一种利用水溶性高分子通过汉奇反应检测细胞内甲醛含量的方法

摘要

本发明提供一种检测细胞内甲醛含量的方法。以带有β‑二酮结构的水溶性聚合物为原料，通过汉奇反应来检测细胞内甲醛的含量。该方法原料安全，检测实时，灵敏度高，选择性好，有望应用于医疗检测领域。

权利要求

1.一种用于检测细胞内甲醛的检测液，为：带有β-二酮结构的水溶性聚合物和铵盐的溶液；

所述带有β-二酮结构的水溶性聚合物，为式I所示的聚合物：式I中，x、y和n均表示聚合度，x＝20-50，y＝20-50，n＝10-30。

2.根据权利要求1所述的用于检测细胞内甲醛的检测液，其特征在于：所述铵盐选自：氯化铵，硫酸铵，乙酸铵；

所述带有β-二酮结构的水溶性聚合物与铵盐的摩尔比为1:1-1:10。

3.权利要求1中式I所示的聚合物。

4.一种制备权利要求1中式I所示的聚合物的方法，包括：将式II所示的聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯与式III所示的乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯共聚：式II中，n表示聚合度，n＝10-30。

5.权利要求1或2所述的用于检测细胞内甲醛的检测液在细胞内甲醛含量检测中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述细胞内甲醛含量的检测通过汉奇反应实现。

7.一种检测细胞内甲醛含量的方法，包括下述步骤：

1)配制权利要求1或2所述的用于检测细胞内甲醛的检测液；

2)将用于检测细胞内甲醛的检测液与细胞接触，待细胞吞食后，移去检测液，加入已知浓度的甲醛溶液，检测细胞上的荧光强度，重复上述操作检测加入一系列已知浓度的甲醛溶液后细胞上的荧光强度，得到细胞上的荧光强度与甲醛浓度的关系；

3)将用于检测细胞内甲醛的检测液与甲醛含量待测的细胞接触，待细胞吞食后，移去检测液，检测细胞上的荧光强度，参照步骤2)中得出的荧光强度与甲醛浓度的关系，得到细胞内甲醛的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述一系列已知浓度的甲醛溶液的浓度为0-100μmol/L范围内的浓度值。

说明书

一种利用水溶性高分子通过汉奇反应检测细胞内甲醛含量的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于材料领域，具体涉及一种利用水溶性高分子通过汉奇反应检测细胞内甲醛含量的方法。

背景技术

[0002] 甲醛是结构最为简单的醛类，是一种对人体及环境带来毒性和污染的物质。而人体内通过一些脱甲基酶和氧化酶的作用也会产生一些内源性甲醛，一般人体细胞内的甲醛含量为100-400μmol/L。已有众多报道称体内的甲醛含量过高会导致一些疾病，如阿尔兹海默症，以及还有一些癌症类等。所以必要且急需研究出一种对细胞内的甲醛含量检测的方法。传统细胞内检测甲醛的方法主要通过设计一些荧光探针，存在结构复杂，灵敏度不高，检测限低，实时性不强的缺点。而传统的方法也包括以乙酰丙酮与铵盐为原料，通过汉奇反应来检测细胞内甲醛含量。但乙酰丙酮毒性较大，且荧光信号弱，不易保存，在使用推广方面存在一定的缺陷。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种检测细胞内甲醛含量的方法。以带有β-二酮结构的水溶性聚合物为原料，通过汉奇反应来检测细胞内甲醛的含量。该方法原料安全，检测实时，灵敏度高，选择性好，有望应用于医疗检测领域。

[0004] 本发明所提供的检测细胞内甲醛含量的方法，包括下述步骤：

[0005] 1)配制用于检测细胞内甲醛的检测液；

[0006] 2)将上述用于检测细胞内甲醛的检测液与细胞接触，待细胞吞食后，移去检测液，加入已知浓度的甲醛溶液，检测细胞上的荧光强度，重复上述操作检测加入一系列已知浓度的甲醛溶液后细胞上的荧光强度，得到细胞上的荧光强度与甲醛浓度的关系；

[0007] 3)将上述用于检测细胞内甲醛的检测液与甲醛含量待测的细胞接触，待细胞吞食后，移去检测液，检测细胞上的荧光强度，参照步骤2)中得出的荧光强度与甲醛浓度的关系，得到细胞内甲醛的含量。

[0008] 上述方法步骤1)中，所述用于检测细胞内甲醛的检测液，为：带有β-二酮结构的水溶性聚合物和铵盐的溶液。

[0009] 其中，所用溶剂可为本领域人员知晓的，任何能够适合细胞检测的缓冲液，如PBS缓冲液。

[0010] 其中，所述带有β-二酮结构的水溶性聚合物，具体可为式I所示的聚合物：

[0011]

[0012] 式I中，x、y和n均表示聚合度，x＝20-50，y＝20-50，n＝10-30。

[0013] 所述铵盐可选自：氯化铵，硫酸铵，乙酸铵等，具体可为乙酸铵。

[0014] 所述带有β-二酮结构的水溶性聚合物(按照二酮的物质的量计算)与铵盐的摩尔比可为1:1-1:10。

[0015] 上述式I所示的带有β-二酮结构的水溶性聚合物，由式II所示的聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯和式III所示的乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯共聚制备得到：

[0016]

[0017] 式II中，n表示聚合度，n＝10-30。

[0018] 上述方法步骤2)中，所述一系列已知浓度的甲醛溶液的浓度为0-100μmol/L范围内的浓度值。

[0019] 上述方法中所使用的用于检测细胞内甲醛的检测液也属于本发明的保护范围。

[0020] 本发明旨在提供一种通过汉奇反应来检测细胞内甲醛的方法思路，使用的带有β-二酮结构的水溶性聚合物包括聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯和乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯的共聚物，但不限于此。

[0021] 本发明进一步改进了传统检测甲醛的汉奇反应，传统方法使用乙酰丙酮作为β-二酮的来源，相比而言，乙酰丙酮的安全性较低，而且产物荧光强度弱，所以采用具有二酮结构的聚合物来提升安全性，并增强荧光强度。

[0022] 本发明提供一种可调控聚合物结构的方法来检测细胞内甲醛。其一是共聚物的原料之一的聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯的分子量可调控，其二是两种原料的比例可调控，从而达到调控高分子的水溶性、检测限等性能。

[0023] 本发明提供一种细胞内聚合物后修饰的方法思路，聚合物后修饰是对聚合物改性的一种常见的方法，将反应体系改为细胞，为以后可能的高分子类生物正交反应提供方法思路。

[0024] 本发明提供的水溶性非常好的带有β-二酮结构的聚合物，易于用于生物体系中。

[0025] 本发明提供一种由聚合物制得甲醛检测液的方法，由于聚合物结构稳定，便于长期储存和运输，为可能的商品化奠定基础。

[0026] 本发明是通过汉奇反应得到的荧光强度来检测细胞内甲醛含量。

[0027] 本发明通过合成水溶性带有二酮结构的聚合物，与铵盐组成甲醛检测液，根据汉奇反应生成的产物的荧光强度来检测细胞内甲醛含量的方法。聚合物和铵盐可以溶解于PBS缓冲液中，能以溶液的形式保存，便于长期储存和运输。

附图说明

[0028] 图1为聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯和乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯共聚反应的方程式。

[0029] 图2为共聚物为基础检测液的检测甲醛原理的化学反应式。

[0030] 图3为共聚物和乙酰丙酮分别为基础检测液的检测甲醛的荧光光谱对比。(其中a图为乙酰丙酮测试结果，b图为共聚物测试结果)

[0031] 图4为共聚物和乙酰丙酮分别为基础检测液的检测甲醛的荧光强度随时间对比。(其中a图为乙酰丙酮测试结果，b图为共聚物测试结果)

[0032] 图5为共聚物和乙酰丙酮分别为基础检测液的检测甲醛的检测限测定。(其中a图为乙酰丙酮测试结果，b图为共聚物测试结果)

[0033] 图6为共聚物和乙酰丙酮分别为基础检测液的检测甲醛的专一性测定。(其中a图为乙酰丙酮测试结果，b图为共聚物测试结果)

[0034] 图7为共聚物和乙酰丙酮分别为基础检测液的检测甲醛的激光共聚焦显微镜照片。(其中a/a’/a”图为乙酰丙酮测试结果；b/b’/b”图为共聚物测试结果；c/c’/c”图为空白对照图，无任何检测液。a/b/c图的激发器为408nm；a’/b’/c’图的激发器为488nm；a”/b”/c”图分别为前二者的融合图)。

[0035] 图8为共聚物和乙酰丙酮的细胞安全性比较。(其中a图为乙酰丙酮测试结果，b图为共聚物测试结果)

具体实施方式

[0036] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 实施例1、

[0039] 一、水溶性二酮结构聚合物的制备

[0040] 按照图1的制备路线，混合一定比例的聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(分子量为950)和乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯，其物质的量的比例为1:1。

[0041] 将混合后的聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯和乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯加入聚合管中，加入引发剂偶氮二异庚腈，加入溶剂二甲基甲酰胺，用橡胶塞密封。

[0042] 通入氮气30分钟，排出聚合管内部的空气。70℃油浴搅拌加热8小时。

[0043] 将聚合原液加入乙醚中沉淀，离心(10000转/分钟，10分钟)得到沉淀固体。

[0044] 将得到的聚合物固体用液氮冷却，并冷却抽干，得到水溶性二酮结构聚合物。

[0045] 二、配制甲醛检测液

[0046] 取上述制得的一定质量的聚合物和一定质量的铵盐溶解于PBS缓冲液中溶解，得到甲醛检测液，保存于室温。其中聚合物(按照二酮的物质的量计算)和铵盐的物质的量的比例为1:2.5，铵盐采用乙酸铵。

[0047] 三、甲醛检测

[0048] 取上述制得的甲醛检测液加入L929细胞培养皿。待细胞吞食后30分钟，移去检测液，采用PBS缓冲液洗涤3次后，加入微量浓度(100μmol/L)的甲醛溶液模拟检测。细胞荧光观察：将上述的细胞培养皿移去所有液体，采用激光共聚焦显微镜观察细胞上的荧光情况。如图7b/b’/b”。

[0049] 实施例2、荧光光谱测试实验

[0050] 1)按照实施例1的制备方法，得到聚合物后，以一定浓度和铵盐配成甲醛检测液。将一定质量的乙酰丙酮和铵盐配成传统甲醛检测液。乙酰丙酮和铵盐的物质的量的比例为
1:2.5，铵盐选用乙酸铵。

[0051] 2)加入微量的甲醛溶液(浓度为100μmol/L)，以360纳米为激发波长，通过荧光光谱测试来检测二者的灵敏度及时效性。如图3,4。

[0052] 由图3,4可知：相比较而言，聚合物为基础的检测液的检测灵敏度比以传统的乙酰丙酮更高，且具有更强的荧光强度。

[0053] 实施例3、检测限测试实验

[0054] 取例1中制得的水溶性高分子和乙酸铵配成甲醛检测液(高分子浓度为20mg/mL；乙酸铵的浓度为2mg/mL)，与传统的乙酰丙酮和乙酸铵检测液对比(高分子浓度为1mg/mL；
乙酸铵的浓度为2mg/mL)，分别与不同浓度的甲醛溶液反应，检测多孔酶标仪测定的荧光光度值，根据荧光光度值和甲醛浓度的线性关系来测定检测限。结果如图5。由图5a，b可知：比较而言，以高分子为基础的检测液对甲醛的检测效果能够达到类似传统的乙酰丙酮甲醛检测的效果。

[0055] 实施例4、专一性测试实验

[0056] 取例1中制得的水溶性高分子和乙酸铵配成甲醛检测液，与传统的乙酰丙酮和乙酸铵检测液对比，分别与不同物质溶液(浓度相同)反应，检测多孔酶标仪测定的荧光光度值，根据荧光光度值来测定检测甲醛的专一性。结果如图6。

[0057] 由图6a，b可知：以高分子为基础的甲醛检测液能够达到传统乙酰丙酮检测液对甲醛的专一检测性，甚至效果更佳。

[0058] 实施例5、细胞安全性测试实验

[0059] 通过L929细胞测试例1中水溶性高分子及乙酰丙酮的细胞存活率。采用CCK-8的标定方法，通过利用酶标仪测试吸光度值来测定。

[0060] 以正常培养基培养的细胞标定为100％，正常培养基无细胞标定为0％，计算比较高分子和小分子乙酰丙酮的细胞安全性，结果如图8。

[0061] 由图8a，b可知：相比较而言，发明的检测物质高分子聚合物的安全性较比传统的乙酰丙酮要好很多。在高浓度条件下也几乎无毒，所以具有非常好的生物相容性。