一种生产蛋白饲料的方法及饲料产品

摘要

本发明公开了一种生产蛋白饲料的方法及饲料产品，以羽毛粉和豆粕混合物为主要原料，通过优化配料，附以粗酶液进行固态发酵，最后精细加工成蛋白饲料，得到的蛋白饲料产品中蛋白质含量大于等于60％，本发明充分利用了禽类养殖业一种产量巨大的副产品，很大程度上减少了环境污染，同时通过微生物发酵技术生产出的高蛋白含量的饲料质量好，易吸收，发酵周期短，工艺操作简单。

权利要求

1.一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、液体菌种的制备：

(1)先配制YPD液体培养基，杀菌后制备斜面培养基；

(2)选取巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115(pichia pastoris MMpk-GS115)；

(3)将上述菌株接种于所述斜面培养基中，培养2d后转到YPD液体培养基中培养24h，再经二次扩大培养后制备成种子液；

S2、角蛋白酶粗酶液的制备：

(1)菌体生长阶段：配制改进的BSM培养基后加入发酵罐中，向发酵罐中加入种子液，种子液的添加量为5-8％，开始发酵，调整转速和通气率，当BSM培养基中的甘油消耗完且DO急剧上升至100％时，进入补甘油阶段，向发酵液中添加含有1.2％PTM1微量元素溶液的甘油水溶液，根据DO值提高搅拌转速和罐压，保持DO值稳定在1％—5％；菌体生长后期，提高转速，当DO值陡然下降后又急剧回升时，进入诱导产酶阶段；

(2)诱导产酶阶段：使菌体饥饿0.5～1h，然后开始进入100％甲醇诱导阶段，随着发酵的进行逐渐提高甲醇添加量，直到甲醇的添加速率达到5mL/L发酵液/小时；

(3)上罐发酵结束后，离心取上清即为发酵得到的粗酶液，用于后续固态发酵；

S3、蛋白饲料制备：

(1)将羽毛粉与豆粕按照1:1～4混合后加水蒸制熟化，得到发酵底物；

(2)将发酵底物外加碳源后灭菌；

(3)将粗酶液与灭菌后的发酵底物按比例混合进行固态发酵；

(4)发酵完成后将混合物料进行烘干、粉碎即得产品。

2.根据权利要求1所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S1步骤(1)中所述YPD液体培养基的配方如下：酵母浸粉1wt％、蛋白胨2wt％以及葡萄糖2wt％,余量为水；杀菌条件为115℃灭菌20min；所述斜面培养基为将所述YPD液体培养基中添加1.5wt％琼脂粉制备得到。

3.根据权利要求2所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S1步骤(3)的具体过程为：将上述菌株接种于斜面培养基中，28℃培养箱培养2d后转到YPD液体培养基中30℃、

250转/min培养24h，再转接一次，转接接种量为2％，30℃、250转/min搅拌条件下培养24h，制备成种子液。

4.根据权利要求1所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S2步骤(1)中所述改进的BSM培养基配方如下：磷酸2.27wt％、CaSO4 0.093wt％、K2SO41.82％、MgSO4·7H2O 

1.49wt％、KOH 0.413wt％、甘油4wt％以及余量水。

5.根据权利要求4所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S2步骤(1)所述甘油水溶液中含有甘油的含量为50wt％。

6.根据权利要求5所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S2步骤(1)中当DO值陡然下降指的是下降到0，所述急剧回升指的是很快上升到100％。

7.根据权利要求1所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S2步骤(2)中逐渐提高甲醇添加量的具体过程为：开始时甲醇添加量为1mL/L发酵液/h，维持搅拌速度和通气率稳定；当DO值逐渐上升并维持在最高点时，增加甲醇添加量，每隔3h甲醇的添加速率提高

1mL/L发酵液/h，直到甲醇的添加速率达到5mL/L发酵液/h。

8.根据权利要求1所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S3步骤(2)中外加碳源为葡萄糖，添加量为发酵底物总重的3％。

9.根据权利要求1所述的一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，S3步骤(3)中发酵条件为：粗酶液接种量占发酵底物干重的10％～20％，接种后于30℃进行固体发酵，发酵过程中，每隔12h翻料一次；固体发酵时间为48h。

10.由权利要求1-9任一项的方法生产的蛋白饲料，其特征在于：蛋白质含量高于60％。

说明书

一种生产蛋白饲料的方法及饲料产品

技术领域

[0001] 本发明属于饲料生产技术领域，具体涉及一种生产蛋白饲料的方法及饲料产品。

背景技术

[0002] 在养殖业和畜牧业迅速发展的当今，动物蛋白源的不足已经逐渐成为全球性的问题，尤以我国为甚。目前用于动物日粮的蛋白饲料主要有2种：一种是常见鱼粉、肉骨粉、蚕蛹等动物或者昆虫蛋白，这类蛋白营养丰富，氨基酸营养均衡，更有利于动物消化吸收，其生物学效价高于其他植物蛋白如豆粕、菜籽粕和花生粕等，但是其缺点是价格昂贵，主要依赖进口，国内资源短缺，此外，疯牛病等疾病的潜在威胁，导致反刍类动物蛋白(骨粉、肉粉、血粉)被许多地方禁止添加和使用。另外一种则是产量大、制备工艺简单且粗蛋白含量高的大分子蛋白饲料，诸如：羽毛粉、蹄角粉等。然而目前市场上的羽毛粉产品多是通过物理的方法处理加工而成的，饲喂效果差，很难被动物吸收利用。一直以来中国的蛋白资源都比较匮乏，随着饲牧行业的迅速发展，国内饲用蛋白资源短缺的问题也变的日益严峻，造成这个问题的原因，一方面是资源本身存在着限制；另一方面，蛋白质饲料加工手段的不成熟，还不能充分合理的对其进行加工。禽类的羽毛是皮肤的衍生物。尽管水解羽毛粉的蛋白质含量很高，通常在80％以上，但其中85％～90％为角蛋白质，属于硬蛋白质类，结构中肽与肽之间由双硫键(-S-S-)和硫氢键相连，具有很大的稳定性，其在水、稀酸及盐类溶液中均不溶解，不经加工处理很难被动物利用。因此，必须采用特殊方法处理，使二硫键遭到破坏，才能提高羽毛蛋白质的利用价值。通常水解羽毛粉蛋白可破坏双硫键，使不溶性角蛋白变为可溶性蛋白，有利于动物消化利用。如果制作方法适宜，其蛋白质的消化率也可达到75％以上。近几年，中国每年产生的羽毛副产品总量逐年递增，于是通过微生物对其进行发酵产高质量蛋白饲料就具有重大实际意义。

发明内容

[0003] 本发明的目的之一在于提供一种生产蛋白饲料的方法，通过优化原料配比，改进发酵条件，大幅度提高了制备得到的饲料产品的质量；本发明的目的之二在于提供一种蛋白饲料产品，其蛋白质含量高达60％以上。

[0004] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0005] 技术方案一：

[0006] 一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] S1、液体菌种的制备：

[0008] (1)先配制YPD液体培养基，杀菌后制备斜面培养基；

[0009] (2)选取巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115(pichia pastoris MMpk-GS115)；

[0010] (3)将上述菌株接种于所述斜面培养基中，培养2d后转到YPD液体培养基中培养24h，再经二次扩大培养后制备成种子液。

[0011] S2、角蛋白酶粗酶液的制备：

[0012] (1)菌体生长阶段：配制改进的BSM培养基后加入发酵罐中，向发酵罐中加入种子液，种子液的添加量为5-8％，即添加的种子液的量为加入发酵罐的改进的BSM培养基的总量的5-8％，然后开始发酵，调整转速和通气率，优选的，搅拌器转速设定为400r/min，通气率保持在0.75vvm，直到DO值升至100，进入补甘油阶段，向发酵液中添加含有1.2％PTM1微量元素溶液的甘油水溶液，根据DO值提高搅拌转速和罐压，保持DO值稳定；菌体生长后期，提高转速，优选的，将转速提高到600r/min，当DO值陡然下降后又急剧回升时，进入诱导产酶阶段；

[0013] (2)诱导产酶阶段：使菌体饥饿0.5～1h，然后开始进入100％甲醇诱导阶段，随着发酵的进行逐渐提高甲醇添加量，直到甲醇的添加速率达到5mL/L发酵液/小时；

[0014] (3)上罐发酵结束后，离心取上清即为发酵得到的粗酶液，用于后续固态发酵；

[0015] S3、蛋白饲料制备：

[0016] (1)将羽毛粉与豆粕等比例混合后加水蒸制熟化，优选的，加水量与固体物料的质量比为1:0.6，然后得到发酵底物；

[0017] (2)将发酵底物外加碳源后灭菌；

[0018] (3)将粗酶液与灭菌后的发酵底物按比例混合进行固态发酵；

[0019] (4)发酵完成后将混合物料进行烘干、粉碎即得产品。

[0020] 作为本发明的进一步改进，S1步骤(1)中所述YPD液体培养基配方：酵母浸粉1wt％、蛋白胨2wt％以及葡萄糖2wt％,余量为水；杀菌条件为115℃灭菌20min；所述斜面培养基为将所述YPD液体培养基中添加1.5wt％琼脂粉制备得到。

[0021] 作为本发明的进一步改进，S1步骤(3)的具体过程为：将上述菌株接种于斜面培养基中，28℃培养箱培养2d后转到YPD液体培养基中30℃、250转/min培养24h，再转接一次，转接接种量为2％，30℃、250转/min搅拌条件下培养24h，制备成种子液。

[0022] 作为本发明的进一步改进，S2步骤(1)中所述改进的BSM培养基配方如下：磷酸2.27wt％、CaSO4 0.093wt％、K2SO4 1.82％、MgSO4·7H2O 1.49wt％、KOH 0.413wt％、甘油
4wt％以及余量水。

[0023] 作为本发明的进一步改进，S2步骤(1)所述甘油水溶液中含有甘油的含量为50wt％。

[0024] 作为本发明的进一步改进，S2步骤(1)中当DO值陡然下降指的是下降到0，所述急剧回升指的是急剧回升至100％。在发酵至18h左右，DO值陡然下降为0，两个小时之后又突然回升至100％。

[0025] 作为本发明的进一步改进，S2步骤(2)中逐渐提高甲醇添加量的具体过程为：开始时甲醇添加量为1mL/L发酵液/h，维持搅拌速度和通气率稳定，优选的，搅拌速度维持在700r/min，通气率维持在3.0vvm；当DO值逐渐上升并维持在最高点时，增加甲醇添加量，每隔3h甲醇的添加速率提高1mL/L发酵液/h，直到甲醇的添加速率达到5mL/L发酵液/小时。

[0026] 作为本发明的进一步改进，S3步骤(2)中外加碳源为葡萄糖，添加量为发酵底物总重的3％。

[0027] 作为本发明的进一步改进，S3步骤(3)中发酵条件为：粗酶液接种量占发酵底物干重的10％～20％，接种后于30℃进行固体发酵，发酵过程中，每隔12h翻料一次；固体发酵时间为48h。

[0028] 技术方案二：

[0029] 一种蛋白饲料，蛋白质含量高于60％。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

[0031] 本发明以禽类养殖业主要的副产物羽毛粉为主要原料，利用农副产品豆粕与羽毛粉之间的氨基酸互补性，通过创造性的调整参数，改进工艺步骤，利用产高活性角蛋白酶的毕赤酵母进行固态发酵，最终得到优质蛋白含量大于等于60％的饲料。

[0032] 本发明制备的高质量蛋白饲料，经过动物实验验证，其对猪、虾、甲鱼等的适口性较好。本产品相对于普通蛋白饲料水解氨基酸的含量高，且天冬氨酸含量高达6.33％。天冬氨酸是合成生物体内四种必须氨基酸(苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸)的重要前体物质，赖氨酸含量达2.0～4.6％,蛋氨酸含量达0.6～1.8％。与目前的蛋白饲料相比，有效成分高。且各项理化指标接近于进口鱼粉等动物源蛋白饲料，甚至优于前者。可替代进口鱼粉等动物源蛋白饲料，极大程度上降低了成本，同时有效解决了禽类养殖的副产品对环境的污染以及其营养转换率低的问题。

附图说明

[0033] 附图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

[0034] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。

[0035] 另外，为了更好地说明本发明的内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。本发明中，表示原料含量的单位均基于重量份计，除非另外说明。另外，关于本发明的技术指标的测定方法均为本领域内使用标准方法，具体可参见最新的国家标准，除非另外说明。

[0036] 本发明所用到的巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115(pichia pastoris GS115)，购买自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其分类命名为巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115(pichiapastoris MMpk-GS115)，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO:M 2014171，保藏日期为：2014年4月28日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学；所述巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115形态及生理生化特征包括：呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或圆形，为甲醇营养型菌。

[0037] 实施例1：

[0038] 一种蛋白的制备方法，包括如下步骤：

[0039] S1、液体菌种的准备

[0040] (1)斜面菌株培养，以如下重量百分比配置YPD培养基：酵母浸粉1％、蛋白胨2％，葡萄糖2％，115℃灭菌20min，另加1.5％的琼脂粉制作成斜面培养基；

[0041] (2)选用巴斯德毕赤酵母作为发酵产酶的菌种；

[0042] (3)将上述菌株接种于斜面，28℃培养箱培养2d后转到YPD液体培养基中30℃、250转/min培养24h，再转接一次(转接接种量为2％)，30℃、250r/min培养24h，制备成液体种子液。

[0043] S2、角蛋白酶粗酶液的制备：

[0044] (1)菌体生长阶段：按以下重量百分比配置BSM培养基：磷酸2.27％，CaSO4 0.093％，K2SO4 1.82％，MgSO4·7H2O 1.49％，KOH 0.413％，甘油4％；向装有BSM培养基的发酵罐中加入种子液5％。在发酵起始阶段，搅拌器转速设为400r/min，通气率保持在
0.75vvm，直到溶氧升至100。然后进入补甘油阶段，向发酵液中添加含有1.2％PTM1微量元素溶液和50％甘油的甘油水溶液，以增加细胞生物量。需要不断根据DO值提高转速和增加罐压，保持一定的DO值；菌体生长后期，将转速提高到600r/min。在第发酵18小时20分时，DO值陡然下降，两个小时五分后又突然上升至100，此时准备进入诱导产酶阶段；

[0045] (2)诱导产酶阶段：在甲醇诱导前，让菌体饥饿1h，然后开始进入100％甲醇诱导阶段，开始时甲醇添加量为1ml/L发酵液/h，此时搅拌速度维持在700r/min，通气率维持在3.0vvm。当DO值逐渐上升并维持在较高水平时，增加甲醇添加量，每隔3小时甲醇的添加速率都提高1mL/L发酵液/小时，直到甲醇的添加速率达到5mL/L发酵液/小时。在整个发酵过程中，罐内温度保持在30℃，发酵液pH保持在5.0；

[0046] (3)发酵结束后，离心取上清即为发酵得到的粗酶液，用于后续固态发酵；S3、蛋白饲料制备；

[0047] (1)发酵底物为羽毛粉和豆粕组成的混合物，原料以质量比羽毛粉：豆粕＝1:1的比例配制发酵底物；

[0048] (2)将上述发酵底物混合后加水进行熟化，加水量与固体物料的质量比为1:0.6；

[0049] (3)外加碳源：灭菌后的物料中加入发酵底物总质量3％的葡萄糖，混匀后灭菌；

[0050] (4)将粗酶液接种至已灭菌的物料中，粗酶液接种量占固体原料干重的15％；接种后于30℃进行固体发酵。发酵过程中，每隔12h翻料一次；

[0051] (5)固体发酵时间为48h；发酵完成后进行烘干、粉碎、计量并打包，即得成品饲料。

[0052] 实施例2：

[0053] 本实施例与实施例1的区别在于：S3步骤(1)发酵底物为羽毛粉和豆粕组成的混合物，原料以质量比羽毛粉：豆粕＝1:2的比例配制发酵底物；其余步骤均同实施例1，得到蛋白饲料。

[0054] 实施例3：

[0055] 本实施例与实施例1的区别在于：S3步骤(1)发酵底物为羽毛粉和豆粕组成的混合物，原料以质量比羽毛粉：豆粕＝1:3的比例配制发酵底物；其余步骤均同实施例1，得到蛋白饲料。

[0056] 实施例4：

[0057] 本实施例与实施例1的区别在于：S3步骤(1)中发酵底物为羽毛粉和豆粕组成的混合物，原料以质量比羽毛粉：豆粕＝1:4的比例配制发酵底物；其余步骤均同实施例1，得到蛋白饲料。

[0058] 实施例5：

[0059] 本实施例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(4)中将粗酶液接种至已灭菌的物料中，粗酶液接种量占固体原料干重的10％；其余步骤均同实施例1，得到蛋白饲料。

[0060] 实施例6：

[0061] 本实施例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(4)中将粗酶液接种至已灭菌的物料中，粗酶液接种量占固体原料干重的18％；其余步骤均同实施例1，得到蛋白饲料。

[0062] 实施例7：

[0063] 本实施例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(4)中将粗酶液接种至已灭菌的物料中，粗酶液接种量占固体原料干重的20％；其余步骤均同实施例1，得到该蛋白饲料。

[0064] 对比例1：

[0065] 本对比例与实施例1的区别仅在于：将得到的饲料产品进行挤压膨化，膨化率8％。

[0066] 对比例2：

[0067] 本对比例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(1)发酵底物经过挤压膨化，膨化率为8％；其余参数与步骤均同实施例1，得到该蛋白饲料。

[0068] 对比例3：

[0069] 本对比例与实施例1的区别仅在于：S3步骤中发酵底物未经熟化；其余步骤均同实施例1，得到该蛋白饲料。

[0070] 对比例4：

[0071] 本对比例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(1)发酵底物为单一组分的羽毛粉；其余参数与步骤均同实施例1，得到该蛋白饲料。

[0072] 对比例5：

[0073] 本对比例与实施例1的区别仅在于：S3步骤(1)发酵底物为单一组分的豆粕；其余参数与步骤均同实施例1，得到该蛋白饲料。

[0074] 对比例6：

[0075] 一种蛋白的制备方法，包括如下步骤：

[0076] (1)发酵底物为羽毛粉和豆粕组成的混合物，原料以质量比羽毛粉：豆粕＝1:1的比例配制发酵底物；

[0077] (2)将上述发酵底物混合后加水进行熟化，加水量与固体物料的质量比为1:0.6；

[0078] (3)外加碳源：灭菌后的物料中加入发酵底物总质量3％的葡萄糖，混匀后灭菌；

[0079] (4)将采购自深圳恒生生物科技有限公司的角蛋白酶制剂，以料水比1：10配制成酶液，将酶液接种至已灭菌的物料中，粗酶液接种量占固体原料干重的15％；接种后于30℃进行固体发酵。发酵过程中，每隔12h翻料一次；

[0080] (5)固体发酵时间为48h；发酵完成后进行烘干、粉碎、计量并打包，即得成品饲料。

[0081] 对实施例1-7以及对比例1-6所制备的饲料产品进行总蛋白含量测定，结果见表1。

[0082] 检测方法如下：凯氏定氮法测定固态发酵产物蛋白和肽含量

[0083] (1)、预处理：准确称取一定量的样品，烘干测含水率，用小型粉碎机将烘干后的样品粉碎至细粉末状。

[0084] (2)、准确称取预处理后的样品0.5g于消化管中，每根消化管中加入3.3g混合催化剂和10mL浓硫酸，盖上小漏斗，在消化炉上加热，先调240℃加热1h，再调420℃加热2h，至液体成浅绿色或澄清透明。关闭消化炉，自然冷却0.5h后取下消化管，自然冷却至常温。

[0085]

[0086] 其中：Vx---样品消耗HCl标准液的体积(mL)；V0---空白消耗HCl标准液的体积(mL)；

[0087] c---HCl标准液的摩尔浓度(mol/L)；

[0088] 0.014---氮的摩尔质量(g/mmol)；

[0089] 6.25---氮换算为蛋白质的换算系数；m---固体样品的干物质重(g)。

[0090] 表1

[0091]

[0092] 通过实施例1与对比例1的数据对比可知，经过挤压膨化的饲料虽然总蛋白含量提高不明显，但是可溶性蛋白含量和酸溶性蛋白含量提高较为明显，猜测可能是挤压膨化过程中，某些非可溶性蛋白的某些基团发生了转化。

[0093] 通过实施例1与对比例2的数据对比可知，酶解底物经过挤压膨化后其转化为可溶性蛋白和酸溶性蛋白的量得到了提高，可能的原因是挤压膨化后的酶解底物具有蓬松的多孔结构，被微生物吸收之后水解酶进入多孔结构中，由于底物原料比表面积的增大，提高了与酶的接触面积，延长了在微生物内部的停留时间，从而提高了转化率；另外，酶解底物经过挤压膨化之后形成的疏松多孔的结构中含有很多的活性催化位点，这些活性位点一方面可以提高微生物的活性，另一方面还可以提高酶的催化活性，从而进一步提高了酶解底物的转化率。

[0094] 所述可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G－250法进行测定，氨态氮含量的测定法为甲醛法，遵照GB/T3600-2000进行；具体过程为公知常识，在此不再赘述。

[0095] 所述酸溶性蛋白测定方法如下：

[0096] 操作步骤：

[0097] (1)准确称取待测样品6g于100mL烧杯中，准确加入15％三氯乙酸溶液50mL，混合均匀，静置5min；

[0098] (2)以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管；

[0099] (3)4000r/min离心10min，准确移取其上清液10mL于消化管中，凯氏定氮法测定蛋白含量。

[0100] (4)凯氏定氮法测定粗蛋白含量。

[0101] 计算公式：

[0102]

[0103] 其中：V1---馏出液消耗盐酸标准液的体积(mL)；

[0104] V0---空白试验消耗HCl标准液的体积(mL)；

[0105] c---HCl标准液的摩尔浓度(mol/L)；

[0106] 0.014---氮的摩尔质量(g/mmol)；

[0107] 6.25---氮换算为蛋白质的换算系数；

[0108] m---固体样品的干物质重(g)；

[0109] cp-待测样品的粗蛋白质含量(％)

[0110] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。