抗H7N9全人源单克隆抗体7O2及其制法与应用

摘要

本发明是关于抗H7N9全人源单克隆抗体7O2及其制法与应用。该抗体7O2的重轻链具有6个CDR区。本发明抗体7O2可靶向结合H7N9病毒的血凝素HA，可应用于流感病人病毒检测用。

权利要求

1.抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，其中，该抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，其中：所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：GFTFSSYW(SEQ ID NO:5)，所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：INSDGSST(SEQ ID NO:6)，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：ARRSKTGKFDP(SEQ ID NO:7)，所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：ALPKQY(SEQ ID NO:8)，所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：KDS，所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：QSADSSGTLEV(SEQ ID NO:9)。

2.根据权利要求1所述的抗体，该抗体的重链如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，该抗体的轻链如SEQ ID NO:4所示。

4.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1～3任一项所述的抗体的重链可变区和轻链可变区，或者编码权利要求1～3任一项所述的抗体的重链和轻链。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下序列至少之一：SEQ ID NOs:1和3。

6.根据权利要求4所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下序列至少之一：SEQ ID NOs:10‑14，和编码氨基酸序列KDS的多核苷酸序列：AAAGACAGT。

7.含权利要求4‑6任一项所述多核苷酸的载体。

8.含有权利要求4‑6任一项所述多核苷酸或含有权利要求7所述载体的细胞。

9.一种检测H7N9病毒水平的试剂盒，其含有权利要求1所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其含有权利要求2～3任一项所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2。

11.权利要求9或10所述的检测H7N9病毒水平的试剂盒，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。

12.权利要求9或10所述的检测H7N9病毒水平的试剂盒，所述第二抗体为抗权利要求1～3任一项所述单克隆抗体7O2的抗抗体。

说明书

抗H7N9全人源单克隆抗体7O2及其制法与应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种抗H7N9全人源单克隆抗体及其制备方法与应用，具体地说，是关于抗H7N9全人源单克隆抗体7O2及其制法与应用，属于免疫学技术领域。

背景技术

[0002] 在2015年全球十大畅销药中，有六个是全人源或人源化单克隆抗体药物。排名第一的是艾伯维公司治疗关节炎的抗TNFa单克隆抗体Humira，这是一个全人源单克隆抗体，
已经是连续3年销售额100亿以上的药王。从1986年第一个单克隆抗体药物上市开始，单抗
药物经历了鼠源单抗药物(Orthoclone OKT3)、嵌合单抗药物(Rituximab)、人源化单抗药
物(Herceptin)和全人源单抗药物(Humira)等阶段。由于人体出现抗鼠抗体反应(HAMA)，鼠
源单抗药物、嵌合单抗药物已经逐渐被淘汰，目前占据市场的单克隆抗体药物全都是人源
化单克隆抗体药物。与国际先进的人源抗体生产技术相比，深圳乃至全中国都有很大差距，
主要表现在人源抗体药物领域的创新能力薄弱，自主研发的品种少，目前还没有原创人源
化单克隆抗体药物上市的报道，庞大的抗体药物市场被国外药企占领。我国要改变落后局
面，争夺消费潜力巨大的国内外抗体药物市场，亟需攻克人源化单克隆抗体技术。

[0003] 人源抗体指的是抗体基因序列完全来源于人抗体基因序列。人源抗体特异性高，副作用少，防治疾病效果好，是今后单抗药物的主要发展方向。目前常见的制备人源单克隆
抗体技术主要有噬菌体展示技术和单个B细胞PCR技术。噬菌体展示技术制备人源单克隆抗
体具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点。但是其缺点也比较明显，从
非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容量
不足以涵盖动物的抗体多样性等。而近年来新兴的单个B细胞PCR技术指的是从病人的血液
中分离分泌功能抗体的B细胞，然后提取RNA和合成cDNA，从中克隆分泌目的抗体的基因，最
后重组和表达全人源单克隆抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和
特异性，而近来改进的从记忆B细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的单克隆抗
体技术，更是大大减少了繁琐操作和成本。单个B细胞制备人源化单克隆抗体技术是研发人
源单克隆抗体的发展趋势。

[0004] 人源单克隆抗体在治疗炎症、癌症特别是流行性感冒方面具有高特异性的显著疗效。流行性感冒是由流感病毒引起的传染性疾病，严重威胁人类健康。全球每年约有10亿人
受季节性流感病毒感染，其中有25‑50万人死亡。H7N9病毒是一种流感病毒，对传统的抗病
毒药amantadine和rimantadine有耐药性，目前尚没有有效治疗手段。H7N9病毒在入侵细胞
时需要依赖病毒自身表达的特定分子与人细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩
增。中和病毒的人源抗体是人B淋巴细胞产生的某些特异抗体，能够与病毒表面的抗原结
合，从而阻止该病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵入细胞，能够高效防治H7N9流行性感冒。

[0005] 因此，提供抗H7N9全人源单克隆抗体及其制法具有重大意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于提供抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

[0007] 本发明的另一目的在于提供编码所述抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的基因及含该基因的载体或细胞。

[0008] 本发明的另一目在于提供产生所述抗H7N9全人源单克隆抗体7O2的方法。

[0009] 本发明的另一目在于提供包所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的药物组合物。

[0010] 本发明的另一目的在于提供本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段或所述的药物组合物的应用。

[0011] 本发明的另一目的在于提供一种检测H7N9病毒的试剂盒。

[0012] 为实现上述目的，本发明提供了一种抗H7N9全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。本发明中命名所述抗体为7O2。

[0013] 根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，其中：

[0014] 所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：GFTFSSYW(SEQ ID NO:5)，

[0015] 所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：INSDGSST(SEQ ID NO:6)，

[0016] 所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：ARRSKTGKFDP(SEQ ID NO:7)，

[0017] 所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：ALPKQY(SEQ ID NO:8)，

[0018] 所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：KDS，

[0019] 所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：QSADSSGTLEV(SEQ ID NO:9)。

[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体的重链如SEQ ID NO:2所示。

[0021] 根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体的轻链如SEQ ID NO:4所示。

[0022] 本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者编码所述的抗体的重链和/或轻链。优选地，所述多核苷酸包含以
下序列至少之一：

[0023] SEQ ID NOs:1、3和10～14。

[0024] 根据本发明的具体实施方案，SEQ ID NO:1为编码SEQ ID NO:2的一种多核苷酸；SEQ ID NO:3为编码SEQ ID NO:4的一种多核苷酸；SEQ ID NO:10为编码SEQ ID NO:5的一
种多核苷酸；SEQ ID NO:11为编码SEQ ID NO:6的一种多核苷酸；SEQ ID NO:12为编码SEQ 
ID NO:7的一种多核苷酸；SEQ ID NO:13为编码SEQ ID NO:8的一种多核苷酸；SEQ ID NO:
14为编码SEQ ID NO:9的一种多核苷酸。编码轻链可变区的CDR2的氨基酸序列KDS的多核苷
酸序列可为：AAAGACAGT。

[0025] 本发明还提供了包含本发明所述多核苷酸的载体。

[0026] 本发明还提供了含有本发明所述多核苷酸或含有本发明所述载体的细胞。

[0027] 本发明还提供了一种产生本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段的方法，该方法是采用单个B细胞法制备
所述抗H7N9全人源单克隆抗体7O2。

[0028] 现有技术中存在采用噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，尽管该方法具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点，但是其缺点也比较
明显，从非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的
库容量不足以涵盖动物的抗体多样性等。本发明采用单个B细胞PCR技术，从病人的血液中
分离分泌功能抗体的B细胞，然后提取RNA和合成cDNA，从中克隆分泌目的抗体的基因，最后
重组和表达全人源单克隆抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特
异性，此外，可进一步采用改进的从记忆B细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的
本发明所述单克隆抗体技术，更是大大减少了繁琐操作和成本。

[0029] 本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段。

[0030] 本发明还提供了所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段，或所述的药物组合物在制备用于治疗由H7N9病毒引起
的疾病的药物中的应用。

[0031] 本发明还提供了一种检测H7N9病毒水平的试剂盒，其含有本发明所述的抗H7N9全人源单克隆抗体7O2或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合H7N9的生物活性片段；优选
所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所
述第二抗体为抗本发明所述单克隆抗体7O2的抗抗体。

[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0033] (1)本发明所述抗H7N9全人源单克隆抗体7O2可以靶向结合H7N9病毒的血凝素HA，可应用于流感病人病毒检测用。

[0034] (2)相比鼠源抗体，本发明全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜
力成为治疗流感病毒的大分子药物。

[0035] (3)相较于现有技术提供的噬菌体展示技术制备抗H7N9病毒人源单克隆抗体的方法，本发明采用的单个B细胞开发抗H7N9的抗体具有操作简单快捷，生产的人源抗体具有高
亲和力和特异性等优点。

附图说明

[0036] 图1为实施例1NTH‑3T3表达CD40L的流式检测结果图。

[0037] 图2为实施例1流式细胞仪分选记忆B细胞结果图。

[0038] 图3为实施例1ELISA实验结果图。

[0039] 图4为实施例2Western blot琼脂糖凝胶电泳结果图。

[0040] 图5为7O2重链可变区与轻链可变区的序列示意图。

具体实施方式

[0041] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不
用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验
方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

[0042] 实施例1

[0043] (1)构建稳定表达CD40L的NTH‑3T3细胞系

[0044] 利用慢病毒建立3T3‑CD40L饲养细胞。构建慢病毒表达载体pLVX‑CD40L，转染293T细胞，转染第四天收集病毒上清液。活化NIH‑3T3细胞，培养3代后用慢病毒感染，继续培养
并传代3次。利用流式细胞仪进行分选FITC荧光强度在MFI附近的细胞，重新加入至培养瓶
中，37℃，5％CO2培养箱中培养和检测，检测结果如图1所示，其是将表达CD40L的3T3细胞和
空载体pLVX(带有ZxGreen)转染的3T3细胞分别用带有APC的抗CD40L染色，然后上流式细胞
仪分析。结果发现，所有3T3‑CD40L饲养细胞都表达CD40L。当细胞长到80％～90％时，消化
7
收集细胞，浓度为每毫升1×10 细胞。置于辐射仪中进行5000rads辐射，冻存液重悬细胞，
7
浓度为每毫升3.5×10细胞，分装1ml在冷冻小管，液氮冻存(可以保存2年)。

[0045] (2)记忆B细胞的分选和活化

[0046] 用淋巴分离液分离和冻存曾经感染H7N9病毒的康复病人的PBMC，每管10～50×6
10细胞，冻存在液氮罐中。配制PBMC流式染色液，其成分如下表1所示：

[0047] 表1：PBMC流式染色液

[0048]

[0049]

[0050] 解冻PBMC，加入上述PBMC流式染色液并在流式细胞仪上分选，结果如图2所示，分+ – – –
选出CD19IgMIgAIgD的记忆B细胞，细胞纯度需在90％以上，若低于90％，重复分选过程。

[0051] 配制激活B细胞的混合培养基，其组分如下表2所示：

[0052] 表2

[0053] 组分 体积完全IMDM培养基 336mL
‑1
IL‑2(10,000U mL ) 3.5mL
‑1
IL‑21(100μg mL ) 175μL
3T3‑CD40L 10mL

[0054] 将记忆B细胞加入到混合培养基中，混匀后有限稀释在384孔板，每孔1个细胞，体积为50ul，置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。13天后，取上清液进行ELISA。

[0055] (3)获得抗H7N9病毒的人源单克隆抗体7O2

[0056] 流感病毒血凝素HA是病毒包膜表面柱状抗原，能与人、鸡、豚鼠等多种红细胞受体结合引起红细胞凝集，具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。本发明中，通过
ELISA发现了能够分泌结合H7N9病毒的抗体7O2的B细胞，其分泌的人源单克隆抗体7O2可以
靶向结合H7N9病毒的血凝素HA(图3)。

[0057] ELISA实验具体操作：

[0058] (1)将100ng/100μl的H7N9病毒的HA蛋白包被在96孔酶标板中，每孔100μl；

[0059] (2)放置4度冰箱过夜；

[0060] (3)用PBST溶液洗涤三遍，每孔加5％的脱脂奶粉溶液200μl，37度孵育1小时；

[0061] (4)用PBST溶液洗涤三遍，加100ul没有感染病毒的正常人血清(阴性对照)或加感染病毒的病人血清或抗H7N9全人源单克隆抗体，各三个重复；

[0062] (5)37度孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

[0063] (6)以1:5000稀释带HRP的抗人IgG抗体，加入酶标版中，每孔100μl；

[0064] (7)37度孵育1小时后用PBST溶液洗涤三遍；

[0065] (8)每孔加100μl TMB底物溶液，37度5分钟；

[0066] (9)每孔加终止溶液2M硫酸100μl，立刻在酶标仪中450nm波长检测吸光值。如图3所示，ELISA实验表明本发明获得的人源单克隆抗体7O2可以靶向结合H7N9病毒的血凝素
HA。

[0067] 实施例2人源化单克隆抗体7O2基因的克隆、重组和表达

[0068] 将实施例1获得的能够分泌结合H7N9病毒的抗体7O2的B细胞进行裂解，取裂解液进行RNA的反转录，获得人源抗体基因的PCR模板cDNA。以cDNA为模板克隆抗体的重链和轻
链的基因，并且重组在真核细胞293F或HEK293中进行表达和纯化。

[0069] 具体地：

[0070] (1)将B细胞液转移至96孔板(Eppendorf，030133366)。

[0071] (2)反转录体系：150ng随机引物(invitrogen,48190‑011),0.5ul 10mM dNTP(Invitrogen,18427‑088),1μl 0.1M DTT(Invitrogen,18080‑044),0.5％v/v Igepal CA‑
630(Sigma,I3021‑50ML),4U RNAsin(Promega),6U Prime RNAse In hibitor(Eppendorf)
and 50U III reverse transcriptase(Invitrogen,18080‑044)，补DEPC水
至14μl/well。

[0072] (3)反转录反应程序：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。

[0073] (4)cDNA保存在‑20℃。

[0074] (5)用KOD‑Plus‑Neo(TOYOBO，KOD401)试剂盒PCR分别扩增抗体基因的重链和轻链，40μL体系：3.5μL cDNA，20nM混合引物，4μL缓冲液(buffer)，4μL 2mM dNTPs，2.4μL 
MgSO4，1μL KOD。

[0075] (6)反应程序：94℃，2min；45个循环：[98℃,10s；58℃(IgH/Igκ)或60℃(Igλ),st nd
30s；68℃,28s(1  PCR)或23s(2  PCR)]。

[0076] (7)对扩增产物进行琼脂糖凝胶，其结果如图4所示，结果显示，抗体轻链可变区为κ，大小为354bp，重链可变区大小是327bp。

[0077] (8)抗体基因PCR产物测序结果如下：

[0078] 7O2的重链可变区基因(SEQ ID NO:1)：

[0079] GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGCA

[0080] CTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTGGGTCTCACGTATTAATAG

[0081] TGATGGGAGTAGCACAAGCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTC

[0082] CAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCG

[0083] AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGGAGTAAAACGGGGAAGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

[0084] 7O2的轻链可变区基因(SEQ ID NO:3)：

[0085] TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAATATGCTTATTGGTAC

[0086] CAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTGATATATAAAGACAGTGAGAG

[0087] GCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCA

[0088] CGTTGACCATCAGTGGAGTCCAGGCAGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTCAAT

[0089] CAGCAGACAGCAGTGGTACCCTAGAGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACC GTCCTAGTA

[0090] (9)将H基因和pcDNA3.1分别进行BamH1/EcoR1双酶切后相连，形成pcDNA3.1‑H载体。

[0091] (10)将L基因和pcDNA3.1分别进行Not1/Xho1双酶切后相连，形成pcDNA3.1‑L载体。

[0092] (11)培养293F细胞。

[0093] (12)20ug pcDNA3.1‑L载体和10ug pcDNA3.1‑H载体共转染293F细胞，培养96小时。

[0094] (13)取上清液进行ELISA(ABC是上清液，DEF是阳性对照，GH是阴性对照)和western blot；ELISA实验结果如下表3所示：

[0095] 表3

[0096] 数据 450 数据 450A 3.0025 E 1.2087
B 3.1215 F 1.1470
C 2.9562 G 0.0321
D 1.1463 H 0.1001

[0097] 上述结果显示上清液中含有能够结合H7N9病毒的抗体7O2。

[0098] Western blot实验具体的过程为：

[0099] 用上清液跑蛋白变性电泳，转膜后用5％的脱脂奶粉溶液封闭1小时，然后用带HRP的山羊抗人IgG抗体孵育1小时，最后加显示底物进行曝光。实验结果如图4所示，图4显示全
人源抗体的重链和轻链，表明上清液中含有抗H7N9病毒全人源单克隆抗体7O2。

[0100] 对于本实施例的单克隆抗体7O2而言，SEQ ID NO：2和SEQID NO：4分别是本实施例获得的7O2的重链可变区和轻链可变区的VH和VL氨基酸序列。参见图5，所述重链可变区和
轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR)，分别编号为CDR1、CDR2、CDR3，其中：重链：CDR1：
GFTFSSYW(SEQ ID NO:5)；CDR2：INSDGSST(SEQ ID NO:6)；CDR3：ARRSKTGKFDP(SEQ ID NO:
7)。轻链：CDR1：ALPKQY(SEQ ID NO:8)；CDR2：KDS；CDR3：QSADSSGTLEV(SEQ ID NO:9)。

[0101] 最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应
当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何
修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。