一种β-环糊精功能化碳点材料

摘要

本发明公开了一种β‑环糊精功能化碳点材料。该碳点材料是通过N，S掺杂碳点(N,S‑CDs)基于酰胺缩合反应将β环糊精键合于碳点表面而制得。能够应用于环境监测领域以及生物样本中固醇类激素物质的水平监测，尤其是对于睾酮的选择性分析方法。

权利要求

1.一种检测睾酮的荧光探针系统，包括β-环糊精功能化碳点材料、(二茂铁基甲基)三甲基碘化铵和磷酸缓冲液；

所述β-环糊精功能化碳点材料是通过N，S掺杂碳点基于酰胺缩合反应将β环糊精键合于碳点表面而制得。

2.根据权利要求1所述的荧光探针系统，所述β环糊精为单(6-氨基-6-去氧)β环糊精。

3.根据权利要求1所述的荧光探针系统，所述β-环糊精功能化碳点材料的具体制备方法为：先将N，S掺杂碳点溶解在去离子水中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，搅拌一定时间后，加入单(6-氨基-6-去氧)β环糊精，继续搅拌反应，所得产物使用透析袋进行透析，最后冷冻干燥得到所述β环糊精功能化碳点材料。

说明书

一种β-环糊精功能化碳点材料

[0001] 本申请是申请号为“201710206063.6”、申请日为2017年3月31日、发明名称为“β-环糊精功能化碳点材料及其应用于检测睾酮的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明总体涉及环境监测领域以及生物、食品样本中固醇类激素物质的水平监测，尤其是对于睾酮的选择性分析方法。

背景技术

[0003] 睾酮作为非常重要的固醇类雄性激素，其本身不仅作为调控因子广泛参与到生物新陈代谢以及生殖发育的过程中，其在生物体中水平的高低与多种生理指标甚至疾病，诸如二型糖尿病、前列腺癌、冠状动脉疾病和肾结石相关，由于睾酮的重要生理作用使其也被应用于医药和兽药中从而通过医疗、生活和农业污水排放进入环境中。而现有的对于睾酮的检测分析主要依靠HPLC、GC-MS、HPLC-MS/MS等高性能、精密仪器。虽然对于生物样本有基于酶联免疫反应的ELISA快速检测试剂盒可以应用于睾酮含量的分析，但这样分析需要对于样品的前处理不能做到原位(in situ)的检测。因此一种高效简便可以in situ可视化分析睾酮水平的方法不仅对于生化检测意义重大，更可以拓展应用到环境以及食品安全的检测中。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是合成β环糊精功能化的碳点，基于其对于睾酮的选择性识别能力从而提供一种方便快捷，结果准确的液体样本睾酮的分析方法。

[0005] 根据本发明的第一方面，提供一种β-环糊精功能化碳点材料，该碳点材料是通过N，S掺杂碳点(N,S-CDs)基于酰胺缩合反应将β环糊精键合于碳点表面而制得。

[0006] 首先，环糊精作为功能性识别体，根据其本身组成它们的吡喃葡萄糖分子数的不同分为有α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，δ-环糊精四种，其中以前三种最为常见，考虑到目标分子的体积故只有6个吡喃葡萄糖分子的α-环糊精由于其内部空腔体积太小不适宜使用，同理γ-环糊精，δ-环糊精虽然内部空间足够容纳目标分子但是由于其本身空间太大后相应的空间位阻作用位点减少，从而使分子识别能力降低，因此选用β-环糊精。

[0007] 其次，在侧链官能团选择上，首先末端必须含有易于碳点表面羧基反应的基团，故选择氨基，此外侧本身长度不能太长，不然不利于光激发电子转移，因此选择单(6-氨基-6-去氧)基为侧链基团

[0008] 综上所述优选情况下，所述β环糊精为单(6-氨基-6-去氧)β环糊精。

[0009] 具体情况下：先将N,S-CDs溶解在去离子水中，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌一定时间后，加入单(6-氨基-6-去氧)β环糊精，继续搅拌反应，所得产物使用透析袋进行透析，最后冷冻干燥得到所述β环糊精功能化碳点材料。

[0010] 优选情况下，考虑EDC.HCL的催化机理，使NHS略微过量使得EDC.HCL与NHS的摩尔比在1:1.5到1:2之间，故N,S-CDs与EDC.HCL、NHS、单(6-氨基-6-去氧)β环糊精的物质配比范围为质量比(1：3：3.5：10)到(1：3：4：20)之间。

[0011] 根据本发明的第二方面，提供一种检测睾酮的方法，包括以下步骤：

[0012] (1)提供上述的β-环糊精功能化碳点材料；

[0013] (2)取一定量的β环糊精功能化碳点材料和(二茂铁基甲基)三甲基碘化铵(Fc+)混合溶解在一定pH的水中，振荡一定时间，形成荧光探针；

[0014] (3)配置一系列浓度的睾酮标准液，分别加入到荧光探针系统中，振荡一定时间后，分别采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，经线性拟合后得到标准方程；

[0015] (4)将待检测样品液加入到荧光探针系统中，振荡一定时间后采用荧光光谱仪检测一定波长下的荧光强度，与标准方程比对后得出样品液中睾酮的含量。

[0016] 优选情况下，β环糊精功能化碳点材料和Fc+的配比范围为质量比为1：4到1:6之间。

[0017] 优选情况下，所述一定pH的水为磷酸缓冲液。

[0018] 优选情况下，步骤(2)和(3)中所述振荡一定时间都为20min分钟以上。

[0019] 根据本发明的第三方面，提供一种检测睾酮的荧光探针系统，包括上述的β-环糊精功能化碳点材料、(二茂铁基甲基)三甲基碘化铵(Fc+)和磷酸缓冲液。

[0020] 本发明采用主客体荧光探针系统，再通过荧光光谱分析液体样本中的睾酮水平。该方法首次采用了β环糊精功能化的碳点作为选择性识别荧光探针对于目标分析物的睾酮有着很好的识别效果，并且与传统方法相比大量减少了有机溶剂的使用量，大幅缩短了前处理时间以及对于先进仪器的依赖；本发明是基于主客体荧光探针系统的荧光比色法，其对于睾酮这种固醇类雄性激素有着很好的选择性，其线性关系良好、检出限较低，可以广泛应用于液体样本中睾酮的含量水平检测，同时由于材料细胞毒性低生物兼容性好，有潜力应用于生物样本内睾酮水平的原位可视检测。

附图说明

[0021] 图1为采用本发明的荧光探针系统对一系列浓度的睾酮标准液的荧光光谱分析结果图。

具体实施方式

[0022] 一、仪器与试剂

[0023] Varian CARY Eclipse荧光光谱仪(美国Varian公司)

[0024] 睾酮标准品(98.0％)购于上海Aladdin公司，使用时用乙醇稀释成工作溶液。雄烯二酮、黄体酮、17α-羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌酮、雌二酮，均购买于百灵威；其他有机溶剂均购来源于北京化工厂试剂。

[0025] 二、β环糊精功能化碳点材料制备及荧光探针系统的构建

[0026] 按照文献方法由使用柠檬酸和L-半胱氨酸利用水热法制备N,S-CDs，在200摄氏度下在反应釜中反应3小时后，粗产物使用截留质量为3500Da的透析袋透析纯化，最后所得N,S-CDs在红外光谱下有着明显的1702cm-1的吸收峰证明其表面富含羧酸官能团，同时XPS能谱分析得到的284.5eV的能级峰证明其C-C键以sp2杂化后形成石墨化结构。

[0027] 取15mg N,S-CDs溶解在30mL的去离子水中，先加入43mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和51mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在室温下搅拌30min后加入200mg单(6-氨基-6-去氧)β环糊精后继续搅拌反应12h，所得产物使用3500Da的透析袋，透析48h，最后冷冻干燥得到最后的β环糊精功能化碳点材料。

[0028] 将60μg的β环糊精功能化碳点材料和320μM的Fc+溶解在3.0mL的磷酸缓冲溶液(10mM,pH＝7.4)中，在室温下振荡20min，形成荧光探针系统。

[0029] 三、荧光比色法检测睾酮水平

[0030] 先构建标准方程(如后文所详细描述)，将待检测样品液加入到荧光探针系统中，振荡20min后采用荧光光谱仪检测355nm激发波长下425nm处的荧光强度，与标准方程比对后得出样品液中睾酮的含量。

[0031] 四、荧光探针系统构建优化

[0032] 荧光探针系统的合理构建对于成功检测目标分析物有着十分重要的意义，合适的体系能提高对于目标分析物的检出灵敏度，而影响探针系统的条件因素有体系pH值，淬灭剂用量以及平衡时间。

[0033] 1.体系pH值的影响

[0034] pH在荧光探针系统中是一个重要的因素，不同的pH可能会显著的影响荧光探针的稳定性和强度变化。

[0035] 初步实验中，首先验证了β环糊精功能化碳点在不同pH值下的荧光稳定性，实验条件为取一定量的β环糊精功能化碳点溶解在不同pH的磷酸缓冲液中(10mM)，使其终浓度为20μg mL-1，振荡30min后使用荧光光谱仪记录体系在355nm激发波长下425nm处的发射光强度变化。实验发现，在所测的pH范围内(5.16-9.05)β环糊精功能化碳点的荧光表现很稳定，未出现较大的波动，详细实验结果见表1。

[0036] 表1

[0037]

[0038] 2.淬灭剂Fc+用量

[0039] 由上一步实验结果可知，pH对于探针的荧光强度影响不大，故选择中性pH＝7.00作为后续试验条件，取一定量的β环糊精功能化碳点和不同量的Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸缓冲液中(10mM)使碳点的终浓度为20μg mL-1，而Fc+的浓度在0-500μM之间，振荡30min后使用荧光光谱仪记录体系在355nm激发波长下425nm处的发射光强度变化。由结果可见，随着Fc+的浓度的增加，体系的荧光强度逐渐下降，超过300μM以后体系的荧光强度基本维持不+再变化，说明此时Fc与β环糊精功能化碳点结合达到饱和，具体结果见下表2。

[0040] 表2

[0041]

[0042]

[0043] 3.平衡时间的影响

[0044] 根据上一步优化结果选择构建探针体系条件：取一定量的β环糊精功能化碳点和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸缓冲液中(10mM)使碳点的终浓度为20μg mL-1而Fc+的浓度为320μM，振荡30min后加入一定量的睾酮标准液，使用荧光光谱仪记录体系在355nm激发波长下425nm处的发射光强度随时间的变化。由结果可知，随着加入睾酮后的时间增加体系逐渐平衡且荧光强度恢复，20min以后平衡完成荧光强度不再变化，详细结果见下表3。

[0045] 表3

[0046]

[0047] 五、标准方程的建立

[0048] 在上述优化条件下取一定量的β环糊精功能化碳点和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸缓冲液中(10mM)，使碳点的终浓度为20μg mL-1，而Fc+的浓度为320μM，振荡30min后加入不同量的睾酮标准液(0-480μM)，在室温下平衡20min后使用荧光光谱仪记录体系在355nm激发波长下425nm处的发射光强度的变化，结果如表4。由结果可知荧光探针体系对于0-280μM范围内变化的睾酮有着很好的相应，使用Origin对数据作图后，结果如图1所示，由图1可知，荧光探针系统对于睾酮有着很好的识别和定量分析能力，在一定范围内荧光强度与睾酮浓度之间有着良好的线性关系。线性方程为y(荧光强度，a.u.)＝0.2078x(睾酮浓度，μM)+142.73。

[0049] 表4

[0050]

[0051] 六、特异性验证

[0052] 为了验证荧光探针体系对于睾酮的特异性，在优化条件下取一定量的β环糊精功能化碳点和Fc+溶解在pH＝7.00的磷酸缓冲液中(10mM)，使碳点的终浓度为20μg mL-1，而Fc+的浓度为320μM，振荡30min后分别加入高低水平(200、80μM)的睾酮以及其他固醇类激素物质(雄烯二酮、黄体酮、17α-羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌酮、雌二酮)，在室温下平衡20min后使用荧光光谱仪记录体系在355nm激发波长下425nm处的发射光强度的变化，并与未加入这些物质前的原始体系荧光作比较(ΔI/I0)，由结果可知，只有睾酮能在加入后较大水平改变体系荧光强度，因此体系对于睾酮有着特异性的响应。具体结果见下表5。

[0053] 表5

[0054]

[0055] 本领域技术人员应该理解，上文所述具体实施方式仅为了更好地理解本发明，并不用于对本发明进行限制，本发明的保护范围应以权利要求书的限定为准。