三维石墨烯的酶促降解方法及其应用

摘要

本发明公开了一种三维石墨烯的酶促降解方法及其应用。所述三维石墨烯的酶促降解方法包括：对三维石墨烯进行活化处理，从而至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成活性官能团；利用所述的活性官能团至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成不连续的亲水性修饰层；利用所述亲水性修饰层至少在三维石墨烯表面连接酶的还原底物，所述的酶能够降解碳材料；以及，利用所述的酶降解连接有所述还原底物的三维石墨烯。本发明的酶促降解方法仅需对三维石墨烯进行三级表面修饰，制作工艺更加简单，成本更低，所需时间较短，生物相容性较高，能够加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率。

权利要求

1.一种三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于包括：

对三维石墨烯进行活化处理，从而至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成活性官能团；

利用所述的活性官能团至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成不连续的亲水性修饰层，所述亲水性修饰层的材质为亲水性修饰材料，所述亲水性修饰材料选自聚多巴胺、层粘连蛋白、多聚鸟氨酸、NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2中的任意一种或两种以上的组合；

利用所述亲水性修饰层至少在三维石墨烯表面连接酶的还原底物，所述酶的还原底物为儿茶酚，所述的酶能够降解碳材料，所述的酶为辣根过氧化物酶；

以及，利用所述的酶降解连接有所述还原底物的三维石墨烯。

2.根据权利要求1所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述的活化处理包括氧化处理，所述的活性官能团包括含氧官能团。

3.根据权利要求2所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于包括：至少选用氧化试剂或氧等离子体对所述三维石墨烯进行所述的氧化处理。

4.根据权利要求3所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述氧化处理的温度为30 50℃。

~

5.根据权利要求3所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述方法包括选用氧化试剂对所述三维石墨烯进行氧化处理20 40分钟。

~

6.根据权利要求3所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述方法包括选用氧等离子体对所述三维石墨烯进行氧化处理30s 5分钟。

~

7.根据权利要求3所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述氧化试剂为混酸，所述混酸为浓硫酸和浓硝酸的混合物。

8.根据权利要求7所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为2：1 4：1。

~

9.根据权利要求1所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述亲水性修饰层的厚度小于100nm。

10.根据权利要求9所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述亲水性修饰层包含开放的孔洞结构。

11.根据权利要求1、9或10所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁的99%以上的区域从所述亲水性修饰层中暴露出。

12.根据权利要求11所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述三维石墨烯的孔隙率为99.3 99.7%，孔径为100 300μm。

~ ~

13.根据权利要求1所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于包括：使亲水性修饰材料在具有所述活性官能团的三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上聚合，从而形成所述的亲水性修饰层，之后真空干燥。

14.根据权利要求13所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述聚合的温度为25 30℃，时间为30s～120min。

~

15.根据权利要求13所述的三维石墨烯的酶促降解方法，其特征在于：所述真空干燥的温度为25～35℃，时间为24～48h。

16.一种可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其特征在于包括：三维石墨烯，

厚度小于100nm的亲水性修饰层，其至少非连续的分布于所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上，所述亲水性修饰层的材质为亲水性修饰材料，所述亲水性修饰材料选自聚多巴胺、层粘连蛋白、多聚鸟氨酸、NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2中的任意一种或两种以上的组合；

酶的还原底物，其与所述亲水性修饰层共价连接，所述酶的还原底物为儿茶酚，所述的酶能够降解碳材料，所述的酶为辣根过氧化物酶。

17.根据权利要求16所述的可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其特征在于：所述亲水性修饰层的厚度小于100nm。

18.根据权利要求17所述的可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其特征在于：所述亲水性修饰层包含开放的孔洞结构。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其特征在于：所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁的99%以上的区域从所述亲水性修饰层中暴露出。

说明书

三维石墨烯的酶促降解方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种三维石墨烯的酶促降解方法，尤其涉及到一种能够加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率的表面修饰方法及其应用，属于石墨烯复合材料技术领域。

背景技术

[0002] 三维石墨烯(由二维石墨烯整合而成，具有三维宏观立体结构)已经在各领域引起了很大关注，因为它们不仅具有二维石墨烯的固有性质，还将二维石墨烯在纳米尺度的理化性能扩展到宏观领域，在各种应用中改进了性能，形貌因制备方法不同而不同。近几年，具有多孔结构、合适的力学性能和较好的生物相容性的三维石墨烯在生物医学领域也有着诸多应用，如在组织工程领域，三维石墨烯骨架结合骨髓间充质干细胞能显著促进皮肤伤口愈合；三维石墨烯作为支架促进神经干细胞的粘附、增殖和定向分化为功能性神经元。但在生物医学领域，三维石墨烯不可避免地遇到降解难题。到目前为止，业界研究者大多集中于体外体内的纳米级碳材料(如碳量子点、碳纳米管和二维石墨烯等)的降解，但从宏观到微观尺度的碳材料降解过程较少被研究。

[0003] 常见碳材料的绿色降解方法有化学和生物降解。化学降解方法可采用环境友好型的芬顿氧化技术，如中国专利申请公开号为CN105347430A的专利公开了一种使用紫外光结合芬顿法的方法，可以有效降解污水中的氧化石墨烯。生物降解可通过细菌和酶与碳材料相互作用。通过细菌降解碳材料属于环境生物技术领域，是生态友好和价廉的，如中国专利申请公开号为CN105013126A的专利是利用萘降解细菌将石墨材料进行氧化进而降解的。而在生物医学领域则不能简单依靠细菌，所以主要集中于酶促降解，且大多为过氧化物酶介导的氧化反应 (G.P.Kotchey,Advanced Drug Delivery Reviews,2013,65,1921-1932)，如辣根过氧化物酶 (HRP)和髓过氧化物酶等。

[0004] 体外降解碳材料的方法(B.L.Allen,Nano Letters,2008,8,3899-3903)：在4℃条件下，碳材料放入含0.385mg/mL HRP和少量80μM H2O2的PBS(pH 7.0)中进行避光静态孵育降解，并每2周取样和添补等量的H2O2。

[0005] 目前，国内外对三维石墨烯的酶促降解的研究还很少，只有M.Loeblein(M.Loeblein, Advanced Healthcare Materials,2016,5,1177-1191)等首次尝试了通过HRP/H2O2降解三维石墨烯，提出了三维石墨烯的2步氧化降解机理，使用氧等离子体处理三维石墨烯，使得三维石墨烯表面引入含氧官能团(如羟基等)，且发现氧等离子体处理后的三维石墨烯较单纯的三维石墨烯降解速率更快，即更易与辣根过氧化物酶反应，但单纯氧化后的三维石墨烯降解所需时间还是很长，且不能达到可控的酶促降解。

[0006] 目前，业界研究者大多集中于碳纳米管和二维石墨烯的酶促降解，如Yingjie Li等通过双硫键将聚乙二醇(PEG)修饰到纳米级氧化石墨烯(GO)表面，形成的GO-SS-PEG比GO-PEG 更易酶促降解且兼顾到生物相容性(Y Li,Small,2014,10,1544-1554)。Alberto Bianco等通过简单的氧化处理后对碳材料进行偶联具有增强酶降解功能的酶底物的表面修饰(如通过叠氮- 炔基的环加成反应引入香豆素衍生物和通过形成酰胺键引入的儿茶酚基团)促进了多壁碳纳米管和氧化石墨烯的生物降解(A.R.Sureshbabu,Biomaterials,2015,72,20-28；R.Kurapati,2D Materias,2018,5,015020)，虽然使得多壁碳纳米管和氧化石墨烯的生物降解速率显著得到提高，可以使得溶液中HRP更易富集材料附近，并通过儿茶酚和香豆素促进材料与HRP活性部位反应。但此小分子接枝反应的表面修饰方法所用的链接物价格较贵，步骤繁多，且很难推广应用于有着较强疏水性的三维石墨烯表面修饰进而使其更易降解。

发明内容

[0007] 本发明的主要目的在于提供一种三维石墨烯的酶促降解方法及其应用，以克服现有技术中的不足。

[0008] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

[0009] 本发明实施例提供了一种三维石墨烯的酶促降解方法，其包括：

[0010] 对三维石墨烯进行活化处理，从而至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成活性官能团；

[0011] 利用所述的活性官能团至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成不连续的亲水性修饰层；

[0012] 利用所述亲水性修饰层至少在三维石墨烯表面连接酶的还原底物，所述的酶能够降解碳材料；

[0013] 以及，利用所述的酶降解连接有所述还原底物的三维石墨烯。

[0014] 在一些实施方案中，所述的活化处理包括氧化处理，所述的活性官能团包括含氧官能团。

[0015] 进一步地，所述三维石墨烯的酶促降解方法包括：至少选用氧化试剂或氧等离子体对所述三维石墨烯进行所述的氧化处理。

[0016] 进一步地，所述氧化处理的温度为30～50℃。

[0017] 进一步地，所述方法包括选用氧化试剂对所述三维石墨烯进行氧化处理20～40分钟，或者选用氧等离子体对所述三维石墨烯进行氧化处理3～5分钟。

[0018] 进一步地，所述氧化试剂包括混酸，所述混酸包括浓硫酸和浓硝酸的混合物。

[0019] 进一步地，所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为2：1～4：1。

[0020] 进一步地，所述亲水性修饰层的厚度小于100nm。

[0021] 进一步地，所述亲水性修饰层包含开放的孔洞结构。

[0022] 进一步地，所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁的99％以上的区域从所述亲水性修饰层中暴露出。

[0023] 进一步地，所述三维石墨烯的孔隙率为99.3～99.7％，孔径为100～300μm。

[0024] 进一步地，所述亲水性修饰层的材质包括亲水性修饰材料，所述亲水性修饰材料包括聚多巴胺、层粘连蛋白、多聚鸟氨酸、NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2中的任意一种或两种以上的组合。

[0025] 在一些实施方案中，所述三维石墨烯的酶促降解方法包括：使多巴胺在具有所述活性官能团的三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上聚合，从而形成所述的亲水性修饰层，之后真空干燥。

[0026] 优选的，所述聚合的温度为25～30℃，时间为30s～120min。

[0027] 优选的，所述真空干燥的温度为25～35℃，时间为24～48h。

[0028] 进一步地，所述酶的还原底物包括儿茶酚，所述的酶包括辣根过氧化物酶。

[0029] 本发明实施例还提供了一种可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其包括：

[0030] 三维石墨烯，

[0031] 厚度小于100nm的亲水性修饰层，其至少非连续的分布于所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上；

[0032] 酶的还原底物，其与所述亲水性修饰层共价连接，所述的酶能够降解碳材料。

[0033] 与现有技术相比，本发明提供的三维石墨烯的酶促降解方法能够加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率。本发明的三维石墨烯的酶促降解方法仅需三级表面修饰，制作工艺更加简单，成本更低，所需时间较短，生物相容性较高，通过三级表面修饰后，使得三维石墨烯在体外HRP降解过程中更易与HRP的活性中心接触并反应，从而达到对三维石墨烯可控酶促降解的目的，与简单混酸氧化的三维石墨烯的酶促降解相比，显著提高了降解速率，降低了完全降解所需的时间。

附图说明

[0034] 图1是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯的三级表面修饰流程示意图。

[0035] 图2a-图2c分别是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯、氧化的三维泡沫石墨烯、三维泡沫石墨烯-聚多巴胺表面与水的接触角示意图。

[0036] 图3是本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺 -儿茶酚的酶促降解方法示意图。

[0037] 图4a-图4c分别是本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯第4周酶促降解后的不同放大倍数的扫描电子显微镜图。

[0038] 图4d-图4f分别是本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺-儿茶酚第4 周酶促降解后的不同放大倍数的扫描电子显微镜图。

[0039] 图5a、图5b分别是本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯和氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺-儿茶酚第1-4周酶促降解后的Raman图谱。

[0040] 图6a是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯的光学图像。

[0041] 图6b是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯的SEM图像。

[0042] 图6c是本发明一典型实施例中放置在水上的三维泡沫石墨烯的光学图像。

[0043] 图6d-图6f是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯的不同放大倍数的SEM图像。

[0044] 图6g是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯经混酸氧化后水洗的照片。

[0045] 图7是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯与氧化的三维泡沫石墨烯的拉曼表征对比示意图。

[0046] 图8是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯经不同氧等离子体处理后的拉曼表征对比示意图。

[0047] 图9是本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯、氧化的三维泡沫石墨烯、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺和聚多巴胺的热重分析曲线图。

[0048] 图10a-图10c分别是本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯氧化自聚合反应时间分别为10min、30min和120min的扫描电镜图。

具体实施方式

[0049] 鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是对三维石墨烯进行三级修饰，其中一级修饰为氧化处理；二级修饰为极薄且极不完整的纳米级薄膜；三级修饰为偶联儿茶酚基团，通过三级表面修饰后，使得三维石墨烯在体外HRP降解过程中更易与HRP的活性中心接触并反应，从而达到可控酶促降解。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

[0050] 本发明实施例的一个方面提供了一种三维石墨烯的酶促降解方法，其包括：

[0051] 对三维石墨烯进行活化处理，从而至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成活性官能团；

[0052] 利用所述的活性官能团至少在三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上形成不连续的亲水性修饰层；

[0053] 利用所述亲水性修饰层至少在三维石墨烯表面连接酶的还原底物，所述的酶能够降解碳材料；

[0054] 以及，利用所述的酶降解连接有所述还原底物的三维石墨烯。

[0055] 在一些实施方案中，所述的活化处理包括氧化处理，所述的活性官能团包括含氧官能团。轻微氧化引入了些许含氧官能团，出现了D峰，三维石墨烯经轻微氧化后表面没有明显改变，没有显著增加破坏程度。

[0056] 进一步地，所述三维石墨烯的酶促降解方法包括：至少选用氧化试剂或氧等离子体等对所述三维石墨烯进行所述的氧化处理。

[0057] 进一步地，所述氧化处理的温度为30～50℃。

[0058] 进一步地，所述方法包括选用氧化试剂对所述三维石墨烯进行氧化处理20～40分钟，或者选用氧等离子体对所述三维石墨烯进行氧化处理30s～5分钟。

[0059] 进一步地，所述氧化试剂包括混酸，所述混酸包括浓硫酸和浓硝酸的混合物。

[0060] 进一步的，所述混酸为浓硫酸和浓硝酸以一定的比例混匀得到。其中，所述浓硫酸与浓硝酸的质量比为2：1～4：1。

[0061] 本发明一典型实施例首先利用混酸(浓硝酸和浓硫酸)的强氧化性对三维石墨烯的表面进行氧化，程度很低的初步氧化，引入含氧官能团，为后续多巴胺的聚合提供选择性表面修饰的方便。

[0062] 在一些实施方案中，所述的酶促降解方法还包括：氧化处理结束后，将氧化后的三维石墨烯进行洗涤、浸泡至洗涤液为中性，之后进行真空干燥。

[0063] 优选的，所述真空干燥的温度为25～35℃，时间为24～48h。

[0064] 进一步地，所述亲水性修饰层的厚度小于100nm。

[0065] 进一步地，所述亲水性修饰层包含开放的孔洞结构。

[0066] 进一步地，所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁的99％以上的区域从所述亲水性修饰层中暴露出。

[0067] 进一步地，所述亲水性修饰层的材质包括亲水性修饰材料，所述亲水性修饰材料包括聚多巴胺、层粘连蛋白、多聚鸟氨酸、NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。

[0068] 在一些实施方案中，所述三维石墨烯的酶促降解方法包括：使亲水性修饰材料在具有所述活性官能团的三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上聚合，从而形成所述的亲水性修饰层，之后真空干燥。

[0069] 进一步的，三维石墨烯的二级修饰中引入极薄且极不完整的聚多巴胺膜，也可以通过其它粘附性较强的、能显著改善基底材料表面亲水性的纳米级薄膜替代，并通过控制聚合时间等使得所形成的薄膜不完整，且含多级孔，从而使得三维石墨烯的绝大部分表面还暴露在外且提高三维石墨烯的亲水性，并且让后续的表面修饰儿茶酚基团比简单混酸或氧等离子氧化处理的表面更容易进行偶联修饰儿茶酚基团，有利于后续的与儿茶酚基团的接枝偶联反应。

[0070] 在一些实施方案中，所述酶促降解方法包括：在碱性条件下，使多巴胺在所述三维石墨烯表面和所含孔洞的孔壁上进行氧化自聚合反应，从而在所述三维石墨烯的局部表面包覆形成聚多巴胺膜。

[0071] 优选的，所述方法具体包括：将所述三维石墨烯置于含有多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，进行所述的氧化自聚合反应。

[0072] 优选的，所述方法还包括：反应结束后，以去离子水洗涤或超声清洗所获三维石墨烯，并真空干燥。

[0073] 进一步的，所述真空干燥的温度为25～35℃，时间为24～48h。

[0074] 进一步的，所述氧化自聚合反应的温度为25～30℃，时间为30s～120min。

[0075] 进一步的，在所述氧化自聚合反应过程中，所述三维氧化石墨烯表面的至少部分含氧官能团被还原。

[0076] 进一步的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为5～20mmol/L，pH为7～9。

[0077] 进一步的，所述Tris-HCl缓冲溶液中多巴胺的浓度为1～3mg/mL。

[0078] 进一步的，所述多巴胺选自多巴胺盐酸盐。

[0079] 具体的，所述方法包括：将表面很清洁且氧化程度很低的三维泡沫石墨烯放含盐酸多巴胺(浓度为1～3mg/mL)的Tris-HCl(浓度为5～15mmol/L)碱性缓冲溶液(pH为7～9) 中(溶液体积大约为2～10mL)，放入恒温摇床中以一定低转速浸泡反应30s～120min，氧化自聚合反应的温度为25～30℃，从摇床取出后多次用去离子水清洗并用低功率超声清洗辅助而除去未反应的多巴胺或粘附不牢的聚多巴胺，最后真空干燥，温度为25～35℃，时间为 24-48h备用。

[0080] 在对三维石墨烯进行氧化处理的基础上，本发明一典型实施例利用多巴胺在碱性条件下的氧化自聚合在氧化后的三维石墨烯表面引入极薄且不完整的聚多巴胺膜层，在聚多巴胺形成过程中，三维石墨烯表面被氧化的部分也可部分被还原，通过调节材料的浸泡时间等使得引入的聚多巴胺膜层不至于完全阻碍后续的碳材料基底与HRP的接触反应(即三维石墨烯绝大部分表面还裸露在外)且能明显改善三维石墨烯支架材料的亲水性，不至于在固液相反应中三维石墨烯表面形成明镜状(由于三维石墨烯较强的疏水性和多孔性而强吸附大量的小气泡)。

[0081] 在一些实施方案中，所述酶促降解方法包括：在避光、保护性气体气氛中，使包含包覆亲水性修饰层的三维石墨烯、EDC、HOBt、含儿茶酚基团的化合物的均匀混合反应体系于0～ 25℃反应12～24h，从而利用所述亲水性修饰层在三维石墨烯表面偶联酶的还原底物。

[0082] 进一步地，所述酶的还原底物包括儿茶酚，但不限于此。所述的酶包括辣根过氧化物酶，但不限于此。

[0083] 优选的，所述的表面修饰方法还包括：反应结束后，将所获三维石墨烯进行洗涤，之后进行真空干燥。

[0084] 优选的，所述真空干燥的温度为25～35℃，时间为24～48h。

[0085] 本发明一典型实施例最后通过聚多巴胺等亲水性修饰材料偶联HRP的还原底物儿茶酚，从而达到对三维石墨烯进行三级表面修饰促进酶促降解的目的。

[0086] 在一些实施方案中，所述三维石墨烯通过化学气相沉积方法制备而成。

[0087] 优选的，所述三维石墨烯整体结构为长2cm，宽为1cm，高度约为1.68mm，具有多孔结构，孔隙率为99.3～99.7％，孔径为100～300μm(N Li,Scientific Reports,2013,3,1604)。

[0088] 优选的，所述三维石墨烯包括三维泡沫石墨烯，但不限于此。

[0089] 进一步的，所述三维石墨烯的层数约为30。

[0090] 本发明一典型实施例所采用的三维石墨烯是通过化学气相沉积方法制备的三维泡沫石墨烯(简称3D-GFs)(Z.P.Chen,Nature Materials,2011,10,424-428)，由于其具有多孔结构、合适的力学性能和较好的生物相容性等，使其在生物医学领域有着很多应用，特别是可以作为组织工程支架材料，为细胞提供三维微环境，促进再生医学的发展。

[0091] 综上所述，本发明通过三级表面修饰后，使得三维石墨烯在体外HRP降解过程中更易与 HRP的活性中心接触并反应，从而达到可控酶促降解。本发明中对三维石墨烯进行初步氧化是为了使得在较短时间内形成的聚多巴胺膜层极薄且不完整，从而使得三维石墨烯的绝大部分表面还暴露在外且提高三维石墨烯的亲水性。本发明中最后在表面修饰儿茶酚基团是为了使得溶液中HRP更易富集在三维石墨烯附近，并通过儿茶酚与HRP活性部位的电子传递使得三维石墨烯更易被氧化降解。

[0092] 本发明实施例的另一个方面提供了一种可酶促降解的三维石墨烯复合材料，其包括：

[0093] 三维石墨烯，

[0094] 厚度小于100nm的亲水性修饰层，其至少非连续的分布于所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁上；

[0095] 酶的还原底物，其与所述亲水性修饰层共价连接，所述的酶能够降解碳材料。

[0096] 在一些实施方案中，所述亲水性修饰层的厚度小于100nm。

[0097] 进一步地，所述亲水性修饰层包含开放的孔洞结构。

[0098] 在一些实施方案中，所述三维石墨烯的表面和所含孔洞的孔壁的99％以上的区域从所述亲水性修饰层中暴露出。

[0099] 进一步地，所述亲水性修饰层的材质包括亲水性修饰材料，所述亲水性修饰材料包括聚多巴胺、层粘连蛋白、多聚鸟氨酸、NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。

[0100] 进一步地，所述酶的还原底物包括儿茶酚，所述的酶包括辣根过氧化物酶，但不限于此。

[0101] 藉由本发明的技术方案，本发明提供的三维石墨烯的酶促降解方法能够加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率。本发明的酶促降解方法仅需对三维石墨烯进行三级表面修饰，制作工艺更加简单，成本更低，所需时间较短，生物相容性较高，通过三级表面修饰后，使得三维石墨烯在体外HRP降解过程中更易与HRP的活性中心接触并反应，从而达到对三维石墨烯可控酶促降解的目的，与简单混酸氧化的三维石墨烯的酶促降解相比，显著提高了降解速率，降低了完全降解所需的时间。

[0102] 以下通过若干实施例进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。

[0103] 实施例1

[0104] (1)三维泡沫石墨烯(简称3D-GFs)的制备

[0105] 首先，采用化学气相沉积法，以泡沫镍为模板，在高温条件(900-1000℃)下，以甲烷作为碳源制备了大面积、均一、缺陷少的三维泡沫石墨烯，然后经过氯化铁等腐蚀去除镍，再经酸洗和水洗后真空干燥，备用。

[0106] 图6a示出了三维泡沫石墨烯(以下简称3D-GFs)的光学图像，图6b示出了3D-GFs的 SEM图像，显示其尺寸，图6c示出了放置在水上的3D-GFs的光学图像，显示其质量轻和疏水性，图6d-图6f示出了3D-GFs的不同放大倍数的SEM图像，显示其多孔结构和微尺度表面形貌。

[0107] (2)三维泡沫石墨烯的一级修饰：混酸氧化

[0108] 首先，将上述较大面积的三维泡沫石墨烯裁剪为长为2厘米、宽为1厘米、高度约为 1.68mm的小块，方便后续的表面修饰和酶促降解。然后将其放入玻璃广口瓶中，加入2-5mL H2SO4与HNO3体积比为4:1的混酸后水浴(控温在30-50℃)，加热20-40分钟后使得三维泡沫石墨烯表面轻微氧化，水洗和浸泡至洗涤液为中性，真空干燥，温度为25～35℃，时间为 
24-48h，获得氧化的三维泡沫石墨烯(简称3D-GOFs)，备用。

[0109] (3)三维泡沫石墨烯的二级修饰：极薄且极不完整的聚多巴胺膜

[0110] 将表面很清洁且氧化程度很低的三维泡沫石墨烯放入含浓度为1-3mg/mL盐酸多巴胺的 Tris-HCl(浓度为5-15mmol/L)、pH为7-9的碱性缓冲溶液中，溶液体积大约为2-10mL，室温放入恒温摇床中以一定低转速浸泡反应30s-120min，氧化自聚合反应的温度为
25-30℃，从摇床取出后多次用去离子水清洗并用低功率超声清洗辅助而除去未反应的多巴胺或粘附不牢的聚多巴胺，最后真空干燥，温度为25～35℃，时间为24-48h，备用。氧化后三维泡沫石墨烯的含氧官能团将部分被多巴胺聚合时还原，最后在氧化的三维石墨烯表面引入极薄(纳米级别)且极不完整的聚多巴胺膜层，即氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)(简称 3D-GOFs-PDA)。

[0111] (4)氧化的三维泡沫石墨烯的三级修饰：偶联儿茶酚基团

[0112] 将包覆极薄且极不完整聚多巴胺膜的三维泡沫石墨烯放入一定pH水溶液中，在冰浴条件下，加入一定量EDC、HOBt、含儿茶酚基团的小分子化合物后，在避光、0-25℃、氮气保护下反应12-24小时，取出后多次用去离子水清洗，真空干燥，温度为25～35℃，时间为 24-48h，得到偶联HRP的还原底物儿茶酚的三维泡沫石墨烯，即氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)-儿茶酚(简称3D-GOFs-PDA-catechol)，备用。

[0113] (5)体外酶促降解氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)-儿茶酚(简称 3D-GOFs-PDA-catechol)。

[0114] 使用B.L.Allen等提出的体外酶促降解碳材料的方法。首先将小块的修饰后的三维泡沫石墨烯放入30mL透明血清瓶中，随后用锡箔纸包裹瓶子(避光)。然后加入2.25mL的PBS (pH 7.4)浸没三维泡沫石墨烯，轻轻摇动使得三维泡沫石墨烯整个表面区域都能良好地接触到PBS。将HRP以浓度为0.385mg/mL溶解于PBS中，然后向每个血清瓶中加入2mL，在 4℃条件下静态孵育24小时。随后，将5mL的H2O2(80μM)加入到每个反应体系中开启降解反应。每隔2周取样，用SEM、Raman等表征。

[0115] 上述制备三维泡沫石墨烯所使用的模版是商用泡沫镍，制备的三维泡沫石墨烯得层数由 TEM及Raman等测得大约为30层，最后放入血清瓶做降解实验的三维泡沫石墨烯大小为：长度为约2厘米、宽度约为1厘米、高度约为1.64毫米。

[0116] 步骤(2)中所用的混酸为浓硫酸和浓硝酸以一定的比例混匀得到。

[0117] 步骤(3)中所述的Tris-HCl缓冲溶液的浓度具体为10mmol/L，pH为8.5，加入反应体系为2mL的体积量。Tris-HCl缓冲溶液中多巴胺浓度为2mg/mL。所用多巴胺为盐酸盐，购买于国药。

[0118] 上述所有涉及用去离子水清洗材料的过程，需要反复用浸泡和清洗，必要时辅助超声清洗，不然会影响材料的表面整洁度。

[0119] 步骤(4)中所述得偶联儿茶酚基团后的三维泡沫石墨烯真空干燥后需氮气柜保存，防止儿茶酚基团被氧化而失去作用，影响后续降解。

[0120] 步骤(5)中所述的整个酶促降解反应都在4℃条件下、需避光、静态孵育。每隔2周取样250μL(放入-20℃冰箱冻存)，然后再加入等量的H2O2(80μM)。每隔2周，取出三维石墨烯后反复用去离子水浸泡和清洗，然后真空干燥后氮气柜保存待测。上述所用的HRP为冻干的HRP(VI型)粉末，购买于Sigma-Aldrich，产品编号为P8375，以浓度为0.385mg/mL 溶解于PBS(pH 7.4)中，即溶即用。为了保持反应体系中HRP一直具有较高催化活性，在长时间降解过程中，需定期更换反应液或少量补换含HRP的缓冲液。

[0121] 上述所有涉及真空干燥的温度为25-35℃。

[0122] 本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯的三级表面修饰流程示意图如图1所示，其中，图1中a)、b)、c)分别为三维泡沫石墨烯(3D-GFs)、氧化的三维泡沫石墨烯(3D-GOFs)、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)(3D-GOFs-PDA)的扫描电子显微镜图，图1中d) 为氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)-儿茶酚(3D-GOFs-PDA-catechol)的示意图。

[0123] 对本发明一典型实施例中三维泡沫石墨烯(3D-GFs)、氧化的三维泡沫石墨烯 (3D-GOFs)、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)(3D-GOFs-PDA)(1s)、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺(PDA)(3D-GOFs-PDA)(2s)分别进行水接触角测试，结果分别如图 2a-图2c所示。结果表明，3D-GOFs-PDA亲水性较好，5μL水滴接触3D-GOFs-PDA后在3 秒时间内就完全消失在三维泡沫石墨烯的孔隙中。

[0124] 图3示出了本发明一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯、氧化的三维泡沫石墨烯-聚多巴胺-儿茶酚的酶促降解示意图。其中，图3中a)图为3D-GFs纵面的扫描电子显微镜图，显示高度大约为1.64mm。a)中插图为HRP的三级结构示意图，其活性部位居中。图3中b) 为3D-GOFs和3D-GOFs-PDA-catechol的降解后期的示意图，可以看出， 3D-GOFs-PDA-catechol比3D-GOFs被破坏程度更大。图3中c)图为降解过程从支架整体材料上掉落的小支架片段的扫描电子显微镜图，可以明显看出小支架片段表面发生表面剥离现象而变得粗糙。

[0125] 图4a-图4c分别示出了3D-GOFs酶促降解过程第4周酶促降解后的不同放大倍数的扫描电子显微镜图。图4d-图4f分别示出了3D-GOFs-PDA-catechol酶促降解过程第4周酶促降解后的不同放大倍数的扫描电子显微镜图。图5a、图5b分别示出了3D-GOFs和 3D-GOFs-PDA-catechol第1-4周酶促降解后的Raman图谱。

[0126] 图7示出了三维泡沫石墨烯与氧化的三维泡沫石墨烯的拉曼表征对比示意图，从拉曼图谱可以看出轻微氧化引入了些许含氧官能团，出现了D峰，从SEM中可以看出三维石墨烯经轻微氧化后表面没有明显改变，没有显著增加破坏程度。图9示出了3D-GFs、3D-GOFs、 3D-GOFs-PDA和PDA的热重分析曲线图。

[0127] 实施例2

[0128] 本实施例与实施例1不同之处在于：

[0129] (2)三维泡沫石墨烯的一级修饰：混酸氧化

[0130] 首先，将上述较大面积的三维泡沫石墨烯裁剪为长为2厘米、宽为1厘米、高度约为1.68mm的小块，方便后续的表面修饰和酶促降解。将裁剪后的三维泡沫石墨烯放入玻璃广口瓶中，加入3mL H2SO4与HNO3体积比为3:1的混酸后水浴(控温40℃)，加热30分钟，水洗和浸泡至洗涤液为中性，真空干燥，温度为30℃，时间为24h，获得氧化的三维泡沫石墨烯(简称3D-GOFs)。

[0131] (3)三维泡沫石墨烯的二级修饰：极薄且极不完整的聚多巴胺膜

[0132] 将氧化的三维泡沫石墨烯放入含浓度为2mg/mL盐酸多巴胺的Tris-HCl(浓度为10mmol/L)、pH为8.5的碱性缓冲溶液中，溶液体积大约为3mL，室温放入恒温摇床中以一定低转速浸泡反应30s、10min、30min和120min，氧化自聚合反应的温度为25℃，从摇床取出后多次用去离子水清洗并用低功率超声清洗辅助而除去未反应的多巴胺或粘附不牢的聚多巴胺，最后真空干燥，温度为30℃，时间为24h，备用。

[0133] 在本发明的一典型实施例中氧化的三维泡沫石墨烯氧化自聚合反应时间10min、30min 和120min的扫描电镜图分别如图10a-图10c所示。

[0134] 实施例3

[0135] 本实施例与实施例1基本相同，区别之处在于：

[0136] 使用用氧等离子体处理三维泡沫石墨烯，处理时间分别为30s和90s。首先将三维泡沫石墨烯放入仪器中，用陶瓷片将材料的四个角固定，防止吸入泵中。等离子体清洗器的型号是 PDC-MG，当压力小于90pa，观察电压表为743V和电流表225mA，最大功率为167.17W，整机输入功率为400W，当玻璃清洗舱内有辉光出现时即产生氧等离子体。经仪器处理后的三维石墨烯表面即含有含氧官能团，由拉曼等表征。图8示出了三维泡沫石墨烯经不同氧等离子体处理后的拉曼表征对比示意图。

[0137] 综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的三维石墨烯的酶促降解方法能够加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率。本发明的酶促降解方法仅需对三维石墨烯进行三级表面修饰，制作工艺更加简单，成本更低，所需时间较短，生物相容性较高，通过三级表面修饰后，使得三维石墨烯在体外HRP降解过程中更易与HRP的活性中心接触并反应，从而达到对三维石墨烯可控酶促降解的目的，与简单混酸氧化的三维石墨烯的酶促降解相比，显著提高了降解速率，降低了完全降解所需的时间。

[0138] 此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，例如，分别在温度为30℃、50℃，时间为20、40分钟下选用氧化试剂进行氧化处理，分别在温度为30℃、50℃，时间为5分钟下选用氧等离子体进行氧化处理，分别在温度为28℃、30℃下进行氧化自聚合反应等等，并同样能够实现加快三维石墨烯在辣根过氧化物酶作用下的生物降解速率。

[0139] 应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。