本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶质瘤预后标志物CPVL抑制剂及其应用，现提出如下方案，一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂、一种抑制剂的试剂盒以及一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用。本发明有效的验证CPVL基因通过IFN‑γ信号通路参与了胶质瘤细胞凋亡的调控，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡提供理论数据，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡机制提供理论基础。
1.一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂，其靶核酸序列如下：GGATTTATACAGTGCACTA。
3.根据权利要求1所述的一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，包含以下步骤，其步骤如下：S1:检测CPVL基因在胶质瘤细胞株的表达；
将胶质瘤细胞株铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对不同胶质瘤细胞的CPVL基因进行检测；同时提取各细胞的总蛋白，利用Western Blot技术对不同胶质瘤细胞中CPVL基因表达的蛋白进行检测；
S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；
提取胶质瘤标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVL基因进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用Western Blot技术对胶质瘤组织CPVL基因表达的蛋白进行检测；
将胶质瘤标本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVL基因在胶质瘤标本中的分布情况；并进一步比较CPVL基因表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；
结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各标本CPVL基因的real-timePCR表达量数据将标本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVL基因表达与胶质瘤患者临床预后的相关性；
对CPVL基因表达高的胶质瘤细胞株进行慢病毒感染；
将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；
以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率；
运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值；
运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以
2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线；
运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板，待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50μg/mL溴化乙锭，100μg/mL RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测；
运用Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤；用500μl binding buffer重悬细胞，加入10μl Annexin-V medium buffer及1μl Annexin V荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后，500μl binding buffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析；
在胶质瘤细胞中沉默CPVL基因，然后使用STAT1抑制剂抑制STAT1基因的表达，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据。
4.根据权利要求3所述一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述胶质瘤细胞为U87MG、U251、LN382其中的任意一组。
一种胶质瘤预后标志物CPVL抑制剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶质瘤预后标志物CPVL 抑制剂及其应用。
背景技术
[0002] 胶质瘤是临床上最常见的颅内恶性肿瘤。由于各种理化、遗传等因素的影响，胶质瘤的发病率常居于颅内肿瘤首位，占颅脑肿瘤的 50％左右。胶质瘤因具有发病隐匿，生长速度快，易侵袭与转移，病死率高，平均生存期短等特点，已经成为了对人生命健康造成极大危害的疾病类型。目前采用的手术切除及放、化疗等传统疗法并未明显改善胶质瘤患者的预后效果，一直是中枢神经系统恶性肿瘤治疗中的一大难题，其根本原因在于胶质瘤的发病机制还不完全清楚。因此，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义。
[0003] 胶质瘤是癌症基因组图谱(TCGA)项目研究的第一种癌症，大量的基因组数据有助于了解这种致命疾病的发病机制。虽然已经进行了深入的研究来检测和验证与胶质瘤细胞侵袭和细胞增殖相关的许多分子，但到目前为止只有少数分子机制被揭示并被转化为临床应用。越来越多的证据表明，诱导胶质瘤细胞凋亡是导致肿瘤发生性增强的早期事件。因此，寻找潜在的早期诱导凋亡的生物标志物对胶质瘤的诊断和预后评估具有重要的临床价值。基因芯片与微阵列表达谱是过去十年中广泛使用的技术，用于快速比较不同样品中大量基因的表达水平，使之适合于基因筛选。本研究利用基因芯片表达谱技术在胶质瘤中鉴定出一个新的功能基因CPVL。CPVL是羧肽酶家族成员之一， Mahoney J A等运用差异显示聚合酶链反应搜索人巨噬细胞限制基因时首次克隆和鉴定到CPVL，定位于人染色体7p14.3。CPVL主要集中于富含单核细胞和巨噬细胞的组织中，包括胎盘、脾脏、心脏和肾脏，但在免疫系统中，CPVL仅局限于髓系细胞中。CPVL在包括神经胶质瘤在内的各种肿瘤中的作用至今仍不清楚。
发明内容
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中的缺点，而提出的一种胶质瘤预后标志物CPVL抑制剂及其应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0006] 一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂，其靶核酸序列如表1所示。
[0007] 一种包含有权利要求1所述的抑制剂的试剂盒。
[0008] 一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
[0009] S1:检测CPVL基因在胶质瘤细胞株的表达；
[0010] 将胶质瘤细胞株铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对不同胶质瘤细胞的CPVL基因进行检测；同时提取各细胞的总蛋白，利用Western Blot技术对不同胶质瘤细胞中CPVL基因表达的蛋白进行检测。
[0011] S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；
[0012] 提取胶质瘤标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVL基因进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用Western Blot技术对胶质瘤组织CPVL基因表达的蛋白进行检测；
[0013] 将胶质瘤标本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVL 基因在胶质瘤标本中的分布情况；并进一步比较CPVL基因表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；
[0014] 结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各标本CPVL基因的real-timePCR表达量数据将标本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVL基因表达与胶质瘤患者临床预后的相关性。
[0015] S3:对样品胶质瘤细胞进行感染
[0016] 对CPVL基因表达高的胶质瘤细胞株U251进行慢病毒感染。
[0017] S4:将S3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
[0018] 将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、 5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率。
[0019] S5:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验
[0020] 运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96 孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前 4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/
570nm检测OD值。
[0021] 运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5 天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5 天的细胞增殖曲线。
[0022] S6:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞周期实验
[0023] 运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板，待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS 重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50 μg/mL溴化乙锭(PI)，100μg/mL RNase A，0.2％Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测。
[0024] S7:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验
[0025] 运用Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤(1500rpm/min,离心5min)；用500μl binding buffer重悬细胞，加入10μl Annexin-V medium buffer及1μl Annexin V荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后， 500μl binding buffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析。
[0026] S8:采用回复实验验证CPVL基因调控机制
[0027] 在U251细胞中沉默CPVL基因，然后使用STAT1抑制剂抑制STAT1 基因的表达，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据。
[0028] 优选的，胶质瘤细胞为U87MG、U251、LN382其中的任意一组。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 该发明表明STAT1能够有效的抑制CPVL基因在胶质瘤细胞的增殖，促进胶质瘤细胞的凋亡，并调控细胞周期，利用回复实验验证 CPVL基因通过IFN-γ信号通路参与了胶质瘤细胞凋亡的调控，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡提供理论数据，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡机制提供理论基础。
附图说明
[0031] 图1为U251细胞回复实验细胞增殖数量检测数据。
[0032] 图2为U251细胞回复实验细胞克隆数量检测数据。
[0033] 图3为U251细胞回复实验采用流式细胞术检测后U251细胞凋亡数据。
[0034] 图4为U251细胞回复实验采用流式细胞术检测后U251细胞凋亡数据G1期和G2/M期细胞数据。
具体实施方式
[0035] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0036] 参照图1-4，一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂，其靶核酸序列如表1所示。
[0037] 表1：
[0038]
[0039] 一种包含有权利要求1所述的抑制剂的试剂盒。
[0040] 一种胶质瘤预后标志物CPVL的抑制剂在制备治疗胶质瘤药物中的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
[0041] S1:检测CPVL基因在胶质瘤细胞株的表达；
[0042] 将胶质瘤细胞株铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对不同胶质瘤细胞的CPVL基因进行检测；同时提取各细胞的总蛋白，利用Western Blot技术对不同胶质瘤细胞中CPVL基因表达的蛋白进行检测。
[0043] S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；
[0044] 提取胶质瘤标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVL基因进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用Western Blot技术对胶质瘤组织CPVL基因表达的蛋白进行检测；
[0045] 将胶质瘤标本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVL 基因在胶质瘤标本中的分布情况；并进一步比较CPVL基因表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；
[0046] 结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各标本CPVL基因的real-timePCR表达量数据将标本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVL基因表达与胶质瘤患者临床预后的相关性。
[0047] S3:对样品胶质瘤细胞进行感染
[0048] 对CPVL基因表达高的胶质瘤细胞株U251进行慢病毒感染。
[0049] S4:将S3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
[0050] 将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、 5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率。
[0051] S5:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验
[0052] 运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96 孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前 4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/
570nm检测OD值。
[0053] 运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5 天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5 天的细胞增殖曲线。
[0054] S6:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞周期实验
[0055] 运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板，待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS 重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μl PBS含50 μg/mL溴化乙锭(PI)，100μg/mL RNase A，0.2％Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测。
[0056] S7:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验
[0057] 运用Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤(1500rpm/min,离心5min)；用500μl binding buffer重悬细胞，加入10μl Annexin-V medium buffer及1μl Annexin V荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后， 500μl binding buffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析。
[0058] S8:采用回复实验验证CPVL基因调控机制
[0059] 在U251细胞中沉默CPVL基因，然后使用STAT1抑制剂抑制STAT1 基因的表达，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据；
[0060] 实施例一：
[0061] 胶质瘤细胞为U87MG、U251、LN382其中的任意一组。
[0062] 实施例二：
[0063] 采用人基因表达谱芯片技术对CPVL敲减组和对照实验组进行差异分析，得到320个显著上调基因，366个显著下调基因；然后运用 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件对这些差异基因进行整合分析，通过IPA经典通路分析提示差异基因富集于Interferon Signaling(IFN)通路上；采用real-time quantitative PCR方法发现CPVL敲减后IFN-γ信号通路内STAT1、IRF9、IFI35、PSMB8、 IFITM1、IFITM3、TAP、BAK下游应答基因被明显激活；进一步通过 Western Blot技术证实检测CPVL基因敲减后IFN-γ信号通路内的 STAT1磷酸化水平显著增加，JAK1、JAK2表达不受影响；IFN-γ信号通路的下游应答基因表达在5对胶质瘤患者标本中均明显高于邻近正常脑组织，并与胶质瘤病理分期分级显著相关。
[0064] 该发明：
[0065] 首先在U251细胞中沉默CPVL基因，然后使用STAT1抑制剂 (nifuroxazide)抑制STAT1的表达，用MTT法检测发现nifuroxazide 能够使经CPVL敲减导致的U251细胞增殖率下降趋势恢复正常，进一步的利用nifuroxazide对CPVL敲减的U251细胞进行实验，采用流式细胞术显示nifuroxazide可恢复经CPVL敲减诱导的U251细胞凋亡百分率，同时流式细胞术显示nifuroxazide能够恢复经CPVL敲减诱导的G1期和G2/M期细胞的百分率，该设计表明STAT1能够有效的抑制CPVL基因在胶质瘤细胞的增殖，促进胶质瘤细胞的凋亡，并调控细胞周期，利用回复实验验证CPVL基因通过IFN-γ信号通路参与了胶质瘤细胞凋亡的调控，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡提供理论数据，为胶质瘤细胞的增殖、凋亡机制提供理论基础。
[0066] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
