一种CRISPR-Cas9介导的外显子定点突变技术在细胞系中应用

摘要

本发明公开了一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术，所述外显子定点突变技术为在基因内含子上插入荧光蛋白表达框，并运用细胞同源重组修复机制，在同源臂上引入需要修改的突变碱基。本发明还公开了所述外显子定点突变技术在细胞系外显子突变上的应用。

权利要求

1.一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变方法，其特征在于，所述外显子定点突变技术为在基因内含子上插入荧光蛋白表达框，并运用细胞同源重组修复机制，在同源臂上引入需要修改的突变碱基；

包括如下步骤：

步骤一、构建含有靶标KRAS序列的Cas9的质粒plenti‑sgKRAS；

步骤二、构建Kras同源臂Leftarm和Rightarm；

步骤三、构建含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G：将含有荧光蛋白表达框的pDonor‑dsRED用内切酶EcorV进行酶切，并将酶切获得的pDonor‑dsRED/EcorV与Leftarm和Rightarm进行体外同源重组、转化获得质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G；

步骤四、构建含有荧光蛋白表达框的供体DNA：将pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G用EcorV酶切进行线性化，并进行纯化，然后经高温变性成单链DNA，从而获得含有荧光蛋白表达框的供体DNA；

步骤五、HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正：将含有荧光蛋白表达框的供体DNA与质粒pLenti‑sgKRAS转染进入HCT116细胞系，获得基因修改的Kras G13纯合子HCT116细胞；

其中，所述质粒pDonor‑dsRED的序列如SEQ ID NO：12所示；

质粒plenti‑sgKRAS的构建方法为：步骤(1)、将单链DNA退火形成双链DNA分别对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序列进行溶解，接着，混合并放入PCR仪中进行退火，获得Kras‑Frag；

步骤(2)、用BsmBI酶切plentiCRISPR‑V2质粒；

步骤(3)、将Kras‑Frag和步骤(2)的酶切产物用T4 DNA连接酶试剂盒进行连接反应，获得plenti‑sgKRAS质粒。

2.如权利要求1所述的CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变方法，其特征在于，Kras同源臂Leftarm和Rightarm的构建方法为：以HEK293T基因组为模板，分别用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物序列以及用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物序列扩增上下游同源臂片段；接着，将扩增出来的产物经试剂盒回纯化后，获得Kras同源臂Leftarm和Rightarm。

3.一种如权利要求1或2所述的CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变方法在细胞系外显子突变上的应用。

4.一种如权利要求1或2所述的CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变方法在非治疗目的的肿瘤药物筛选、免疫细胞、干细胞研究上的应用。

5.一种含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G，其特征在于，所述质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G是先将含有荧光蛋白表达框的pDonor‑dsRED用内切酶EcorV进行酶切，再通过将酶切获得的pDonor‑dsRED/EcorV与Leftarm和Rightarm进行体外同源重组、转化获得，其中，pDonor‑dsRED的序列如SEQ ID NO：12所示；Leftarm和Rightarm是以HEK293T基因组为模板，分别用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物序列以及用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物序列扩增上下游同源臂片段；再将扩增出来的产物经试剂盒回纯化后获得。

6.一种含有荧光蛋白表达框的供体DNA，其特征在于，所述含有荧光蛋白表达框的供体DNA是将权利要求5所述的pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G用EcorV酶切进行线性化，然后将线性化的pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G纯化，并经高温变性获得。

7.一种如权利要求6所述的含有荧光蛋白表达框的供体DNA在HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正中的应用。

说明书

一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术在细胞系中

应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术在细胞系中应用。

背景技术

[0002] CRISPR‑Cas9是一种通用的高效的基因敲除技术。Cas9蛋白在细胞内gRNA的引导下能够通过碱基互补配对原则识别靶标的基因组DNA，并由Cas9蛋白的活性结构域对NGG序
列上游3‑4碱基之间的DNA进行剪切，产生双链DNA损伤(double‑strand break,DSB)。断裂
的DNA可以通过非同源末端连接(non‑homologous end  joining)或者同源重组
(homologous recombination)被修复。同源重组可以修复受损的DSB是我们对基因组进行
操作的基础。

[0003] CRISPR‑Cas9或TALEN核酸酶引起的基因组断裂时，在含有同源臂的DNA供体的条件下，细胞能够借助于同源臂对基因组进行修复，修复过程中，若供体DNA含有突变、DNA缺
失或者插入，则可将其引入基因组DNA。这是作为同源重组技术进行基因组突变的基础。遗
憾的是，这项技术成功率十分低下(0.01％～1％)，使得它的应用受到极大的限制。

[0004] Broad Institute中心的张峰与David.R.Liu基于CRISPR‑Cas9技术对Cas9进行失活突变后，融合表达一个可对DNA进行修饰的结构域，可高效完成非DNA剪切依赖的单碱基
修饰。但是其技术缺陷十分明显，其一，碱基编辑的范围不确定，除了能够编辑靶标DNA之
外，还有可能编辑周围的DNA；其二，Cas9通过gRNA识别基因组DNA，需要依赖基因组NGG PAM
序列，第三，它的脱靶效应十分严重。

[0005] 另外，对基因组外显子突变的研究主要集中于干细胞与胚胎操作，对于普通细胞系，尤其是肿瘤细胞系，这项操作的报道少之又少。

[0006] 此外，同源重组在自然条件下发生的概率非常低，传统的重组成功的细胞又缺乏筛选标记，很难与未重组成功的细胞区分开来。

[0007] 综上所述，一种能实现细胞系外显子高效突变、插入、缺失等操作且能快速筛选获得的同源重组技术将有巨大的市场需求和广阔的应用价值。

发明内容

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术，所述外显子定点突变技术为在基因内含子上插入荧光蛋白表达框，并运用细胞同源重组修复机
制，在同源臂上引入需要修改的突变碱基。本发明的第二个目的是提供一种CRISPR‑Cas9介
导的外显子定点突变技术的应用。本发明的第三个目的是提供一种CRISPR‑Cas9介导的外
显子定点突变技术在肿瘤药物筛选、免疫细胞、干细胞等研究上的应用。本发明的第四个目
的是提供一种质粒pDonor‑dsRED，用于构建单碱基编辑的供体模板DNA。本发明的第五个目
的提供一种含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G，用于构建单碱基编辑的供体
模板DNA。本发明的第六个目的是提供一种含有荧光蛋白表达框的供体DNA，用于制备Kras 
G13纯合子HCT116细胞。本发明的第七个目的是提供一种含有荧光蛋白表达框的供体DNA在
HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正中的应用。

[0009] 基于以上目的，作为本发明的第一个方面，一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术，所述外显子定点突变技术为在基因内含子上插入荧光蛋白表达框，并运用细胞同
源重组修复机制，在同源臂上引入需要修改的突变碱基。

[0010] 根据本发明，所述CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术，包括如下步骤：

[0011] 步骤一、构建含有靶标KRAS序列的Cas9的质粒plenti‑sgKRAS；

[0012] 步骤二、构建Kras同源臂Leftarm和Rightarm；

[0013] 步骤三、构建含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G：将含有荧光蛋白表达框的pDonor‑dsRED线性化，并将线性化的pDonor‑dsRED/EcorV与Leftarm和Rightarm
进行体外同源重组、转化获得含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G，该质粒
pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G含有荧光蛋白表达框；

[0014] 步骤四、含有荧光蛋白表达框的供体DNA的构建：将pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G用EcorV酶切进行线性化，并进行纯化，然后经高温变性成单链DNA，从而获得含有荧光蛋白表
达框的供体DNA；

[0015] 步骤五、HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正：将步骤四的含有荧光蛋白表达框的供体DNA与步骤一中的质粒pLenti‑sgKRAS转染进入HCT116细胞系，获得基因修改的
Kras G13纯合子HCT116细胞，从而实现在HCT116细胞中外显子高效定点突变、插入、缺失
等。

[0016] 根据本发明，步骤四的高温变性的温度为95℃，高温变性孵育时间为5min。

[0017] 根据本发明，质粒plenti‑sgKRAS的构建方法为：

[0018] 步骤一、将单链DNA退火形成双链DNA

[0019] 分别对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序列进行溶解，接着，混合并放入PCR仪中进行退火，获得Kras‑Frag；

[0020] 步骤二、用BsmBI酶切plentiCRISPR‑V2质粒；

[0021] 步骤三、将Kras‑Frag和步骤二的酶切产物用T4DNA连接酶试剂盒进行连接反应，获得plenti‑sgKRAS质粒。

[0022] 根据本发明，Kras同源臂Leftarm和Rightarm的构建方法为：以HEK293T基因组为模板，分别用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物序列以及用如SEQ ID NO：8和SEQ ID 
NO：9所示的引物序列扩增上下游同源臂片段；接着，将扩增出来的产物经试剂盒回纯化后，
获得Kras同源臂Leftarm和Rightarm。

[0023] 根据本发明，含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G的构建方法为：将pDonor‑dsRED质粒用内切酶EcorV进行酶切，获得线性化的pDonor‑dsRED/EcorV；接着，将
pDonor‑dsRED/EcorV、Leftarm和Rightarm进行体外同源重组、转化获得pDonor‑dsRED‑
Kras‑D13G。

[0024] 作为本发明的第二个方面，一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术在细胞系外显子突变上的应用。

[0025] 作为本发明的第三个方面，一种CRISPR‑Cas9介导的外显子定点突变技术在肿瘤药物筛选、免疫细胞、干细胞等研究上的应用。

[0026] 作为本发明的第四个方面，一种质粒pDonor‑dsRED，所述质粒的序列如SEQ ID NO：12所示。

[0027] 作为本发明的第五个方面，一种含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G，所述质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G是通过将线性化的pDonor‑dsRED/EcorV与
Leftarm和Rightarm进行体外同源重组、转化获得。

[0028] 作为本发明的第六个方面，一种含有荧光蛋白表达框的供体DNA，所述含有荧光蛋白表达框的供体DNA是将线性化的pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G纯化，并经高温变性获得。

[0029] 进一步的，高温变性的温度为95℃，高温变性孵育时间为5min。

[0030] 作为本发明的第七个方面，一种含有荧光蛋白表达框的供体DNA在HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正中的应用。

[0031] 本发明的有益效果是：

[0032] 1、在细胞系中实现含有荧光蛋白表达框的供体DNA的插入，并运用细胞同源重组修复机制，在同源臂上引入需要修改的突变碱基，并且可以通过观察其是否含有红色荧光
蛋白来判断是否为阳性克隆，相比于以往的同源重组，其操作简单；

[0033] 2、该技术的阳性克隆成功率高，能将外显子定点突变概率由原本的数千分之一提高到40％以上，极大程度地降低了细胞水平上的外显子定点突变的技术门槛，在肿瘤学、细
胞生物学、免疫学等研究领域有广泛的应用潜力。

附图说明

[0034] 图1为在293T细胞系中用plenti‑sgKras基因打靶后基因组测序峰谱。

[0035] 图2为供体DNA变性与非变性条件下的结果对比。其中，A.变性与非变性条件下，PCR验证随机24个HCT116单细胞克隆中成功重组的个数。B.变性条件下供体DNA条带位置发
生变化。C.野生型HCT116基因型测序峰谱与基因突变修复后HCT116基因型对比。

[0036] 图3为质粒pDonor‑dsRED的图谱。

[0037] 图4为实施例1‑5的实验流程图。

[0038] 图5为供体DNA的制备流程图。

具体实施方式

[0039] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0040] 以下实施例所用的试剂及质粒来源：

[0041] 1、以下实施例所使用的引物DNA均为申请人根据NCBI数据库中提供的序列信息自行择优选择，并由睿博新科生物有限公司进行合成，所有的测序均由睿博新科生物有限公
司完成；

[0042] 2、所有的内切酶均购自thermo scientific公司；

[0043] 3、T4DNA连接酶购自NEB公司；

[0044] 4、体外DNA同源重组酶购自苏州鸿迅生物有限公司；

[0045] 5、质粒plenti‑CRISPR‑V2购自于Addgene；

[0046] 6、质粒pcDNA3.1购自thermo‑scientific公司；

[0047] 7、HCT116，HEK293T细胞来自于美国ATCC

[0048] 8、质粒pDonor‑dsRED，如图3所示，质粒序列如SEQ ID NO：12所示，质粒pDonor‑dsRED的序列如下，其中下划线部分为荧光蛋白表达框(dsRed表达框)：

[0049] GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAA
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ACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGC
GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATAC
TCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATG
TATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC(SEQ ID NO：
12)

[0050] 实施例1plenti‑sgKRAS的构建与效果验证

[0051] 步骤一、Cas9sgRNA序列的获得

[0052] 提取NCBI数据库的KRAS G13(NM_004985.4)的第二号外显子上游的KRAS 2号内含子序列，并提交到http://www.rgenome.net/cas‑designer/网站进行设计，得到候选序列
TGGACCCTGACATACTCCCA(SEQ ID NO：1)，依照候选序列合成如下DNA序列(即Cas9sgRNA序
列)：

[0053] sgKras‑sense：caccTGGACCCTGACATACTCCCA(SEQ ID NO：2)

[0054] sgKras‑antisense：aaacTGGGAGTATGTCAGGGTCCA(SEQ ID NO：3)

[0055] 步骤二、将单链DNA退火形成双链DNA

[0056] 用TIANGEN公司质粒提取试剂盒中的bufferET分别对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序列进行溶解，使得各DNA序列的终浓度为10mM。分别取10μl上述溶液进行
混合，并放入PCR仪中进行退火。PCR程序为：95℃5min，随后每分钟降低2℃，直至4℃为止。
标记为Kras‑Frag。

[0057] 步骤三、对plentiCRISPR‑V2进行酶切

[0058] 依照说明书，用BsmBI对plentiCRISPR‑V2进行酶切。酶切体系如表1所示。

[0059] 表1 plentiCRISPR‑V2的酶切体系

[0060]plentiCRISPR‑V2 1μg
酶切缓冲液 2μl
BsmBI内切酶 0.5μl
无核酸酶水 16.5μl
总体积 20μl

[0061] 反应条件为37℃，1h。完成后经琼脂糖凝胶电泳，收取10000bp以上的条带，并用TIANGEN DNA纯化试剂盒进行回收，并溶解于40μl H2O中。标记为plentiCRISPR‑V2/BsmBI。

[0062] 步骤四、构建质粒plenti‑sgKRAS

[0063] 依照说明书，将步骤二、步骤三的产物用NEB公司的T4DNA连接酶试剂盒进行连接反应。反应体系如表2所示。

[0064] 表2 反应体系

[0065] plentiCRISPR‑v2/BsmBI 1μgKras‑Frag 2μl
连接缓冲液 1μl
T4DNA连接酶 1μl
无核酸酶水 6μl
总体积 10μl

[0066] 放入16℃水浴锅中，反应2h。然后进行大肠杆菌转化，涂板，挑取单克隆，并进行测序。测序成功的质粒即为plenti‑sgKRAS质粒。

[0067] 步骤五、基因敲除效率测试

[0068] (1)细胞培养

[0069] 293T细胞系用含有10％胎牛血清的DMEM(GIBCO公司)完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止
消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。

[0070] (2)细胞转染，筛选与检测

[0071] 用Thermo Scientific公司的转染试剂lipofectamin2000将步骤四的质粒plenti‑sgKRAS转染进入293T细胞系，经含0.5μg/L嘌呤霉素DMEM完全培养基筛杀72小时
后，用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，进行PCR。引物序列为：

[0072] gtest‑KRAS‑F：TTTCTCTGACCATTTTCAT(SEQ ID NO：4)

[0073] gtest‑KRAS‑R：ACTAGTACAATTAAATCTAA(SEQ ID NO：5)

[0074] PCR反应体系和反应条件分别如表3和表4所示。

[0075] 表3 PCR反应体系

[0076]

[0077]

[0078] 表4 PCR反应体系

[0079]

[0080] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳收取200bp左右条带，用gtest‑KRAS‑F作为测序引物进行sanger测序。测序显示质粒pLenti‑sgKRAS能高效切割基因组KRAS内含子。(如图1所示)。

[0081] 结论：质粒pLenti‑sgKRAS能高效切割基因组KRAS内含子。

[0082] 实施例2Kras同源臂的构建

[0083] Leftarm‑F：5’‑GGT GGA ATT CTG CA GAT ATC TGA GTT TGT ATT AAA AGG TA‑3’(下划线部分为载体序列，用于载体构建搭桥，下同)(SEQ ID NO：6)

[0084] Leftarm‑R：5’‑CAA TCC CCA AGA CAG CA A GGA AAG TAA AGT TCC CAT A‑3’

[0085] (SEQ ID NO：7)

[0086] Rightarm‑F：5’‑GTG TGC AGT CCA AGC CTG ATG TTC ACT CTC TGT GCA‑3’

[0087] (SEQ ID NO：8)

[0088] Rightarm‑R：5’‑GGC CGC CAC TGT GCT GGA TAT CGT AGA ATA AAT GCT AAA GTA‑3’(SEQ ID NO：9)

[0089] PCR酶是TAKARA公司的primestar，PCR反应体系和反应条件分别如表3和表4所示。

[0090] 表3 PCR反应体系

[0091]组分 体积 终浓度
Leftarm‑F(Rightarm‑F)(10μM) 0.4μl 0.2μM
Leftarm‑R(Rightarm‑R)(10μM) 0.4μl 0.2μM
2X primerstar Mix 10μl 1x
无核酸酶水 可变 ‑
HEK293T基因组DNA 1μg ‑
总体积 20μl ‑

[0092] 表4 PCR反应条件

[0093]

[0094] 反应35个循环。琼脂糖凝胶电泳收取1000bp左右条带，并用试剂盒纯化至40μl，获得Kras同源臂，标记为Leftarm,Rightarm。

[0095] 实施例3含有Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G的构建

[0096] 步骤一、将pDonor‑dsRED质粒用内切酶EcorV进行酶切，酶切体系如表5所示。

[0097] 表5酶切体系

[0098]

[0099]

[0100] 37℃酶切1h后进行琼脂糖凝胶电泳电泳，将两个条带用试剂盒纯化至40μl无核酸酶水中，命名为pDonor‑dsRED/EcorV。

[0101] 步骤二、含有荧光蛋白表达框的Kras同源臂的质粒pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G的构建

[0102] 用鸿迅Infusion酶进行体外同源重组，转化，体外同源重组的反应体系如表6所示。

[0103] 表6 体外同源重组的反应体系

[0104]Leftarm 3μl
Rightarm 3μl
pDonor‑dsRED/EcorV 4μl
2X Infusion酶 10μl
总体积 20μl

[0105] 50℃孵育1h，进行细菌转化。挑取单克隆进行测序。经扩培后，用Tiangen质粒提取试剂盒提取质粒备用。命名为：pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G。

[0106] 实施例4含有荧光蛋白表达框的供体DNA的构建

[0107] 将pDonor‑dsRED‑Kras‑D13G用EcorV酶切进行线性化。酶切体系如表7所示。

[0108] 表7酶切体系

[0109]

[0110]

[0111] 用试剂盒纯化DNA至50μl，取36μl加入4μl TE buffer，放入95℃高温变性孵育5min后取下即为荧光蛋白表达框的供体DNA，该供体DNA的制备流程如图5所示。

[0112] 实施例5HCT116细胞系中Kras G13D杂合子突变修正

[0113] 将实施例4的供体DNA与实施例1中的质粒pLenti‑sgKRAS转染进入HCT116细胞系，并经流式细胞仪分选得到基因修改Kras G13纯合子HCT116细胞。

[0114] 按照Lipofectamine2000试剂说明书，将5μg pLenti‑sgKRAS与2μg供体DNA转染进入HCT116细胞系中。

[0115] 将转染后24h的细胞用含有0.5μg/L嘌呤霉素的完全培养基进行筛杀，经72h后换成完全培养基培养72h。用贝克曼流式分选仪在488nm激发光下选取620nm波长下强阳性细
胞，并进行培养。为了提高阳性率，将细胞培养至一定数量再重复贝克曼流式分选步骤。

[0116] 细胞培养好后，用有限稀释法选出单克隆，用基因组DNA提取试剂盒提取单克隆DNA，并用PCR进行验证。PCR反应条件如表8所示。测序引物如下：

[0117] gTest‑KRAS‑F1:5’‑TAG CTG TTG CAT ATT GAC TT‑3’(SEQ ID NO：10)

[0118] gTest‑Red‑R:5’‑TGG CCC GTC GGT TGG ACA T‑3’(SEQ ID NO：11)

[0119] 其中gTest‑KRAS‑F1设计在基因组上同源臂外围，gTest‑Red‑R位于载体荧光蛋白表达框，原理上，只有同源重组成功的细胞系才能被这对引物扩增出约1000bp左右的条带。

[0120] 表8 PCR反应条件

[0121] HCT116基因组DNA 1μggTest‑KRAS‑F1 0.5μl
gTest‑Red‑R 0.5μl
2*primerstar Mix 10μl
无核酸酶水 8μl
总体积 20μl

[0122] 在挑取的24个单克隆细胞中，有11个细胞为阳性克隆。比例远高于传统同源重组方案(图2‑A)。

[0123] 阳性克隆经基因组DNA测序，如图2‑C，与野生型HCT116相比，G/A杂合子突变被修复成G/G纯合子突变，即阳性克隆均为Kras G13纯合子克隆。

[0124] 结论：阳性克隆成功率高，外显子定点突变概率达到45.8％，极大程度地降低了细胞水平外显子定点突变的技术门槛。

[0125] 实施例6外显子定点突变效率优化与比较

[0126] 在实施例4中，DNA在95℃变性孵育5min为本发明高效的关键。在该操作省略与否的条件下，外显子定点突变阳性率有极大差别。如图2‑A，结果显示，在未经高温变性条件
下，24个克隆中只有1个是阳性克隆；而一旦经过高温变性操作，有11个克隆为阳性克隆。因
此，供体DNA的变性能大幅降低该外显子定点突变技术的假阳性。

[0127] 综上所述，本发明同源重组的DNA供体中插入了dsRed红色荧光蛋白表达元件，一旦细胞中外显子被成功的替换掉，必定在相邻的内含子中插入了dsRed红色荧光蛋白表达
元件。由此，成功突变的细胞系能表达红色荧光蛋白，在贝克曼流式细胞仪下即可分选富集
(如图4所示)。

[0128] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技
术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依
据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本
发明的技术方案的范围内。