检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器及方法转让专利
申请号 : CN201910202397.5
文献号 : CN109946360B
文献日 : 2022-01-21
发明人 : 杨大威 , 缪鹏 , 陈锡峰 , 孟凡渝
申请人 : 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
摘要 :
本发明公开检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器及方法，传感器包括产生检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的电信号的第一电极，其表面修饰有CP‑DNA和通过碱基互补配对结合的TD‑DNA；检测方法为：将CP‑DNA修饰至第一电极表面；将TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面，获得二茂铁电信号后将第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号；读取浸泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算二茂铁电信号降低量、六铵合钌电信号增加量与hOGG1浓度之间的关系。本发明将杂交链式反应与生物传感器结合，待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低，具有显著的特异性和较高的稳定性，灵敏度高、快速、成本低。
权利要求 :
1.一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，所述传感器包括：
第一电极，其用于产生检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的电信号；所述第一电极表面修饰有CP‑DNA和通过碱基互补配对结合的TD‑DNA；
检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法包括以下步骤：将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面；
将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至所述第一电极表面，获得含有二茂铁电信号的第一电极；
将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号的第一电极；
读取浸泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算所述二茂铁电信号值变化量、所述六铵合钌电信号值变化量与hOGG1浓度之间的关系。
2.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，其还包括：
第二电极，其与所述第一电极组成电池；
第三电极，其具有恒定的电位以控制所述第一电极的电势。
3.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，互补配对进而结合前，所述第一电极表面还依次进行包括水虎鱼溶液浸泡、蒸馏水冲洗、打磨、超声清洗、电化学清洗的清洗预处理；
其中，所述水虎鱼溶液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。
4.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面之前，还包括对第一电极进行如下步骤的清洗预处理：
将第一电极在水虎鱼溶液中浸泡5分钟后用蒸馏水冲洗干净；
将冲洗后的第一电极依次用3000目和5000目的砂纸打磨以及1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨至光滑；
将打磨后的第一电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟；
将超声清洗后的第一电极在50％的HNO3溶液浸泡30分钟、0.5M H2SO4溶液中进行电化学清洗；
其中，所述水虎鱼溶液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。
5.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面，包括步骤：将所述第一电极与含有0.5μM CP‑DNA的溶液在25℃下反应16小时完成修饰；
将修饰后的第一电极依次进行1mM巯基乙醇中浸泡一个小时、蒸馏水中冲洗、氮气流中干燥的处理。
6.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至所述第一电极表面，包括步骤：
将CP‑DNA修饰的第一电极在37℃下与浓度为1μM的末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的溶液反应1小时。
7.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，包括步骤：在37℃的条件下将含有二茂铁电信号的第一电极浸泡在含有不同浓度的hOGG1溶液中，反应1小时；
在25℃的条件下将第一电极浸泡在含有0.5μM的Linker DNA、5μM H1及5μM H2溶液中，反应2小时。
8.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，在0.002U/mL至10U/mL的范围内，所述二茂铁电信号值变化量、所述六铵合钌电信号值变化量以及hOGG1浓度之间的关系满足回归方程：y＝0.551x+0.52；其中，y是所述六铵合钌电信号值变化量与所述二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是hOGG1浓度的对数。
9.如权利要求1所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其特征在于，还包括：
第二电极，其与所述第一电极组成电池；
第三电极，其具有恒定的电位以控制所述第一电极的电势。
说明书 :
检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及DNA糖苷酶检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器及方法。
背景技术
[0002] 8‑氧鸟嘌呤(8‑oxoG)是一种重要的DNA氧化损伤，是由氧自由基攻击DNA或RNA所形成的主要产物。在DNA复制时，8‑oxoG可以造成碱基颠换，可以激活原癌基因或抑制抑癌
基因的活力。
基因的活力。
[0003] hOGG1是一种单碱基切除修复酶，具有糖苷酶以及AP裂解酶的活性，可以特异性识别切除8‑oxoG，修复DNA的氧化损伤。hOGG1活性的改变可显著影响细胞修复8‑oxoG的能力、
个体肿瘤易感性以及对化疗药物的敏感性，实现hOGG1活性的检测为DNA修复机制与肿瘤之
间的关系提供重要的依据。因此，实现hOGG1快速、灵敏检测具有十分重要的意义。
个体肿瘤易感性以及对化疗药物的敏感性，实现hOGG1活性的检测为DNA修复机制与肿瘤之
间的关系提供重要的依据。因此，实现hOGG1快速、灵敏检测具有十分重要的意义。
[0004] 目前，已有的hOGG1活性检测方法主要有放射性同位素法、高效液相色谱法(HPLC)、反转录酶‑聚合酶链锁反应(RT‑PCR)和核酸内切酶切割法。然而，上述方法面临着
诸多问题，如费时费力，灵敏度低，操作复杂等。
诸多问题，如费时费力，灵敏度低，操作复杂等。
发明内容
[0005] 针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器，将待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低。
[0006] 本发明还提供一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，将杂交链式反应与生物传感器结合，具有显著的特异性和较高的稳定性，灵敏度高、快速、成本
低。
低。
[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明通过以下技术方案实现：
[0008] 本发明所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器，其包括：
[0009] 第一电极，其用于产生检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的电信号；所述第一电极表面修饰有CP‑DNA和通过碱基互补配对结合的TD‑DNA。
[0010] 优选的是，其还包括：
[0011] 第二电极，其与所述第一电极组成电池；
[0012] 第三电极，其具有恒定的电位以控制所述第一电极的电势。
[0013] 优选的是，互补配对进而结合前，所述第一电极表面还依次进行包括水虎鱼溶液浸泡、蒸馏水冲洗、打磨、超声清洗、电化学清洗的清洗预处理。
[0014] 其中，所述水虎鱼溶液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。
[0015] 一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，其包括以下步骤：
[0016] 将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面；
[0017] 将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至所述第一电极表面，获得含有二茂铁电信号的第一电极；
[0018] 将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号的第一电极；
[0019] 读取浸泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算所述二茂铁电信号值变化量、所述六铵合钌电信号值变化量与hOGG1浓度之间的关系。
[0020] 优选的是，将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面之前，还包括对第一电极进行如下步骤的清洗预处理：
[0021] 将第一电极在水虎鱼溶液中浸泡5分钟后用蒸馏水冲洗干净；
[0022] 将冲洗后的第一电极依次用3000目和5000目的砂纸打磨以及1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨至光滑；
[0023] 将打磨后的第一电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟；
[0024] 将超声清洗后的第一电极在50％的HNO3溶液浸泡30分钟、0.5M H2SO4溶液中进行电化学清洗。
[0025] 其中，所述水虎鱼溶液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。
[0026] 优选的是，将CP‑DNA修饰至所述第一电极表面，包括步骤：
[0027] 将所述第一电极与含有0.5μM CP‑DNA的溶液在25℃下反应16小时完成修饰；
[0028] 将修饰后的第一电极依次进行1mM巯基乙醇中浸泡一个小时、蒸馏水中冲洗、氮气流中干燥的处理。
[0029] 优选的是，将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至所述第一电极表面，包括步骤：
[0030] 将CP‑DNA修饰的第一电极在37℃下与浓度为1μM的末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的溶液反应1小时。
[0031] 优选的是，将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，包括步骤：
[0032] 在37℃的条件下将含有二茂铁电信号的第一电极浸泡在含有不同浓度的hOGG1溶液中，反应1小时；
[0033] 在25℃的条件下将第一电极浸泡在含有0.5μM的Linker DNA、5μM H1及5μM H2溶液中，反应2小时。
[0034] 优选的是，在0.002U/mL至10U/mL的范围内，所述二茂铁电信号值变化量、所述六铵合钌电信号值变化量以及hOGG1浓度之间的关系满足回归方程：y＝0.551x+0.52；
[0035] 其中，y是所述六铵合钌电信号值变化量与所述二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是hOGG1浓度的对数。
[0036] 优选的是，还包括：
[0037] 第二电极，其与所述第一电极组成电池；
[0038] 第三电极，其具有恒定的电位以控制所述第一电极的电势。本发明至少包括以下有益效果：
[0039] 1)本发明提供的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器，其设置有电极，该电极表面互补配对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA，从而将待测物质hOGG1
浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，具有显著的特异性和较高的稳定性；
浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，具有显著的特异性和较高的稳定性；
[0040] 2)本发明提供的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器的检测方法，包括步骤：将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面，获得含有二
茂铁电信号的第一电极；将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度的hOGG1溶液
中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号的第一电极；读取浸
泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算二茂铁电信号值变化量、六铵合钌电信号值变
化量以及hOGG1浓度之间的关系；该方法，一方面，采用杂交链式反应这一等温扩增方法实
现信号放大，进一步提高检测的灵敏度，同时成本大大降低；另一方面，采用的表面互补配
对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的第一电极，属于一种比率型电化
学的生物传感器，将待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL；再者，将生物传
感器与杂交链式反应结合，具有显著的特异性和较高的稳定性；也适用于血清等复杂生物
样品中的hOGG1活性的检测，是一种选择性和灵敏度较高的快速检测hOGG1活性的方法。
茂铁电信号的第一电极；将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度的hOGG1溶液
中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号的第一电极；读取浸
泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算二茂铁电信号值变化量、六铵合钌电信号值变
化量以及hOGG1浓度之间的关系；该方法，一方面，采用杂交链式反应这一等温扩增方法实
现信号放大，进一步提高检测的灵敏度，同时成本大大降低；另一方面，采用的表面互补配
对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的第一电极，属于一种比率型电化
学的生物传感器，将待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL；再者，将生物传
感器与杂交链式反应结合，具有显著的特异性和较高的稳定性；也适用于血清等复杂生物
样品中的hOGG1活性的检测，是一种选择性和灵敏度较高的快速检测hOGG1活性的方法。
[0041] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0042] 图1为本发明所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的示意图；
[0043] 图2为本发明的第一电极在不同修饰阶段的交流阻抗图；
[0044] 图3(a)‑3(b)分别为本发明的第一电极加入含有hOGG1的缓冲液前后测得的二茂铁电信号以及六铵合钌电信号的差分脉冲伏安信号图；
[0045] 图4(a)‑4(b)分别为本发明的第一电极加入含有不同浓度hOGG1的缓冲液测得的二茂铁电信号以及六铵合钌电信号的差分脉冲伏安图；
[0046] 图5(a)为本发明的hOGG1浓度所对应的二茂铁电信号值；
[0047] 图5(b)为本发明的hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号值；
[0048] 图5(c)为本发明的hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号值与二茂铁电信号值比值；
[0049] 图6为1U/mLhOGG1相对于其他过量(10U/mL)的干扰酶：限制性内切酶(EcoRI)，DNA聚合酶(Bst2.0DNApolymerase)、谷氨酰胺转移酶(TG)的检测效果；
[0050] 图7为本发明所述的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的流程图。
具体实施方式
[0051] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0052] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0053] <实施方式1>
[0054] 本发明提供一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器，如图1所示，该传感器包括用于产生检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的电信号的第一电极，其表面还修饰有CP‑DNA和
通过碱基互补配对结合的TD‑DNA。
通过碱基互补配对结合的TD‑DNA。
[0055] 具体地，该实施方式中，采用比率型电化学的方法，将CP‑DNA通过金巯键修饰至第一电极表面，再将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极
表面。此时，第一电极表面因存在大量具有电化学活性的二茂铁基团而得到显著的二茂铁
电信号。将第一电极浸入含待测样品hOGG1的缓冲液中，缓冲液中的hOGG1将特异性识别TD‑
DNA上的8‑oxoG位点，并实现切割。被切割后的TD‑DNA将从第一电极表面脱落，此时二茂铁
基团远离第一电极表面而导致二茂铁电信号显著减弱，同时第一电极表面修饰的CP‑DNA将
暴露出黏性末端而使第一电极表面发生杂交链式反应。第一电极表面杂交链式反应产物将
吸附电活性物质六铵合钌，会产生明显的六铵合钌电信号。进一步地，通过电化学工作站
CHI660D读出第一电极上的差分脉冲伏安信号，可计算加入待测样品后二茂铁电信号值的
变化量以及六铵合钌电信号值的变化量。经计算分析，六铵合钌电信号值的增加量与二茂
铁电信号值的降低量比值的对数与hOGG1浓度的对数在一定的范围内存在线性关系。
表面。此时，第一电极表面因存在大量具有电化学活性的二茂铁基团而得到显著的二茂铁
电信号。将第一电极浸入含待测样品hOGG1的缓冲液中，缓冲液中的hOGG1将特异性识别TD‑
DNA上的8‑oxoG位点，并实现切割。被切割后的TD‑DNA将从第一电极表面脱落，此时二茂铁
基团远离第一电极表面而导致二茂铁电信号显著减弱，同时第一电极表面修饰的CP‑DNA将
暴露出黏性末端而使第一电极表面发生杂交链式反应。第一电极表面杂交链式反应产物将
吸附电活性物质六铵合钌，会产生明显的六铵合钌电信号。进一步地，通过电化学工作站
CHI660D读出第一电极上的差分脉冲伏安信号，可计算加入待测样品后二茂铁电信号值的
变化量以及六铵合钌电信号值的变化量。经计算分析，六铵合钌电信号值的增加量与二茂
铁电信号值的降低量比值的对数与hOGG1浓度的对数在一定的范围内存在线性关系。
[0056] 因此，表面互补配对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的第一电极，属于一种比率型电化学的生物传感器，在8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性检测的过程
中，采集了包括二茂铁和六铵合钌的电信号；再通过检测中第一电极表面发生的杂交链式
反应，实现对电信号的放大，从而将待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，
灵敏度高、快速、成本低，具有显著的特异性和较高的稳定性，并且也适用于血清等复杂生
物样品中的hOGG1活性的检测，为DNA修复机制与肿瘤之间的关系提供重要的依据。
中，采集了包括二茂铁和六铵合钌的电信号；再通过检测中第一电极表面发生的杂交链式
反应，实现对电信号的放大，从而将待测物质hOGG1浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，
灵敏度高、快速、成本低，具有显著的特异性和较高的稳定性，并且也适用于血清等复杂生
物样品中的hOGG1活性的检测，为DNA修复机制与肿瘤之间的关系提供重要的依据。
[0057] 需要补充说明的是，第一电极可以是不同材质、不同尺寸的电极，满足互补配对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA后、便利插入含待测样品hOGG1的缓冲
液且产生二茂铁和六铵合钌两种电信号即可。本实施方式优选直径2mm的金电极。
液且产生二茂铁和六铵合钌两种电信号即可。本实施方式优选直径2mm的金电极。
[0058] 作为上述实施方式的优选，检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器还包括第二电极和第三电极。该实施方式提供了一种包括第一电极、第二电极以及第三电极的三电极系
统，具体地，第一电极为工作电极，第二电极为对电极，第二电极与第一电极组成电池，形成
一个通路，可用来测试电流；第三电极为参比电极，具有恒定的电位，第一电极和第三电极
组成另一个通路，可用来检测第一电极的电位，以控制第一电极的电势。作为进一步优选，
三个电极的材质依次为金、铂以及银‑氯化银。
统，具体地，第一电极为工作电极，第二电极为对电极，第二电极与第一电极组成电池，形成
一个通路，可用来测试电流；第三电极为参比电极，具有恒定的电位，第一电极和第三电极
组成另一个通路，可用来检测第一电极的电位，以控制第一电极的电势。作为进一步优选，
三个电极的材质依次为金、铂以及银‑氯化银。
[0059] 作为上述实施方式的优选，互补配对进而结合前，第一电极表面还依次进行包括水虎鱼溶液浸泡、蒸馏水冲洗、打磨、超声清洗、电化学清洗的清洗预处理，其中，水虎鱼溶
液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。该实施方式对第一电极分别进行了
物理清洗和化学清洗，为后续CP‑DNA通过金巯键修饰至第一电极表面、末端修饰有二茂铁
基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面做准备，并且提高了hOGG1的特
异性识与切割、被切割后二茂铁电信号显著减弱以及杂交链式反应后六铵合钌电信号显著
增加的检测精确性。
液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。该实施方式对第一电极分别进行了
物理清洗和化学清洗，为后续CP‑DNA通过金巯键修饰至第一电极表面、末端修饰有二茂铁
基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面做准备，并且提高了hOGG1的特
异性识与切割、被切割后二茂铁电信号显著减弱以及杂交链式反应后六铵合钌电信号显著
增加的检测精确性。
[0060] <实施方式2>
[0061] 在实施方式1提供的检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器基础上，本实施方式提供一种检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器进行检测的方法，如图7所示，其包括以下步
骤：
骤：
[0062] S1，将CP‑DNA修饰至第一电极表面；
[0063] S2，将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面，获得含有二茂铁电信号的第一电极；
[0064] S3，将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，获得含有六铵合钌电信号的第一电极；
[0065] S4，读取浸泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，计算二茂铁电信号值的变化量、六铵合钌电信号值的变化量与hOGG1浓度之间的关系。
[0066] 上述实施方式中，通过步骤S1和步骤S2，制成了表面互补配对进而结合有CP‑DNA和末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的第一电极，属于一种比率型电化学的生物传感器，在
8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性检测的过程中，采集了包括二茂铁和六铵合钌的电信号；再通
过检测中第一电极表面发生的杂交链式反应，实现对电信号的放大，从而将待测物质hOGG1
浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，灵敏度高、快速、成本低，具有显著的特异性和较高
的稳定性，并且也适用于血清等复杂生物样品中的hOGG1活性的检测，为DNA修复机制与肿
瘤之间的关系提供重要的依据。
8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶活性检测的过程中，采集了包括二茂铁和六铵合钌的电信号；再通
过检测中第一电极表面发生的杂交链式反应，实现对电信号的放大，从而将待测物质hOGG1
浓度的检测限大大降低至0.0008U/mL，灵敏度高、快速、成本低，具有显著的特异性和较高
的稳定性，并且也适用于血清等复杂生物样品中的hOGG1活性的检测，为DNA修复机制与肿
瘤之间的关系提供重要的依据。
[0067] 作为上述实施方式的优选，步骤S1之前，即将CP‑DNA修饰至第一电极表面之前，还包括步骤：
[0068] S0，对第一电极进行清洗预处理。
[0069] 该步骤S0还具体包括：
[0070] 将第一电极在水虎鱼溶液中浸泡5分钟后用蒸馏水冲洗干净；
[0071] 将冲洗后的第一电极依次用3000目和5000目的砂纸打磨以及1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末打磨至光滑；
[0072] 将打磨后的第一电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟；
[0073] 将超声清洗后的第一电极在50％的HNO3溶液浸泡30分钟、0.5M H2SO4溶液中进行电化学清洗。
[0074] 其中，水虎鱼溶液由浓度为98％的H2SO4和浓度为30％H2O2按3:1制成。
[0075] 该实施方式对第一电极分别进行了物理清洗和化学清洗，为后续CP‑DNA通过金巯键修饰至第一电极表面、末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第
一电极表面做准备，并且提高了hOGG1的特异性识与切割、被切割后二茂铁电信号显著减弱
以及杂交链式反应后六铵合钌电信号显著增加的检测精确性。
一电极表面做准备，并且提高了hOGG1的特异性识与切割、被切割后二茂铁电信号显著减弱
以及杂交链式反应后六铵合钌电信号显著增加的检测精确性。
[0076] 作为上述实施方式的优选，步骤S1中，将CP‑DNA修饰至第一电极表面，包括步骤：
[0077] 将第一电极与含有0.5μM CP‑DNA的溶液在25℃下反应16小时完成修饰；
[0078] 将修饰后的第一电极依次进行1mM巯基乙醇中浸泡一个小时、蒸馏水中冲洗、氮气流中干燥的处理。
[0079] 作为上述实施方式的优选，步骤S2中，将末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA与CP‑DNA互补配对进而结合至第一电极表面，包括步骤：
[0080] 将CP‑DNA修饰的第一电极在37℃下与浓度为1μM的末端修饰有二茂铁基团的TD‑DNA的溶液反应1小时。
[0081] 作为上述实施方式的优选，步骤S3中，将含有二茂铁电信号的第一电极浸入含有不同浓度hOGG1的缓冲液中，进行8‑羟基鸟嘌呤切割与杂交链式反应，包括步骤：
[0082] 在37℃的条件下将含有二茂铁电信号的第一电极浸泡在含有不同浓度的hOGG1溶液中，反应1小时；
[0083] 在25℃的条件下将第一电极浸泡在含有0.5μM的Linker DNA、5μM H1及5μM H2溶液中，反应2小时。
[0084] 进一步地，步骤S3中提及第一电极上产生杂交链式反应，为了证明该观点，设置含3‑/4‑
有hOGG1的缓冲液为含有1mM KCl的5mM[Fe(CN)6] 溶液，图2给出了第一电极在不同修饰
3‑/4‑
阶段的交流阻抗图；用于表征电极表面不同修饰阶段[Fe(CN)6] 的阻抗状态，同时初步
验证了本发明的可行性。
有hOGG1的缓冲液为含有1mM KCl的5mM[Fe(CN)6] 溶液，图2给出了第一电极在不同修饰
3‑/4‑
阶段的交流阻抗图；用于表征电极表面不同修饰阶段[Fe(CN)6] 的阻抗状态，同时初步
验证了本发明的可行性。
[0085] 具体地，图2中，曲线a为裸的第一电极的阻抗，曲线b为CP‑DNA修饰后的阻抗，曲线c为CP‑DNA/MCH修饰后的阻抗，曲线d为与TD‑DNA作用后的阻抗，曲线e为与hOGG1作用后的
阻抗，曲线f为与Linker DNA，H1，H2作用后的阻抗。典型的阻抗谱包含与扩散状态和电子转
移过程相对应的不同的线性部分和半圆部分。如图2所示，在裸的第一电极(曲线a)上没有
观察到明显的半圆区域，这是由于空间位阻和正电荷的平衡；在CP‑DNA修饰的第一电极(曲
线b)上出现一个较小半圆区域，这说明CP‑DNA修饰至第一电极的表面，阻碍了电荷的转移；
第一电极与巯基乙醇孵育后，半圆区域进一步变大(曲线c)；第一电极与TD‑DNA作用后，半
圆形区域进一步变大(曲线d)，这说明第一电极表面的CP‑DNA与TD‑DNA发生互补配对，进一
步阻碍了第一电极表面电荷的转移；第一电极与含有hOGG1样品孵育后，半圆形区域变小
(曲线e)，这说明hOGG1可以特异性识别切割TD‑DNA上的8‑oxoG，被切割后的TD‑DNA将脱离
第一电极表面，而导致阻抗有所下降。第一电极与Linker DNA，H1，H2作用后，半圆形区域显
著变大(曲线f)，这说明链式杂交反应发生在第一电极表面，其产物显著阻碍了第一电极表
面电荷的转移。
阻抗，曲线f为与Linker DNA，H1，H2作用后的阻抗。典型的阻抗谱包含与扩散状态和电子转
移过程相对应的不同的线性部分和半圆部分。如图2所示，在裸的第一电极(曲线a)上没有
观察到明显的半圆区域，这是由于空间位阻和正电荷的平衡；在CP‑DNA修饰的第一电极(曲
线b)上出现一个较小半圆区域，这说明CP‑DNA修饰至第一电极的表面，阻碍了电荷的转移；
第一电极与巯基乙醇孵育后，半圆区域进一步变大(曲线c)；第一电极与TD‑DNA作用后，半
圆形区域进一步变大(曲线d)，这说明第一电极表面的CP‑DNA与TD‑DNA发生互补配对，进一
步阻碍了第一电极表面电荷的转移；第一电极与含有hOGG1样品孵育后，半圆形区域变小
(曲线e)，这说明hOGG1可以特异性识别切割TD‑DNA上的8‑oxoG，被切割后的TD‑DNA将脱离
第一电极表面，而导致阻抗有所下降。第一电极与Linker DNA，H1，H2作用后，半圆形区域显
著变大(曲线f)，这说明链式杂交反应发生在第一电极表面，其产物显著阻碍了第一电极表
面电荷的转移。
[0086] 作为上述实施方式的优选，步骤S4中提及的读取浸泡后第一电极上的差分脉冲伏安信号，可通过电化学工作站CHI660D读取，为了验证方法的可行性，图3给出了第一电极加
入hOGG1前后测得的差脉冲伏安图的示例，图3(a)为第一电极加入含有hOGG1的缓冲液前后
测得的二茂铁电信号的差分脉冲伏安信号图；图3(b)为第一电极加入含有hOGG1的缓冲液
前后测得的六铵合钌电信号的差分脉冲伏安信号图。此时，含有hOGG1的缓冲液为10mM PBS
3+
溶液以及含有50μM[Ru(NH3)6] 的10mM Tris‑HCl溶液。
入hOGG1前后测得的差脉冲伏安图的示例，图3(a)为第一电极加入含有hOGG1的缓冲液前后
测得的二茂铁电信号的差分脉冲伏安信号图；图3(b)为第一电极加入含有hOGG1的缓冲液
前后测得的六铵合钌电信号的差分脉冲伏安信号图。此时，含有hOGG1的缓冲液为10mM PBS
3+
溶液以及含有50μM[Ru(NH3)6] 的10mM Tris‑HCl溶液。
[0087] 具体地，图3(a)中，当加入1U/mL的hOGG1后二茂铁电信号显著减小，这说明hOGG1发挥了酶切的活性，特异性剪切TD‑DNA上的8‑oxoG，被切割后的TD‑DNA将脱离电极表面，因
此二茂铁电信号显著减小。图3(b)中，当加入1U/mL的hOGG1后，六铵合钌电信号显著增大，
这说明hOGG1特异性剪切TD‑DNA上的8‑oxoG，被切割后的TD‑DNA将脱离第一电极表面，第一
电极表面的CP‑DNA将暴露出黏性末端而使第一电极表面发生链式杂交反应。大量杂交链式
反应产物将吸附电活性物质六铵合钌，产生明显的六铵合钌电信号。
此二茂铁电信号显著减小。图3(b)中，当加入1U/mL的hOGG1后，六铵合钌电信号显著增大，
这说明hOGG1特异性剪切TD‑DNA上的8‑oxoG，被切割后的TD‑DNA将脱离第一电极表面，第一
电极表面的CP‑DNA将暴露出黏性末端而使第一电极表面发生链式杂交反应。大量杂交链式
反应产物将吸附电活性物质六铵合钌，产生明显的六铵合钌电信号。
[0088] 因为hOGG1可以特异性识别并切割8‑oxoG位点，进而引发第一电极表面发生链式杂交反应，第一电极表面的链式杂交产物通过吸附六铵合钌实现第一电极表面电信号的放
大，可以通过差分脉冲伏安读数来评估不同的hOGG1浓度，同时可以通过两种电信号的比值
进一步提高检测的灵敏度。图4(a)‑(b)给出了不同浓度hOGG1得到的差分脉冲伏安图，图4
(a)是二茂铁电信号的差分脉冲伏安图，图4(b)是六铵合钌电信号的差分脉冲伏安图，
hOGG1的浓度分别为0，0.01U/mL，0.05U/mL，0.25U/mL，1U/mL，5U/mL，10U/mL。由图4(a)‑(b)
可知，二茂铁电信号随着hOGG1浓度的增加而减小，六铵合钌电信号随着hOGG1浓度的增加
而增大。
大，可以通过差分脉冲伏安读数来评估不同的hOGG1浓度，同时可以通过两种电信号的比值
进一步提高检测的灵敏度。图4(a)‑(b)给出了不同浓度hOGG1得到的差分脉冲伏安图，图4
(a)是二茂铁电信号的差分脉冲伏安图，图4(b)是六铵合钌电信号的差分脉冲伏安图，
hOGG1的浓度分别为0，0.01U/mL，0.05U/mL，0.25U/mL，1U/mL，5U/mL，10U/mL。由图4(a)‑(b)
可知，二茂铁电信号随着hOGG1浓度的增加而减小，六铵合钌电信号随着hOGG1浓度的增加
而增大。
[0089] 进一步地，步骤S4中，在0.002U/mL至10U/mL的范围内，二茂铁电信号值变化量、六铵合钌电信号值变化量与hOGG1浓度之间的关系满足回归方程：y＝0.551x+0.52；其中，y是
六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是hOGG1浓度的对数；
六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是hOGG1浓度的对数；
[0090] 为了进一步验证二茂铁电信号值变化量、六铵合钌电信号值变化量以及hOGG1浓度之间满足线性关系，图5(a)‑(c)给出了hOGG1浓度所对应的电信号值的校准图。其中，图5
(a)为hOGG1浓度所对应的二茂铁电信号值；图5(b)为hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号
值；图5(c)为hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号值与二茂铁电信号值比值；误差条表示三
2
次独立测量的相对标准偏差；R是标准差，n是重复次数；R＝0.991，n＝3。
(a)为hOGG1浓度所对应的二茂铁电信号值；图5(b)为hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号
值；图5(c)为hOGG1浓度所对应的六铵合钌电信号值与二茂铁电信号值比值；误差条表示三
2
次独立测量的相对标准偏差；R是标准差，n是重复次数；R＝0.991，n＝3。
[0091] 具体地，图5(a)所示，二茂铁电信号值的变化量在0.01U/mL至10U/mL的范围内显2
示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝‑0.39x+0.69(R ＝0.977，n＝3)，其中y
是二茂铁电信号值变化量，x是hOGG1浓度的对数。图5(b)，六铵合钌电信号值变化量在
0.01U/mL至10U/mL的范围内显示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝0.993x+
2
2.14(R ＝0.964，n＝3)，其中y是六铵合钌电信号值变化量，x是hOGG1浓度的对数。如图5
(c)所示，六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数在0.002U/mL至
2
10U/mL的范围内显示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝0.551x+0.52(R ＝
0.991，n＝3)，其中y是六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是
hOGG1浓度的对数。由结果可知，通过两种电信号比值，线性范围明显变大，检测限显著降
低。
示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝‑0.39x+0.69(R ＝0.977，n＝3)，其中y
是二茂铁电信号值变化量，x是hOGG1浓度的对数。图5(b)，六铵合钌电信号值变化量在
0.01U/mL至10U/mL的范围内显示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝0.993x+
2
2.14(R ＝0.964，n＝3)，其中y是六铵合钌电信号值变化量，x是hOGG1浓度的对数。如图5
(c)所示，六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数在0.002U/mL至
2
10U/mL的范围内显示与hOGG1水平的对数的线性关系，回归方程为y＝0.551x+0.52(R ＝
0.991，n＝3)，其中y是六铵合钌电信号值变化量与二茂铁电信号值变化量比值的对数，x是
hOGG1浓度的对数。由结果可知，通过两种电信号比值，线性范围明显变大，检测限显著降
低。
[0092] 作为上述实施方式的优选，检测8‑羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶的传感器还包括第二电极和第三电极。该实施方式提供了一种包括第一电极、第二电极以及第三电极的三电极系
统，具体地，第一电极为工作电极，第二电极为对电极，第二电极与第一电极组成电池，形成
一个通路，可用来测试电流；第三电极为参比电极，具有恒定的电位，第一电极和第三电极
组成另一个通路，可用来检测第一电极的电位，以控制第一电极的电势。作为进一步优选，
三个电极的材质依次为金、铂以及银‑氯化银。
统，具体地，第一电极为工作电极，第二电极为对电极，第二电极与第一电极组成电池，形成
一个通路，可用来测试电流；第三电极为参比电极，具有恒定的电位，第一电极和第三电极
组成另一个通路，可用来检测第一电极的电位，以控制第一电极的电势。作为进一步优选，
三个电极的材质依次为金、铂以及银‑氯化银。
[0093] 需要补充说明的是，为了证明本发明具有显著的特异性和高选择性，图6给出了1U/mLhOGG1相对于其他过量(10U/mL)的干扰酶：限制性内切酶(EcoRI)，DNA聚合酶
(Bst2.0DNApolymerase)、谷氨酰胺转移酶(TG)的检测效果的示例。
(Bst2.0DNApolymerase)、谷氨酰胺转移酶(TG)的检测效果的示例。
[0094] 具体地，图6中，在hOGG1测定和过量干扰酶之间存在显着的电化学信号差异，这一实验结果表明本方法具有显著的特异性。同时，通过在缓冲液体系以及血清体系中的检测
实验，证明本方法可以在血清等复杂样品中实现hOGG1的检测。因此，实验结果显示hOGG1特
异性识别8‑oxoG，进一步证实本方法的高选择性。
实验，证明本方法可以在血清等复杂样品中实现hOGG1的检测。因此，实验结果显示hOGG1特
异性识别8‑oxoG，进一步证实本方法的高选择性。
[0095] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言可容易地
实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限
于特定的细节和这里示出与描述的图例。
实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限
于特定的细节和这里示出与描述的图例。