抗体前药偶联物及其制备和应用

摘要

本发明公开了一种抗体前药偶联物及其制备和应用。所述抗体前药偶联物由抗体和官能团受保护的前药分子通过微环境响应的连接子偶联而成，结构为：其中Ab为抗体，L代表连接抗体和药物分子的连接单元，D代表药物分子，X为药物分子上被保护的官能团，Caging代表保护基团。本发明的抗体前药偶联物具有增强的组织穿透力和较低的毒副作用，可用于治疗肿瘤、免疫疾病或者感染性疾病。特别的，靶向肿瘤的抗体前药偶联物受到肿瘤微环境刺激释放出前药分子，前药分子对于正常细胞没有杀伤，深入到肿瘤组织后被特异性激活，相对于现有的ADC药物分子提高了肿瘤穿透力，降低了毒副作用，表现为良好的肿瘤治疗效果。

权利要求

1.一种抗体前药偶联物或其药学上可接受的盐，所述抗体前药偶联物中的药物分子为阿霉素，阿霉素糖环上的氨基被四嗪分子脱除的反式环辛烯保护基保护；连接抗体和药物分子的连接单元的一端通过酰肼结构与阿霉素13位羰基形成肿瘤微环境pH响应的酰腙键，另一端通过马来酰亚胺结构和抗体上游离的巯基形成C-S键；所述抗体前药偶联物的结构式如下：其中，Ab为抗体。

2.如权利要求1所述的抗体前药偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，结构式中Ab为具有肿瘤靶向作用的全长抗体或抗体片段。

3.如权利要求2所述的抗体前药偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，Ab为针对Her2靶点的全人源单克隆抗体Trastuzumab。

4.权利要求1～3任一所述抗体前药偶联物的制备方法，先对药物分子进行官能团的保护，然后将官能团被保护的药物分子与连接子反应，再与抗体连接，得到所述抗体前药偶联物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将阿霉素和化合物2在有机溶剂中，有机碱作为催化剂，10-100℃条件下反应过夜，得到化合物3；

2)化合物3与6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐在有机溶剂中，有机酸作为催化剂，室温反应过夜，得到化合物4，即肿瘤微环境pH响应的反式环辛烯保护的阿霉素前药TCO-Dox-Mal；

3)化合物4与还原好的trastuzumab单抗在PBS缓冲液体系，0～60℃条件下反应0.5-

24h，得到抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO；

6.权利要求1～3任一所述的抗体前药偶联物或者其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

说明书

抗体前药偶联物及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术药物领域，具体涉及一种抗体前药偶联物(ProADC)的制备方法及其用途。

背景技术

[0002] 在肿瘤领域，化疗依然是目前最主要的治疗手段之一，但是由于毒副作用等原因，极大地限制了其发展。抗体药物偶联物(ADC)的出现为上述问题提供了一种新的解决思路。通过将药物分子和抗体进行偶联，人们利用抗体分子的靶向性将药物分子输送到肿瘤周围，从而实现肿瘤特异性杀伤。到目前为止，全球已经有4个ADC药物上市，有超过40个ADC药物正处于临床研发阶段，整体来看，ADC药物发展前景广阔。

[0003] 但是对于ADC药物来说，由于尺寸太大、细胞内化速率慢等原因，ADC药物组织穿透能力差，因此在实体瘤治疗中作用效果不佳。在这种情况下，通过肿瘤微环境敏感的连接子将药物分子和抗体相连，人们设计出了肿瘤微环境响应释放的ADC药物。这种方式获得的ADC药物能够在到达肿瘤周围后释放出尺寸小、扩散快的小分子药物，因而实现更好的肿瘤穿透力。但是，这种肿瘤释放的ADC药物依然存在着问题。由于大部分肿瘤微环境响应的连接子都具有较差的代谢稳定性，再加上肿瘤微环境的异质性，许多释放型的ADC药物分子会出现提早释放小分子药物的情况。这些小分子药物会扩散到临近的正常细胞，造成旁观者毒性。

[0004] 因此，针对目前ADC药物存在的问题，亟需一种既能够解决药物组织穿透力又能够降低药物毒副作用的新方法。

发明内容

[0005] 为解决上述问题，本发明旨在开发一种抗体前药偶联物(ProADC)。通过肿瘤微环境响应的连接子将抗体与前药分子进行偶联形成抗体前药偶联物。抗体前药偶联物在靶向肿瘤后，受到肿瘤微环境刺激，释放出前药分子。前药分子对于正常细胞没有杀伤，深入到肿瘤组织后能被特异性激活。本发明整体上提高了ADC药物分子的肿瘤穿透力，降低了药物分子毒副作用。

[0006] 具体的，本发明提供了一种如式1所示的抗体前药偶联物或者其药学上可接受的盐。

[0007]

[0008] 式1中，Ab为抗体；

[0009] L代表任选的可用于抗体和药物分子连接的连接单元；

[0010] D代表药物分子；

[0011] X为药物分子上被保护的官能团；

[0012] Caging代表保护基团；

[0013] n为大于0的整数。

[0014] 优选的，式1中Ab为具有肿瘤靶向作用的全长抗体或抗体片段。通常所述全长抗体包含两条重链和两条轻链，重链和轻链之间通过二硫键结合。所述抗体片段为通过化学试剂或基因工程获得的非全长的抗体。

[0015] 在本发明的一个应用实例中Ab为全人源单克隆抗体Trastuzumab 针对Her2靶点，用于治疗Her2受体高表达的肿瘤。

[0016] 优选的，式1中L为肿瘤微环境响应断裂的连接子。

[0017] 更优选的，L为肿瘤微环境pH响应的连接子、还原响应的连接子或酶响应的连接子。其中，pH响应的连接子包括但不限于棕键、碳酸酯键、磷酸酯键及其衍生物，还原响应的连接子包括但不限于谷胱甘肽(GSH)响应的二硫键、过氧化氢(H2O2)响应的苯硼酸酯键及其衍生物，酶响应的连接子包括但不限于组织蛋白酶B(Cathepsin B)切割的化学键、磷酸酯酶(Phosphoesterase)切割的化学键、羧酸酯酶(Carboxylesterase)切割的化学键及其衍生物。

[0018] 在本发明的一个应用实例中，L为肿瘤微环境pH响应的连接子，其具体结构是式2所示的化合物中的马来酰亚胺结构和抗体上游离的巯基发生1,4加成反应形成稳定的C-S键，以及酰肼结构和药物分子上的羰基反应形成对肿瘤微环境pH响应的酰棕键，从而将抗体和药物分子连接起来。

[0019]

[0020] 优选的，式1中D为DNA烷化剂、DNA嵌入剂、微管蛋白结合剂、酶抑制剂、免疫调控剂等。

[0021] 在本发明的一个应用实例中D为阿霉素。阿霉素13位羰基与式2所示化合物上的酰肼形成肿瘤微环境pH响应的酰棕键。

[0022] 优选的，式1中X为所选药物分子上的氨基、巯基、羟基或者羧基。

[0023] 在本发明的一个应用实例中X为药物分子阿霉素糖环上的氨基。

[0024] 优选的，式1中Caging为四嗪分子脱除的反式环辛烯保护基(TCO)、过渡金属脱除的烯丙基保护基、过渡金属脱除的炔丙基保护基或其类似物、光脱除的邻硝苄基(ONB)或其类似物、TCO脱除的对叠氮苄基(PAB)或其类似物。

[0025] 在本发明的一个应用实例中Caging为四嗪分子脱除的反式环辛烯保护基(TCO)，其中所述四嗪分子为1,2,4,5-二甲基四嗪。

[0026] 本发明的抗体前药偶联物在制备时，通常是先对药物分子进行官能团的保护，然后官能团被保护的药物分子与连接子反应，再与抗体连接，得到所述抗体前药偶联物。

[0027] 下面以肿瘤微环境pH响应的反式环辛烯保护的阿霉素前药TCO-Dox-Mal及其抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO为例，说明本发明的抗体前药偶联物的制备流程。本领域技术人员应该了解，基于下述的制备思路，根据本领域的公知技术可以对各步骤进行改动和补充，从而制备出不同组成、结构和用途的各种抗体前药偶联物。

[0028] 抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO的制备过程包括以下步骤：

[0029]

[0030]

[0031] 1)将阿霉素(Dox)和化合物2在有机溶剂中，有机碱作为催化剂，10-100℃条件下反应过夜，得到化合物3；

[0032] 2)化合物3与6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐(6-Maleimidocaproic Acid Hydrazide,Trifluoroacetic Acid)在有机溶剂中，有机酸作为催化剂，室温反应过夜，得到肿瘤微环境pH响应的反式环辛烯保护的阿霉素前药TCO-Dox-Mal(化合物4)；

[0033] 3)化合物4与还原好的trastuzumab单抗(HS-Ab)在PBS缓冲液体系，0～60℃条件下反应0.5-24h，得到抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO。

[0034] 上述步骤1)中所述有机溶剂例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)等；作为催化剂的有机碱例如三乙胺、乙二胺、哌啶、N,N-二异丙基乙胺(DIEPA)、吡啶、二甲氨基吡啶(DMAP)等。

[0035] 上述步骤2)反应所用的有机溶剂例如甲醇(MeOH)、乙醇、乙醚、四氢呋喃(THF)、1,4-环氧六烷等；作为催化剂的有机酸例如甲酸、乙酸、三氟乙酸(TFA)等。

[0036] 本发明提供的抗体前药偶联物或者其药学上可接受的盐，以及以此为基础的药物组合，可用于治疗肿瘤、免疫疾病或者感染性疾病。通过肿瘤微环境响应的连接子将抗体和前药分子连接起来，形成抗体前药偶联物，具有增强的肿瘤组织穿透力和较低的毒副作用，最终表现为良好的肿瘤治疗效果。

附图说明

[0037] 图1为抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO的制备流程图。

[0038] 图2为SDS-PAGE表征抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO，其中(a)为考马斯亮蓝染色结果，(b)为荧光成像结果。

[0039] 图3为抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO在肿瘤微酸性条件下穿透力测试结果。

[0040] 图4为抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO在肿瘤微酸性条件下的肿瘤细胞杀伤作用测试结果。

[0041] 图5显示了抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO在Her2MDA-MB-231肿瘤模型上具有良好的靶向作用。

[0042] 图6为抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO在Her2MDA-MB-231肿瘤模型上的治疗效果图，其中A和B分别为不同实验组小鼠的肿瘤体积和小鼠体重随时间的变化曲线。

具体实施方式

[0043] 实施例1.肿瘤微环境pH响应的反式环辛烯保护的阿霉素前药(TCO-Dox-Mal)的合成TCO-Dox-Mal的合成路线如下：

[0044]

[0045]

[0046] (一)化合物1的合成

[0047] 1L石英瓶中加入环辛烯-2-醇((Z)-cyclooct-2-en-1-ol)(8.5g,67mmol)、苯甲酸甲酯(methyl benzoate)(9.2g,67mmol)、500mL无水乙醚和1000mL正己烷。反应液经过光照反应24h，光源波长为254nm，强度为300W。光反应期间，反应体系通过蠕动泵进行循环，通过硝酸银硅胶柱(硝酸银和硅胶质量分数比为25:200)进行产物富集，蠕动泵流速为18mL/min。反应结束后，将硝酸银硅胶取出，加入500mL氨水搅拌5min，然后用1000mL二氯甲烷萃取。合并有机相，通过旋转蒸发仪取出溶剂后，用柱层析进行纯化。洗脱体系为乙酸乙酯:石油醚＝1:50(体积比)。纯化得到化合物1。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm):5.98-5.91(m,1H),5.59-5.55(d,1H),4.61(s,1H),2.50-2.47(m,1H),2.07-1.81(m,4H),1.70-1.42(m,4H),
1.15-1.06(m,1H),0.8-0.72(m,1H).GC-MS/MS(m/z):calcd.for C8H14O,126.10392；found 
126.10415.

[0048] (二)化合物2的合成

[0049] 50mL单口瓶中加入化合物1(304mg,2.41mmol)和15mL二氯甲烷。体系冷却到0℃后，分别加入二甲氨基吡啶(4-(N,N-Dimethylamino)pyridine)(1.16g,9.50mmol)和对硝基氯甲酸苯酯(4-nitrophenylchloroformate)(0.9g,4.46mmol)。然后将反应体系放置室温，搅拌反应过夜。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，然后进行柱层析纯化。柱层析洗脱体系为乙酸乙酯:石油醚＝1:10(体积比)。纯化得到化合物2。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm):8.29-8.26(d,2H),7.41-7.38(d,2H),6.02-5.94(m,1H),5.59-5.54(d,1H),5.44(s,1H),2.55-2.50(m,1H),2.25-2.20(dd,1H),2.11-1.69(m,4H),1.60-1.50(m,2H),1.26-
1.13(m,1H),0.88-0.8(m,1H).GC-MS/MS(m/z):calcd.for C15H17NO5,291.11067；found 
291.11075.

[0050] (三)化合物3的合成

[0051] 将化合物2(20mg,0.0687mmol)溶解于2mL DMF溶剂中，然后分别加入N,N-二异丙基乙胺(Diisopropylethylamine)(80mg,0.62mmol)和阿霉素盐酸盐(Doxorubicin hydrochloride)(45mg,0.0776mmol)。反应体系在室温条件下搅拌过夜，反应结束后，用旋转蒸发仪去除溶剂，通过柱层析进行纯化。柱层析洗脱体系为CH2Cl2:MeOH＝50:1(体积比)。纯化得到化合物3。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm):13.97(s,1H),13.23(s,1H),8.04-8.02(d,1H),7.80-7.76(dd,1H),7.39-7.37(d,1H),5.81-5.70(m,1H),5.50-5.43(m,2H),5.28-
5.23(d,2H),5.09-5.07(d,1H),4.74(s,2H),4.16-4.11(q,1H),4.07(s,3H),3.86(s,1H),
3.68(s,1H),3.28-3.24(d,1H),3.03-2.98(d,2H),2.42(m,1H),2.34-2.30(d,1H),2.18-
2.14(d,1H),2.03-1.77(m,7H),1.61(m,3H),1.47-1.44(m,1H),1.29-1.28(d,3H),1.01(m,
1H),0.75(m,1H).HRMS(m/z):calcd.for C36H41NO13,695.25779；found[M+H]+:
696.26570,[M+NH3+H]+:713.29153,[M+Na]+:718.24760.

[0052] (四)化合物4的合成

[0053] 将化合物3(69.5mg,0.1mmol)溶解在20mL无水乙醇中，然后依次加入6-马来酰亚胺己酰肼三氟乙酸盐(6-maleimidocaprohydrazide trifluoroacetate salt)(101.8mg,0.3mmol)和5.6μL三氟乙酸(TFA)。反应体系在常温下避光搅拌12h，反应结束后将反应体系用甲醇进行稀释，通过HPLC进行纯化。HPLC纯化条件为5-95％乙腈进行梯度洗脱，洗脱流速为25mL/min。纯化得到化合物4(TCO-Dox-Mal)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ(ppm):13.98(s,
1H),13.23(s,1H),10.21(s,1H),8.04-8.02(d,1H),7.80-7.76(t,1H),7.40-7.38(d,1H),
6.66(s,2H),5.81-5.70(m,1H),5.53-5.44(m,2H),2.28-2.23(d,2H),4.76-4.67(d,2H),
4.15-4.11(m,1H),4.08(s,3H),3.88(s,1H),3.69-3.67(d,1H),3.52-3.48(m,2H),3.33-
3.24(m,1H),2.98-2.90(d,1H),2.57-2.14(m,3H),2.08-1.80(m,6H),1.70-1.54(m,4H),
1.30-1.24(m,8H),1.06-0.97(m,1H),0.87-0.84(m,1H),0.79-0.71(m,1H).13C NMR(CDCl3,
500MHz)δ(ppm):213.93,187.09,186.68,170.91,162.83,161.04,156.18,155.67,155.06,
135.77,135.50,134.08,134.04,133.61,131.78,131.25,120.88,119.85,118.44,111.58,
111.38,100.72,74.13,69.68,69.58,67.30,65.55,60.42,56.69,53.43,46.83,40.61,
37.73,36.67,35.87,34.01,31.59,30.24,28.31,26.47,24.05,22.66,21.06,16.86,
14.20.HRMS(m/z):calcd.for C46H54N4O15,902.35857；found[M+NH3+H]+:920.39239.[0054] 实施例2.抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO的制备和DAR的测定

[0055] 抗体前药偶联物的制备流程参见图1。将10mg trastuzumab单抗溶解于10mL PBS溶液中，然后加入DTT(33.3μL,3.33μmol)在37℃还原30min。反应结束后，将还原好的trastuzumab单抗用PD 10脱盐柱进行脱盐，然后离心浓缩到10mg/mL备用。准备好100mM的TCO-Dox-Mal DMSO溶液，取33.3μL加入到上述10mg/mL还原后的单抗溶液中。然后反应体系在4℃进行1h。结束后，进行重复脱盐浓缩，最终得到抗体前药偶联物。其中，抗体前药偶联物的浓度由Nanodrop上A280测得(1mg/mL＝1.4AU)。Dox的浓度由紫外光检测器上495nm吸收光获得(Dox吸光系数为ε495＝8030cm-1M-1)。由此得到的抗体偶联物最终浓度为66.67μM，DAR之为3。

[0056] 实施例3.SDS-PAGE表征抗体前药偶联物

[0057] 取16μL10mg/mL抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO和同等体积、浓度的抗体，分别加入4μL SDS-PAGE上样缓冲液，然后在95℃煮样30min，让蛋白充分变性。然后取10μL煮好的样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为12％聚丙烯酰胺胶，100V电压1h。结束后，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色后用ChemiDoc XRS+molecular imager(分子成像仪)进行显影，如图2所示。其中用到的通道有Comassie channel和fluorescence channel(exct:488nm).[0058] 实施例4.抗体前药偶联物在肿瘤微酸条件下穿透力的测定

[0059] 首先将96孔板中铺上一层DMEM琼脂基质胶(100mL DMEM中含有2mg琼脂)。待基质胶凝固后，种入Her2受体高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞。种植方法为每孔100μL，种植密度为每孔10000个细胞，细胞培养条件为37℃下5％CO2，使用的培养基为含有10％FBS的DMEM。细胞培养2周后，在光镜下观察3D细胞团生长状况及形态，挑选出形态圆滑，大小在100-500μm的3D细胞进行穿透力测定。

[0060] 然后，将抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO分别置于正常生理条件pH 7.4和模拟肿瘤微环境pH 6.5的PBS溶液中孵育24h，此时药物浓度为1mM(按Dox含量来计算)，孵育温度为37℃。然后，将两种条件下的抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO分别加入上述准备好的3D细胞中，药物最终浓度为10μM，孵育条件为37℃下5％CO2，孵育3h。实验结束后，将3D细胞用100μL PBS洗3次，然后通过荧光共聚焦显微镜进行成像实验。成像模式为z-staking，扫描范围为5-50μm，激发波长为488nm。

[0061] 实验结果如图3所示，我们发现，抗体前药偶联物在肿瘤微酸性环境下具有更好的肿瘤穿透力，其穿透力可达50μm。

[0062] 实施例5.抗体前药偶联物在肿瘤微酸条件下细胞杀伤能力的测定

[0063] 首先在96孔板中种植Her2受体高表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞。种植方法为每孔100μL，种植密度为每孔2000个细胞，细胞培养条件为37℃下5％CO2，使用的培养基为含有
10％FBS的DMEM。然后，将抗体前药偶联物Ab-Dox-TCO分别置于正常生理条件pH7.4和模拟肿瘤微环境pH 6.5的PBS溶液中孵育24h，此时药物浓度为1mM(按Dox含量来计算)，孵育温度为37℃。当细胞培养1天后，分别加入不同浓度的上述抗体前药偶联物，继续孵育细胞。细胞培养第2天，用100μL PBS洗细胞3次，更换新鲜培养基继续细胞培养。随后在实验组加入
1.5倍当量的前药激活剂1,2,4,5-二甲基四嗪(Me2TZ)，对照组则加入等体积的PBS。细胞培养第4天，用100μL PBS洗细胞3次，更换新鲜培养基。加入MTS试剂(20μL/孔)继续孵育1h，然后在酶标仪下记录每个组在490nm处的吸光值，以此计算细胞活力。

[0064] 通过实验结果我们发现，无论是正常生理条件下还是肿瘤微酸性条件下，我们的抗体前药偶联物都不能杀死肿瘤细胞。当加入前药激活剂1,2,4,5-二甲基四嗪(Me2TZ)后能有效的恢复前药的活性。特别地，在肿瘤微酸性条件下我们的抗体前药偶联物在加入前药激活剂1,2,4,5-二甲基四嗪(Me2TZ)后具有最佳的肿瘤杀伤效果，如图4所示。

[0065] 实施例6.抗体前药偶联物在Her2MDA-MB-231肿瘤模型中的靶向能力测定[0066] 首先我们准备了Her2受体高表达的MDA-MB-231小鼠肿瘤模型。取3-4周的雌性BABL/C裸鼠10只，分别于腋下接种2×106个Her2受体高表达的MDA-MB-231细胞，然后在无菌级环境下饲养，待肿瘤大小至100mm3开始实验。

[0067] 将抗体前药偶联物标记上CY5荧光，标记方法为10mg/mL抗体前药偶联物中加入10倍当量的NHS-CY5，37℃反应2h，反应结束后将反应体系通过PD 10脱盐柱进行脱盐，然后离心浓缩到10mg/mL备用。

[0068] 按照50mg/kg的剂量向上述Her2MDA-MB-231小鼠注射CY5标记的抗体前药偶联物，对照组则注射等当量的NHS-CY5。注射3h后，在小动物成像仪中观察小鼠全身药物的分布。实验中用到的通路为Cy5channel。

[0069] 实验结果如图5所示，可以看出，我们的抗体前药偶联物具有非常好的肿瘤组织富集效果。

[0070] 实施例7.抗体前药偶联物在Her2MDA-MB-231肿瘤模型中的治疗效果测定[0071] 首先我们准备了Her2受体高表达的MDA-MB-231小鼠肿瘤模型。取3-4周的雌性BABL/C裸鼠30只，分别于腋下接种2×106个Her2受体高表达的MDA-MB-231细胞，然后在无3
菌级环境下饲养，待肿瘤大小至30-50mm开始实验。

[0072] 实验分为三组，第一组注射30mg/kg抗体前药偶联物，第二组注射30mg/kg抗体前药偶联物和3.3mg/kg前药激活剂1,2,4,5-二甲基四嗪(Me2TZ)，第三组注射等体积的PBS。其中，抗体前药偶联物在第2,6,9和12天给药，前药激活剂1,2,4,5-二甲基四嗪(Me2TZ)在随后的一天给药。治疗周期为2周，期间分别观测不同组肿瘤体积大小变化和小鼠体重变化。

[0073] 实验结果如图6所示，可以看出，PBS组和没有激活的抗体前药偶联物都没有肿瘤抑制效果，只有激活后的抗体前药偶联物能发挥良好的肿瘤杀伤作用(见图6中A)。通过小鼠体重变化我们发现，我们的抗体前药偶联物具有很好地生物安全性(见图6中B)。