养方法，其特征在于，所述细胞因子中所述白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的含量分别为：白细胞介素-2（IL-2）的浓度为500-800IU/ml、白细胞介素-12（IL-12）的浓度为100-200ng/ml、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）的浓度为200-350ng/ml、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度为200-400IU/ml。

8.采用权利要求1至7的培养方法制备的Treg细胞的培养液。

9.根据权利要求8所述的Treg细胞的培养液，其特征在于，所述Treg细胞的培养液包括以下组分：CD4+CD25+Treg细胞及hUC-MSCs的上清液与RPMI1640培养液的混合液、外周血PBMC的血浆、钙离子载体、细胞因子；所述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的组合。

说明书

Treg细胞的培养液及其培养方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞技术领域，特别是涉及Treg细胞的培养液及其培养方法与应用。

背景技术

[0002] 调节性T细胞(Treg)是近年来新发现的一群表型和功能特异的 T 细胞亚群，对免疫反应具有抑制效应，从而在肿瘤免疫、移植物耐受、自体免疫性疾病及机体自体免疫平衡方面均有重要作用。Treg细胞对人体的免疫系统和内分泌系统来说是把双刃剑。它对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，可以通过一系列机制抑制过强的免疫应答，使得机体在自体损伤最小的情况下有效的清除抗原或病原体。控制Treg细胞的数量与表达可以帮助我们控制疾病的进程。Treg细胞主要通过两种方式发挥免疫抑制功能。第一种方式是Treg细胞可以通过分泌异质性细胞因子等发挥免疫调节作用； 第二种方式是Treg细胞主要通过细胞与细胞的直接接触来发挥作用。

[0003] CD4+CD25+Treg细胞作为一类调节性T细胞， 在自体反应性T细胞的增殖，维持免疫耐受方面起着重要的作用。现有技术中采用免疫磁珠两步法分离CD4+CD25+Treg细胞，并用 CD4+CD25+Treg细胞专用的完全培养基和一定浓度的IL-2培养扩增CD4+CD25+Treg细胞。在上述现有技术中使用的培养基成本较高，免疫磁珠分选CD4+CD25+Treg细胞需要过柱，操作繁琐，且上述培养周期较长。因此，如何简单分离培养和缩短CD4+CD25+Treg细胞的培养周期是当下研究的方向之一。

[0004] CD4+CD25+Treg细胞可分为自然性 Treg 细胞（nTreg 细胞）和诱导性 Treg 细胞（iTreg 细胞）两部分。目前认为 CD4+CD25+Foxp3+为Treg细胞的特征性表型。研究表明在青年人、正常老年人、老年肿瘤及疾病患者的外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞的比例逐渐升高；但相反，外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的比例依次降低。因此如何提高外周血CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的表达量是发挥Treg细胞的免疫调节作用的关键。

发明内容

[0005] 基于此，有必要针对上述的问题，提供一种Treg细胞的培养液的培养方法。

[0006] 一种Treg细胞的培养液的培养方法，包括以下步骤：

[0007] S110：将CD4+CD25+Treg细胞和 hUC-MSCs按照一定比例密度共同培养48-72h，然后离心取上清液；

[0008] S220：制备外周血PBMC及血浆，将所述血浆灭活，离心待用；

[0009] S330：向S110获得的上清液中加入一种或多种细胞因子、钙离子载体、S220所得的血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液；

[0010] S440：将外周血PBMC按照一定的密度接种于S330配制的Treg细胞培养液中，培养48-96h；

[0011] S550：收集细胞，细胞活率大于90%，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%。

[0012] 上述一种Treg细胞的培养液的培养方法，本发明通过将P3代hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg共同培养后收集共培养液的上清液，添加细胞因子、钙离子载体、血浆和RPMI1640培养液配制成Treg细胞培养液，接种单个核细胞，培养48h以上获得的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于65%，CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞占CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达量大于90%，解决了Treg细胞培养操作复杂和周期过长及CD4+CD25+Foxp3+Helios+Treg细胞的含量过低的问题；通过添加P3代hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg共同共培养液的上清液使得培养的Treg细胞具有低抗原性，其通用性解决了因自体疾病问题导致自体Treg细胞质量低下的患者而不能进行Treg细胞治疗的问题。

[0013] 在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞与hUC-MSCs的比例密度为：CD4+CD25+Treg细胞的密度为1×106-2×106cells/ml，hUC-MSCs的密度为1×105-2×105cells/ml。

[0014] 在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞是采用 EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒自外周血PBMC中分选制得。

[0015] 在其中一个实施例中，hUC-MSCs通过以下方法制备：去除脐带中的动静脉和羊膜；取华通氏胶，剪成的碎块，较优地，剪成成2mm3左右的碎块；用含5-20ng/mlEGF-β的X-VIVO15无血清培养基培养原代hUC-MSCs，培养24h后换液，去除未贴壁的细胞；培养至hUC-MSCs汇合度达到90％，用0.25m/v％胰蛋白酶消化3min，1000rpm离心得到P1代hUC-MSCs；继续传代培养至获得P3代hUC-MSCs。

[0016] 在其中一个实施例中，外周血PBMC通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层。

[0017] 在其中一个实施例中，血浆通过以下方法制备：取25-24岁健康人的外周血PBMC，离心处理收集淋巴细胞层，获得外周血PBMC的分离液，收集所述外周血PBMC的分离液的上层血浆，将血浆置于50-60℃灭活20-40min，离心后的即得血浆。

[0018] 在其中一个实施例中，步骤S440中外周血PBMC的密度为1×106 -2×106cells/ml。

[0019] 在其中一个实施例中，细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或几种。

[0020] 在其中一个实施例中，钙离子载体为A23187。

[0021] 本发明还提供了上述培养方法制成的Treg细胞的培养液，该Treg细胞的培养液包括以下组分：CD4+CD25+Treg细胞及hUC-MSCs的上清液与RPMI1640培养液的混合液、外周血PBMC的血浆、钙离子载体、细胞因子；所述细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或几种。

[0022] 在其中一个实施例中，CD4+CD25+Treg细胞及hUC-MSCs共培养的上清液与RPMI1640培养液的体积比为2:1-1:1。

[0023] 在其中一个实施例中，外周血PBMC的血浆于所述Treg细胞的培养液中的体积浓度为5%-10%。

[0024] 在其中一个实施例中，所述钙离子载体的浓度为50-120ng/ml。

[0025] 在其中一个实施例中，白细胞介素-2、白细胞介素-12、类胰岛素一号增长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的含量分别为：白细胞介素-2（IL-2）的浓度为500-800IU/ml、白细胞介素-12（IL-12）的浓度为100-200ng/ml、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）的浓度为200-350ng/ml、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度为200-400IU/ml。

[0026] 上述任一项所述的Treg细胞的培养液可应用于内分泌及代谢方面的疾病上的应用。

[0027] 上述任一项所述的Treg细胞的培养液可应用于不孕不育、退行性关节病变、骨质酥松、甲状腺减少、消化系统疾病、高血脂、习惯性溃疡、中风、代谢综合征和Ⅱ型糖尿病。

[0028] 补充说明

[0029] Treg是Regulatory T cells调节性T细胞；

[0030] IL-2 是Interleukin2白细胞介素2；

[0031] IL-12 是Interleukin12白细胞介素12；

[0032] PBMC是peripheral blood mononuclear cell单个核细胞；

[0033] hUC-MSCs是human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells人脐带间充质干细胞；

[0034] IGF-1是insulin-like growth factors -1类胰岛素一号增长因子；

[0035] GM-CSF是granulocyte-macrophage colony stimulating factor粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；

[0036] 钙离子载体A23187是A23187 (MIXED CALCIUM-MAGNESIUM SALT)钙离子载体A23187(钙镁混合盐)；

[0037] TGF-β是transforming growth factor-β转化生长因子-β；

[0038] X-VIVO15是X-VIVO15无血清造血细胞培养基；

[0039] RPMI1640是Roswell Park Memorial Institute1640培养液；

[0040] 华通氏胶是指脐带羊膜和血管之间的凝胶状填充物, 含有较多的脐带间充质干细胞；

[0041] 细胞活率（%）=活细胞密度/（活细胞密度+死细胞密度）×100%。

具体实施方式

[0042] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0043] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

[0044] 1、外周血PBMC（单个核细胞）分离

[0045] 取25-24岁健康人外周血，将全血15ml加入到50ml离心管中，离心3000rpm，10min，分离血浆，血浆每支1ml备用，在取完血浆的离心管中加入PBS至总体积15ml，在另一个50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，将混匀的血细胞与PBS混合轻轻加入到淋巴细胞分离液中，离心1500rpm，20min，逐渐降速防止震动形成的白膜。取中间白膜至一个新的50ml离心管，加PBS至40ml，离心1500rpm，10min，弃上清，加入5ml冻存液（冻存液为90%血清，10%DMSO）定溶，以1*107cell/支冻存细胞。

[0046] 2、CD4+CD25+Treg细胞分离

[0047] 使用EasySepTM人CD4+CD25+T细胞分选试剂盒， 按照其说明书所述的步骤操作自冻存复苏的PBMC中分选出CD4+CD25+Treg细胞，体外使用X-VIVO15培养基（添加500-1000U/ml IL-2)培养CD4+CD25+Treg细胞，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养14天，收集细胞，加入冻存液（冻存液为90%血清，10%DMSO）溶解，以1*107cell/支冻存细胞。

[0048] 3、hUC-MSCs制备

[0049] 去除脐带中的动静脉和羊膜；取华通氏胶，剪成2.2mm3的碎块；用含5ng/ml-20ng/mlEGFβ的X-VIVO15无血清培养基培养原代hUC-MSCs，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养24h后换液，去除未贴壁的细胞；培养至hUC-MSCs汇合度达到90％，用0.25m/v％胰蛋白酶消化3min，1000rpm离心得到P1代hUC-MSCs；继续传代培养至获得P3代hUC-MSCs。

[0050] 4、hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg细胞共培养上清液制备

[0051] 将P3代hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg细胞分别按照1×106cells/ml、 1×105cells/ml，的细胞密度接种于含有X-VIVO15无血清培养基的培养瓶中， 37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养，共同培养48h；然后收集共培养液的上清液，2℃-8℃保藏。

[0052] 实施例1

[0053] 本实施例的Treg细胞的培养液的培养方法包括以下步骤：

[0054] 向175培养瓶中加入hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg细胞共培养上清液10ml、RPMI1640培养液9ml、离心所得血浆1ml，然后加入钙离子载体A23187、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），获得初培养液，初培养液中钙离子载体A23187、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度分别为：100ng/ml钙离子载体A23187，600IU/ml白细胞介素-2（IL-2）、100ng/ml白细胞介素-12（IL-12）、250ng/ml类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、200IU/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。将1*107cell/支冻存PBMC，40℃复苏3min接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养48h，离心1500rpm，10min，采用生理盐水洗涤两次离心收集的细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测，检测结果如表1。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例的Treg细胞的培养液的培养方法包括以下步骤：

[0057] 向175培养瓶中加入hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg细胞共培养上清液12ml、RPMI1640培养液7ml、离心所得血浆1ml，然后加入钙离子载体A23187、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）获得初培养液，初培养液中各组分的浓度为100ng/ml浓度的钙离子载体A23187，600IU/ml浓度的白细胞介素-2（IL-2）、100ng/ml浓度的白细胞介素-12（IL-12）、250ng/ml浓度的类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、200IU/ml浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。将1*107cell/支冻存PBMC，40℃复苏3min接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养48h，离心1500rpm，10min，采用生理盐水洗涤两次离心收集的细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测，检测结果如表1。

[0058] 实施例3

[0059] 向175培养瓶中加入RPMI1640培养液19ml，1ml离心所得血浆，向培养液中加入钙离子载体A23187、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）获得培养液，培养液各组分的浓度为100ng/ml浓度的钙离子载体A23187，600IU/ml浓度的白细胞介素-2（IL-2）、100ng/ml浓度的白细胞介素-12（IL-12）、250ng/ml浓度的类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、200IU/ml浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。将1*107cell/支冻存PBMC，40℃复苏3min接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养48h，离心1500rpm，10min，生理盐水洗涤两次离心收集细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测。

[0060] 对比例

[0061] 向175培养瓶中RPMI1640培养液19ml，1ml离心所得血浆，向培养液中加入白细胞介素-2（IL-2）使其浓度达到600IU/ml的。将1*107cell/支冻存PBMC，40℃复苏3min接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2的全饱和湿度下培养48h，离心1500rpm，10min，生理盐水洗涤两次离心收集细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测。

[0062] 表1

[0063]

[0064] 注：CD4+CD25+Foxp3+Treg表达量为CD4+CD25+Foxp3+细胞量/ CD4+细胞量，CD4+CD25+Foxp3+Helios+表达量为CD4+CD25+Foxp3+ Helios+细胞量/ CD4+CD25+Foxp3+细胞量。

[0065] 由表1可知，整体细胞数量未有明显变化，细胞活率均在95%以上，符合要求。对实施例3方法获得的调节性T细胞的CD4+CD25+Foxp3+表达量为61.9％，实施例1CD4+CD25+Foxp3+表达量67.4%，但就CD4+CD25+Foxp3+Helios+表达量而言，实施例1高于实施例3，实施例1方法获得的调节性T细胞的CD4+CD25+Foxp3+表达量CD4+CD25+Foxp3+Helios+表达量都略高于实施例2。说明本发明所用的hUC-MSCs和CD4+CD25+Treg细胞共培养上清液能够大大提高CD4+CD25+Foxp3+Helios+表达量。实施例3与对比例相比，CD4+CD25+Foxp3+Helios+表达量悬殊不大，但CD4+CD25+Foxp3+表达量相差较大，说明本发明所用的白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）、类胰岛素一号增长因子（IGF-1）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）组合能够大大提高CD4+CD25+Foxp3 +表达量。所以，本发明方法可以显著提高调节性T细胞的CD4+CD25+Foxp3+Helios+整体表达量。

[0066] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0067] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。