一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系、应用及构建方法

摘要

本发明公开了一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系、应用及构建方法。所述人肝癌细胞系命名为人肝癌细胞Huh7‑EZ，保藏号为CCTCC NO：C2018193。本发明通过通过分子克隆以及反向遗传技术，对病毒的基因组进行了改造，将EGFP/zeocin基因替换了HEV的编码衣壳蛋白的基因，通过添加博莱霉素筛选，得到了一株支持HEV复制子持续复制的Huh7细胞系，命名为人肝癌细胞Huh7‑EZ，该细胞对研究HEV致病机理及挖掘新型抗病或筛选新的抗病毒药物具有重要意义，为HEV的研究提供一个新的模型。

权利要求

1.一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系，其特征在于，命名为人肝癌细胞 Huh7-EZ，保藏号为CCTCC NO：C2018193。

2.如权利要求1所述的人肝癌细胞系在作为戊型肝炎病毒体外细胞培养系统中的应用。

3.如权利要求1所述的人肝癌细胞系在非疾病诊断或治疗为目的的、戊型肝炎病毒与宿主相互作用机制研究中的应用。

4.如权利要求1所述的人肝癌细胞系在非疾病诊断或治疗为目的的、筛选抗戊型肝炎病毒药物中的应用。

说明书

一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系、应用及构建

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系、应用及构建方法。

背景技术

[0002] 戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是引起戊型肝炎的病原体，而戊型肝炎是目前急性肝炎的主要病因之一。戊型肝炎病毒的目标人群是15-40岁的青壮年。临床症状为典型的急性、病毒性肝炎症状，包括黄疸、全身乏力、食欲不振、恶心、腹痛、发热、肝肿大等；无黄疸的肝炎也有过报道。

[0003] 该病最早于1955年在印度的新德里爆发，目前HEV广泛流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的大部分地区。根据流行性和散发性疾病的报道，估计有20亿人生活在戊型肝炎流行的地区。所有流行地区共同的特征是饮用水被污染，病毒经由粪口途径感染人群或动物。由于其特定传播途径，导致戊型肝炎在许多公共卫生条件较差的发展中国家是一个重要的公共健康疾病。但在包括日本、美国以及欧洲的许多发达工业化国家中也有散发和群发案例。戊型肝炎在人口中的致死率是0.2-1％。但不同于其它病毒性肝炎，它的一个独特的临床特点是孕妇感染HEV的死亡率高达30％。同时在免疫抑制患者中可出现HEV的慢性感染。

[0004] 哺乳动物HEV主要分为4个基因型，基因型1和基因型2的感染对象限制为人，基因型3和基因型4为人畜共患，包括猪、鹿等在内的动物都是HEV的宿主。

[0005] 目前，HEV是急性肝炎主要的致病原因，且由于该病毒目前缺少有效的细胞培养系统，治疗HEV药物的研发存在困难，尚没有很好的药物可以用于治疗HEV。

[0006] HEV是一种单股正链RNA病毒。HEV的基因组包含3个开放性的阅读框，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白，ORF3编码一个小的多功能蛋白。

[0007] HEV的非结构蛋白由ORF1编码，这个编码区域在非编码区的5’端开始，ORF1编码了一个含有1693个氨基酸的多肽链，这个多肽链与病毒的复制和蛋白质加工有关。ORF1包含了几个功能区域，包括病毒RNA基因组帽子5’端的甲基转移酶(Met)区域、功能未知的“Y”区域，木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PCP)区域、在一个富含脯氨酸区域中包含高变区(HVR)、在PCP区域旁边的功能未知的“X”区域、解旋酶(Hel)区域以及负责病毒复制的RNA依赖的RNA聚合酶区域。

[0008] ORF2编码了HEV的衣壳蛋白，有660个氨基酸，功能是使病毒核酸壳体化。

[0009] ORF3编码了一个含有123个氨基酸的小蛋白，最近有发现称它是由一个双顺反子亚基因组翻译而来。ORF3对于病毒颗粒的复制是非必需的，最新研究表明，该蛋白可能是一个离子通道蛋白。

[0010] HEV的防控是目前我国乃至世界的难题。HEV难于防控主要表现在以下几方面：

[0011] (1)由于HEV在体外不能有效的感染细胞，因此缺少HEV体外细胞培养系；

[0012] (2)HEV缺少小动物模型；

[0013] (3)没有特异性治疗HEV的药物；

[0014] (4)目前世界上没有可以支持HEV持续复制的细胞系。

[0015] 当缺少细胞培养系统和动物模型时，病毒的复制子系统对于研究病毒与宿主相互作用机制重要意义尤其突出。以丙肝为例，研究人员利用丙肝的复制系统成功的筛选到了治疗丙肝的药物，产生了巨大的经济效益和社会效益。因此，如果建立HEV replicon细胞系对筛选戊型肝炎的抗病毒药物具有十分重要的意义。

[0016] Huh7细胞是一种肝癌细胞，来源于人的肝细胞，此细胞主要用于HEV的培养，是HEV防控技术研究中的重要材料。

发明内容

[0017] 本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系。

[0018] 一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系，命名为人肝癌细胞Huh7-EZ，保藏号为CCTCC NO：C2018193。

[0019] 本发明通过在戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)复制子：Kernow-C1p6感染性克隆序列中插入了融合的EGFP/zeocin抗性基因，然后转染Huh7细胞，再通过使用博莱霉素(zeocin)对zeocin抗性基因筛选，活下来的细胞带有zeocin基因，也即带有HEV复制子的相关序列，并且，由于同时带有EGFP基因，细胞会发出绿色荧光。经过筛选，最终获得一株亚克隆生长良好，并带有绿色荧光的细胞，命名为人肝癌细胞Huh7-EZ，于2018年11月3日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018193。对人肝癌细胞Huh7-EZ进行相关检测，从蛋白水平上通过间接免疫荧光可以检测到HEV非结构蛋白Helicase的表达，且在RNA水平上通过Northern blot可以检测到病毒复制子的基因组和亚基因组，表明复制子可以完成病毒除包装外的整个生命周期。在培养基中加入博莱霉素，连续传代13个星期，HEV复制子的阳性率没有降低，说明HEV复制子可以在细胞中稳定复制。

[0020] 本发明又公开了所述的人肝癌细胞系在作为戊型肝炎病毒体外细胞培养系统中的应用。

[0021] 本发明又公开了所述的人肝癌细胞系在戊型肝炎病毒与宿主相互作用机制研究中的应用。

[0022] 本发明又公开了所述的人肝癌细胞系在筛选抗戊型肝炎病毒药物中的应用。

[0023] 本发明还公开了一种包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：

[0024] (1)将荧光蛋白基因和抗性筛选基因插入Kernow-C1p6感染性克隆序列中获得p6-EZ HEV复制子载体；

[0025] (2)将p6-EZ HEV复制子载体线性化后体外转录获得对应RNA；

[0026] (3)将步骤(2)体外转录获得的RNA转染Huh7细胞；

[0027] (4)转染后使用相应的抗性筛选剂进行抗性筛选；

[0028] (5)抗性筛选的细胞进行亚克隆，并挑选获得具有相应荧光信号的亚克隆为包含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞系。

[0029] 所述荧光蛋白基因为EGFP基因，所述抗性筛选基因为zeocin抗性基因。所述抗性筛选剂为抗生素zeocin；抗性筛选时，抗生素zeocin使用终浓度为250ng/ml，每两天更换含有zeocin的培养基，连续筛选2周。

[0030] 所述的构建方法，步骤(1)中荧光蛋白基因和抗性筛选基因插入到Kernow-C1p6感染性克隆序列的限制性内切酶AflII和PmlI位点之间。

[0031] 本发明通过分子克隆以及反向遗传技术，对病毒的基因组进行了改造，将EGFP/zeocin基因(绿色荧光蛋白基因和博莱霉素抗性基因的融合基因)替换了HEV的编码衣壳蛋白的基因，通过添加博莱霉素筛选，得到了一株支持HEV复制子持续复制的Huh7细胞系，命名为人肝癌细胞Huh7-EZ，该细胞对研究HEV致病机理及挖掘新型抗病或筛选新的抗病毒药物具有重要意义，为HEV的研究提供一个新的模型。

附图说明

[0032] 图1为实施例1中p6-EZ HEV复制子载体的构建模式图。

[0033] 图2为实施例2中p6-EZ HEV复制子体外转录RNA产物凝胶电泳检测结果图，其中泳道p6为以原始Kernow-C1p6感染性克隆为模板的阴性对照组，泳道p6-EZ为以p6-EZ HEV复制子载体为模板的检测组。

[0034] 图3为通过Northern Blot检测人肝癌细胞Huh7-EZ中p6-EZ HEV复制子基因组和亚基因组结果图，其中泳道Huh7-EZ为检测组，Huh7为使用普通Huh7细胞的阴性对照组(下同)。

[0035] 图4为实施例4中人肝癌细胞Huh7-EZ中HEV非结构蛋白的免疫荧光检测结果图。

[0036] 图5为实施例5中人肝癌细胞Huh7-EZ中HEV复制子稳定性检测结果图。

[0037] 图6为实施例6中以干扰素为例，测试人肝癌细胞Huh7-EZ作为抗病毒药物筛选模型的检测结果图，其中A为荧光显微镜观察结果，B为荧光强度统计分析结果。

具体实施方式

[0038] 实施例1

[0039] p6-EZ HEV复制子载体的建立。

[0040] p6-EZ HEV复制子载体构建流程如图1所示：以Kernow-C1p6(HEV基因3型；GenBank accession number：JQ679013)感染性克隆(以下简称HEV感染性克隆)为骨架构建p6-EZ HEV复制子载体。

[0041] 使用融合PCR的方法，将目的基因EGFP/zeocin(以下简称EZ，序列如SEQ ID No.1所示)5’与ORF1的3’端融合，通过AflII和PmlI两个限制性酶切位点将EGFP/zeocin(EZ)替换到HEV的cDNA感染性克隆上。

[0042] (1)通过PCR，使用引物：

[0043] 上游引物AflII594-F：

[0044] 5’-GATGTCTCTTAAGGGTTTCTGGAAGAAGCATTC-3’，

[0045] 下游引物AflII594-R/EGFPzeocin：

[0046] 5’-CCCTTGCTCACCATGGTGATCCCATGGGCGATGC-3’，

[0047] 从HEV感染性克隆的cDNA中扩增HEV ORF1的nt 4765-5358片段。

[0048] (2)通过PCR，使用引物：

[0049] 上游引物ORF2-EZ：

[0050] 5’-gcccatgggatcaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’，

[0051] 下游引物PmlI-EZ-R：

[0052] 5’-CACCACGTGAATCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAA-3’，

[0053] 从pTracer-SV40(Invitrogen)载体中扩增EGFP/zeocin(EZ)基因。

[0054] (3)上述两次PCR获得的产物均使用试剂盒GeneJET Gel Extraction Kit(Thermo)纯化，然后使用上游引物AflII-594-F和下游引物PmlI-EZ-R进行融合PCR，用AflII和PmlI酶切融合后的PCR产物，将融合的片段插入到HEV感染性克隆中，同时删除感染性克隆AflII-PmlI区域原有的片段。获得p6-EZ HEV复制子载体，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0055] 实施例2

[0056] 戊型肝炎病毒复制子Huh 7细胞系的建立。

[0057] (1)体外转录：通过MluI(NEB)限制性内切酶将质粒(p6-EZ HEV复制子载体)线性化，取1μg的线性化p6-EZ HEV复制子载体作为模板，使用mMESSAGE mMACHINE T7kit(Ambion)体外转录试剂盒，37度温育90min，获得p6-EZ HEV复制子载体转录后的RNA。转录产物经电泳检测，结果如图2所示，说明转录成功。

[0058] (2)转染：5μl的DMRIE-C(Invitrogen)加到700μl Opti-mem无血清培养基中，使用涡旋仪充分混匀，室温作用30min。向Opti-mem中加入10μl步骤(1)获得的体外转录p6-EZ HEV复制子载体的RNA产物。5min。之后将Opti-mem加到Huh7细胞培养基中，5h后细胞换成完全培养基(含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)。

[0059] (3)筛选具有zeocin抗性的细胞：向培养基中加入抗性筛选剂：抗生素zeocin(Thermo-Fisher)，抗生素zeocin的终浓度为250ng/ml。每两天更换含有抗生素zeocin的完全培养基，连续筛选2周。将筛选后的细胞进行细胞计数，之后将细胞进行稀释，将稀释后的细胞传到96孔板中进行亚克隆。亚克隆后，有一株Huh7的亚克隆生长良好，并带有绿色荧光，将该株细胞命名为人肝癌细胞Huh7-EZ，于2018年11月3日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018193。

[0060] 由于p6-EZ HEV复制子载体的基因组中插入了GFP报告基因，因此筛选到带有GFP荧光的细胞(如图4所示)，说明含戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞Huh7-EZ筛选成功。

[0061] 实施例3

[0062] Northern Blot检测。

[0063] Trizol(Thermo)提取人肝癌细胞Huh7-EZ的总RNA。用Northern Max试剂盒(Ambion)中指定的试剂和条件进行Northern印迹分析。在10μg的总RNA中加入含有甲醛的核酸染料，在65℃下变性15分钟，用2％琼脂糖甲醛凝胶进行RNA核酸电泳。通过毛细管印迹将RNA转移到尼龙膜上，然后紫外交联到尼龙膜上，并在68℃的杂交溶液(NorthernMax；Ambion)中预杂交1小时。杂交后，在杂交溶液中加入HEV特异性的3'端标记地高辛的探针：
5’-CACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATG CCGTTCTTCT-3’，在37℃过夜。洗膜，并用Bright Star BioDetect试剂盒检测探针。通过Norther blot检测发现在该HEV replicon细胞系中存在HEV复制子的全长基因组(8166bp)和亚基因组(2819bp)(如图3所示)，说明该HEV replicon与病毒在细胞中复制的真实情况是一致的。在RNA水平上验证在Huh7-EZ中有HEV RNA replicon的持续复制。

[0064] 实施例4

[0065] 间接免疫荧光检测。

[0066] 固定细胞：将4％的多聚甲醛加入到人肝癌细胞Huh7-EZ中，使细胞完全被覆盖，37℃固定20min；将配置好的含有1％BSA的PBS加入到细胞中，使细胞完全被覆盖，37℃静置作用1h；用于检测HEV非结构蛋白Helicase(解旋酶)的兔多肽抗体(抗体制备参照文献Nair VP,et al.(2016)Endoplasmic Reticulum Stress Induced Synthesis of a Novel Viral Factor Mediates Efficient Replication of Genotype-1Hepatitis E Virus.PLoS pathogens 12(4):e1005521.)按1∶500稀释，加到细胞上，37℃静置作用1h；荧光二抗(Thermo，货号A11034)按1∶1000稀释，37℃避光作用1h；DAPI染色，室温作用5min；滴加50％甘油的水溶液。通过间接免疫荧光可以检测到HEV非结构蛋白Helicase的表达(如图4所示)，说明戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞Huh7-EZ中p6-EZ HEV复制子有病毒的非结构蛋白表达，在蛋白水平上验证了p6-EZ HEV复制子在细胞中是持续复制的。

[0067] 实施例5

[0068] HEV replicon细胞系稳定性检测。

[0069] 在添加抗生素zeocin的条件下，HEV replicon细胞系连续传代培养。通过流式细胞仪每周检测HEV replicon阳性细胞所占的比例。结果如图5所示：发现戊型肝炎病毒复制子的人肝癌细胞Huh7-EZ中的p6-EZ HEV复制子可以稳定的传代培养。

[0070] 实施例6

[0071] 干扰素敏感性检测。

[0072] 在人肝癌细胞Huh7-EZ中，加入Peg-IFN-α2a检测对细胞中p6-EZ HEV复制是否有抑制作用。通过流式细胞分析仪检测细胞荧光强度的变化来评判Peg-IFN-α2a对HEV复制子的抑制作用的强弱。参考以往的文献，选取了包括对照组(不加入Peg-IFN-α2a)在内的6个浓度梯度(125IU、250IU、500IU、1000IU、2000IU)。结果如图6所示，在实验中通过荧光显微镜观察：随着Peg-IFN-α2a浓度的升高，在人肝癌细胞Huh7-EZ中，荧光强度逐渐下降，表明Peg-IFN-α2a浓度越高，对于HEV复制子的抑制作用越强。