一种用于羧肽酶A检测的新型近红外荧光探针转让专利
申请号 : CN201910299644.8
文献号 : CN109929548B
文献日 : 2020-10-09
发明人 : 颜梅 , 孙荣环 , 张晶 , 王平 , 刘明霞 , 于京华
申请人 : 济南大学
摘要 :
本发明公开了一种检测羧肽酶A的近红外荧光探针，该荧光探针用于生物体内、体外的羧肽酶A的传感检测，并且此探针合成简单，廉价易得，可在活体内进行荧光成像，对胰液渗漏疾病有很好的诊断功能。本发明的荧光探针选择性好，灵敏度高，更重要的是发射波长在近红外区域，使其具有优良的抗自荧光能力。本发明的探针在分析化学检测以及生物医用中具有广阔的应用前景。
权利要求 :
1.一种用于羧肽酶A检测的新型近红外荧光探针，其分子结构如下：
。
说明书 :
一种用于羧肽酶A检测的新型近红外荧光探针
技术领域
[0001] 本发明设计属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种识别胰液中羧肽酶A的新型近红外探针的制备方法及其在生物体内体外的应用。
背景技术
[0002] 羧肽酶是（CPs）是一类从多肽或蛋白质的c端分裂出一个或多个氨基酸的蛋白酶，常见的包括羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶C和羧肽酶Y四种，在生理过程和各种疾病中都具有重要作用。羧肽酶A和羧肽酶B主要产生于胰腺中，在蛋白质的降解过程中发挥作用，并且羧肽酶在胰腺炎和胰腺癌中的表达水平有所不同，这就为检测胰液的渗漏提供了可能。目前，对于羧肽酶的检测，主要使用高效液相色谱法、吸收光谱法和耦合分析法，但这几种检测方法都是限定于体外羧肽酶的检测，还不能实时对羧肽酶进行成像。近年来，荧光成像的方法因其特有的优势引起了人们的广泛关注。近红外区域的荧光探针具有选择性好、灵敏度高、组织渗透能力强以及抗自发荧光干扰等优点，常被用来进行体内体外的组织细胞成像研究。尽管如此，截止到现在，用于羧肽酶检测的荧光探针鲜被报道，并且报道的用于羧肽酶检测的荧光探针都具有短的发射波长。众所周知，长发射波长对细胞荧光成像是极其有利的，因为具有长波长的光子能够减少环境诱导的光散射，从而减少检测过程中内生发色团的影响，并且能够减少活细胞的光损伤，所以对发射波长在近红外区域的用于羧肽酶检测的荧光探针的设计就十分迫切了 。
发明内容
[0003] 针对目前羧肽酶检测的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有长发射波长的用于羧肽酶A检测的近红外荧光探针，并将探针用于胰腺胰液渗漏的检测。
[0004] 本发明采用以下的技术方案：
[0005] 一种用于羧肽酶A检测的新型近红外荧光探针，具有如下分子结构式：
[0006]
[0007] 该荧光探针的合成路线如下 ：
[0008]
[0009] 制备方法详情如下：（1）取1,8-萘内酰亚胺（0.85g，5mmol），氢氧化钾（0.56g,10mmol），溶于N-甲基-2-吡咯烷酮（10ml），在室温下搅拌30min，之后加入丁基磺酸内酯（0.75g,5.5mmol）,再加热至90℃反应10h，之后冷却，再用丙酮（35ml）处理，得到产物1a；
（2）取1a(1.50g,5mmol),四丁基氯化铵（1.51g,5.5mmol）,溶于乙酸（8ml）中，在90℃下搅拌
0.5h，然后逐滴加入乙酸乙酯，再过滤，旋蒸，得到粘油状的产物2；（3）取产物2（2.73g,
5mmol）以及甲基氯化镁，溶于无水四氢呋喃（20ml）中,在氮气气氛下，加热到60℃进行搅拌
1h，然后冷却，加入1M盐酸进行中和 ，并用乙醇(15ml)和乙醚（20ml）进行稀释，再冷却到0℃，过夜，得到产物3；（4）取产物3（606mg,2mmol）,物质3a（360mg,1mmol）,乙酸钠（164g,
2mmol）,溶于醋酸酐（40ml）,在室温下搅拌2h,之后用乙醚（60ml）处理，最后过层析柱，得到产物4;(5)取3-硝基苯酚（347mg,2.5mmol）,碳酸钾(345mg,2.5mmol)，溶于乙腈（15ml）中，之后在氩气气氛下室温搅拌10min，取物质4（765mg,1mmol）溶于乙腈中，再将其加入到上述混合物中，室温下搅拌4h，之后将混合物减压蒸发，得到的浓缩物溶解于二氯甲烷中，然后用水洗涤三次，再用硫酸钠干燥，经蒸发后得到的残留物分散在甲醇（30ml）中以备后用；取氯化亚锡（4g,20mmol）溶于浓盐酸中，之后在氩气气氛下加入到前述甲醇溶液中，反应加热到70℃，并搅拌过夜，然后用饱和的碳酸钠溶液中和，之后过滤掉沉淀物，并用二氯甲烷洗涤，将收集的滤液用水处理三次，再用硫酸钠干燥，之后减压蒸发，过层析柱得到产物5；（6）取溴乙酸甲酯和产物5在乙腈中反应，再加入氢氧化钠，之后水洗三次，在进行旋蒸，将残留物溶于乙腈，再加入苯丙氨酸，加热至120℃，回流，过夜，经萃取分液后，进行抽滤，得到所需探针FD-CPA。
（2）取1a(1.50g,5mmol),四丁基氯化铵（1.51g,5.5mmol）,溶于乙酸（8ml）中，在90℃下搅拌
0.5h，然后逐滴加入乙酸乙酯，再过滤，旋蒸，得到粘油状的产物2；（3）取产物2（2.73g,
5mmol）以及甲基氯化镁，溶于无水四氢呋喃（20ml）中,在氮气气氛下，加热到60℃进行搅拌
1h，然后冷却，加入1M盐酸进行中和 ，并用乙醇(15ml)和乙醚（20ml）进行稀释，再冷却到0℃，过夜，得到产物3；（4）取产物3（606mg,2mmol）,物质3a（360mg,1mmol）,乙酸钠（164g,
2mmol）,溶于醋酸酐（40ml）,在室温下搅拌2h,之后用乙醚（60ml）处理，最后过层析柱，得到产物4;(5)取3-硝基苯酚（347mg,2.5mmol）,碳酸钾(345mg,2.5mmol)，溶于乙腈（15ml）中，之后在氩气气氛下室温搅拌10min，取物质4（765mg,1mmol）溶于乙腈中，再将其加入到上述混合物中，室温下搅拌4h，之后将混合物减压蒸发，得到的浓缩物溶解于二氯甲烷中，然后用水洗涤三次，再用硫酸钠干燥，经蒸发后得到的残留物分散在甲醇（30ml）中以备后用；取氯化亚锡（4g,20mmol）溶于浓盐酸中，之后在氩气气氛下加入到前述甲醇溶液中，反应加热到70℃，并搅拌过夜，然后用饱和的碳酸钠溶液中和，之后过滤掉沉淀物，并用二氯甲烷洗涤，将收集的滤液用水处理三次，再用硫酸钠干燥，之后减压蒸发，过层析柱得到产物5；（6）取溴乙酸甲酯和产物5在乙腈中反应，再加入氢氧化钠，之后水洗三次，在进行旋蒸，将残留物溶于乙腈，再加入苯丙氨酸，加热至120℃，回流，过夜，经萃取分液后，进行抽滤，得到所需探针FD-CPA。
[0010] 本发明的荧光探针对羧肽酶A的检测机理详情如下所述，用溴乙酸将染料分子与苯丙氨酸连接形成荧光探针，其分子内的电子转移（ICT）被阻断，羧肽酶A(CPA)存在的情况下，特异性的识别碳端的苯丙氨酸，并将其切割下来，恢复了ICT过程，在激发光下，发射出荧光信号。响应过程如下：
[0011]
[0012] 本发明的荧光探针发射波长在近红外区域，其本身不发射荧光，与CPA反应后，发出很强的荧光，最大发射波长为826nm。
[0013] 本发明的荧光探针的斯托克斯位移达到166nm,其最大吸收波长为660nm，与CPA反应后，最大发射波长为826nm。
[0014] 本发明的荧光探针对羧肽酶A有很好的选择性，在PH等于7.4的PBS的缓冲溶液中，探针溶液不发射荧光，加入1.25μg的胰液后，荧光强度逐渐增强，30分钟后荧光强度增大到0分钟的42倍，同样条件下分别加入其他可能干扰的化学物质，包括羧肽酶B,HSH,Hcy,Cys,Na+,K+,Mg2+等，探针的荧光强度均没有明显变化。
[0015] 本发明的荧光探针具有很强的抗干扰能力，其它可能干扰的化学物质（羧肽酶B,HSH,Hcy,Cys,Na+,K+,Mg2+）的存在不影响探针分子对羧肽酶A的响应。
[0016] 本发明的荧光探针的PH适用范围较宽，在7到13的范围内都不影响探针分子对羧肽酶A的检测。
[0017] 本发明的优点：探针分子原料廉价易得，合成产率较高，检测羧肽酶选择性好，灵敏度高，具有长的发射波长，在体内成像过程中，对细胞的光损伤小 ，在化学分析领域具有广阔的应用前景 。
[0018] 具体实施实例
[0019] 实施实例1：钾盐1a的制备
[0020] 取1,8-萘内酰亚胺（0.85g，5mmol），氢氧化钾（0.56g,10mmol），溶于N-甲基-2-吡咯烷酮（10ml），在室温下搅拌30min，之后加入丁基磺酸内酯（0.75g,5.5mmol）,再加热至90℃反应10h，之后冷却，再用丙酮（35ml）处理，得到产物1a(1.65 g, 96%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.18 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 8.7 Hz, 1H), 7.23 (d, J =7.5 Hz, 1H), 3.91 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.46 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H)。
[0021] 实施实例2：中间产物2的制备
[0022] 取1a(1.50g,5mmol),四丁基氯化铵（1.51g,5.5mmol）,溶于乙酸（8ml）中，在90℃下搅拌0.5h，然后逐滴加入乙酸乙酯，再过滤，旋蒸，得到粘油状的产物2(2.5 g, 94%)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.01 (t, J = 7.4 Hz, 1H) ,7.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.51 (m, 2H) 7.24 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.97 (d, J =
7.1 Hz, 1H), 3.93 (t, J = 7.4Hz, 1H), 3.26 (t, J = 8.6 Hz, 8H), 2.90 (m, 2H),
1.94 (m, 4H), 1.64 (m, 8H), 1.42 (m, 8H), 0.98 (t, J = 8.6 Hz, 12H)。
7.1 Hz, 1H), 3.93 (t, J = 7.4Hz, 1H), 3.26 (t, J = 8.6 Hz, 8H), 2.90 (m, 2H),
1.94 (m, 4H), 1.64 (m, 8H), 1.42 (m, 8H), 0.98 (t, J = 8.6 Hz, 12H)。
[0023] 实施实例3：化合物3的制备
[0024] 取产物2（2.73g,5mmol）以及甲基氯化镁，溶于无水四氢呋喃（20ml）中,在氮气气氛下，加热到60℃进行搅拌1h，然后冷却，加入1M盐酸进行中和 ，并用乙醇(15ml)和乙醚（20ml）进行稀释，再冷却到0℃，过夜，得到产物3(2.58 g, 85%)。 1H NMR (D2O): 8.51 (d, J = 8.1 Hz, 1H),8.43 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.09 (m, 2H), 7.85 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.73 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.51, (t, J = 8.5 Hz, 2H), 3.02 (s, 3H),2.85 (m, 2H), 2.04 (m, 2H), 1.78 (t, J = 8.2 Hz, 2H). MS (maldi) m/z: calcd. for [C16H19NO3S]+, 304.10; found 304.10。
[0025] 实施实例4：花菁类染料4的制备
[0026] 取产物3（606mg,2mmol）,物质3a（360mg,1mmol）,乙酸钠（164g,2mmol）,溶于醋酸酐（40ml）,在室温下搅拌2h,之后用乙醚（60ml）处理，最后过层析柱(CH2Cl2 : CH3OH = 2:1)，得到产物4(612 mg, 81%). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): 8.37 (d, J = 13.1 Hz,
2H), 8.04 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.73 (t, J = 7.1 Hz,
2H),7.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 7.1 Hz,
2H), 6.20 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 7.5 Hz, 4H),2.83 (t, J = 7.5 Hz,
4H), 1.82 (m, 14H). High-resolution MS (ESI, positive ion mode) m/z: calcd. for [C40H39ClN2NaO6S2]+,765.1830; found 765.1827。
2H), 8.04 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.73 (t, J = 7.1 Hz,
2H),7.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 7.1 Hz,
2H), 6.20 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 7.5 Hz, 4H),2.83 (t, J = 7.5 Hz,
4H), 1.82 (m, 14H). High-resolution MS (ESI, positive ion mode) m/z: calcd. for [C40H39ClN2NaO6S2]+,765.1830; found 765.1827。
[0027] 实施实例5:染料5的制备
[0028] 取3-硝基苯酚（347mg,2.5mmol）,碳酸钾(345mg,2.5mmol)，溶于乙腈（15ml）中，之后在氩气气氛下室温搅拌10min，取物质4（765mg,1mmol）溶于乙腈中，再将其加入到上述混合物中，室温下搅拌4h，之后将混合物减压蒸发，得到的浓缩物溶解于二氯甲烷中，然后用水洗涤三次，再用硫酸钠干燥，经蒸发后得到的残留物分散在甲醇（30ml）中以备后用；取氯化亚锡（4g,20mmol）溶于浓盐酸中，之后在氩气气氛下加入到前述甲醇溶液中，反应加热到70℃，并搅拌过夜，然后用饱和的碳酸钠溶液中和，之后过滤掉沉淀物，并用二氯甲烷洗涤，将收集的滤液用水处理三次，再用硫酸钠干燥，之后减压蒸发，过层析柱得到产物5。
[0029] 实施实例6：探针分子的制备
[0030] 取溴乙酸甲酯和产物5在乙腈中反应，再加入氢氧化钠，之后水洗三次，在进行旋蒸，将残留物溶于乙腈，再加入苯丙氨酸，加热至120℃，回流，过夜，经萃取分液后，进行抽滤，得到所需探针FD-CPA。
[0031] 实施实例7：本发明荧光探针的应用
[0032] 取探针分子母液（1.0×10-3mol/L）于PBS缓冲溶液（10mM,PH=7.4,1.0Mm溴化十六+ + 2+烷基三甲胺）中配成待测溶液，再分别加入各种物质（羧肽酶B,HSH,Hcy,Cys,Na ,K ,Mg ）
37℃保温1小时后测量，溶液荧光几乎没有明显变化，而只有加入羧肽酶A的探针溶液荧光大幅度增强，可见荧光探针能够对羧肽酶A特异性识别。当其他物质（羧肽酶B,HSH,Hcy,Cys,Na+,K+,Mg2+）各自和羧肽酶同时加入，37℃保温1小时后测量，探针溶液荧光依旧显著增强，本发明的荧光探针对羧肽酶A的检测表现出很强的抗干扰能力。PH在7至13都不影响探针分子对羧肽酶A的检测，可见本发明的荧光探针具有良好的生物相容性。
37℃保温1小时后测量，溶液荧光几乎没有明显变化，而只有加入羧肽酶A的探针溶液荧光大幅度增强，可见荧光探针能够对羧肽酶A特异性识别。当其他物质（羧肽酶B,HSH,Hcy,Cys,Na+,K+,Mg2+）各自和羧肽酶同时加入，37℃保温1小时后测量，探针溶液荧光依旧显著增强，本发明的荧光探针对羧肽酶A的检测表现出很强的抗干扰能力。PH在7至13都不影响探针分子对羧肽酶A的检测，可见本发明的荧光探针具有良好的生物相容性。