一种空心纳米机器人及其制备方法与作为抗氧化剂的应用

摘要

一种空心纳米机器人，主要由空心结构的介孔二氧化硅球(HMSNs)和在所述空心结构的介孔二氧化硅球表面负载的氯化血红素(hemin)组成的纳米酶(hemin‑HMSNs)。本发明所述的空心纳米机器人具有类过氧化物酶(POD)、类(SOD)的性能，以H2O2、超氧自由基(O2·‑)、羟基自由基(·OH)为燃料，通过hemin催化H2O2、超氧自由基(O2·‑)、羟基自由基(·OH)释放的化学自由能为动力以引起其自身的运动，运动面积更大，将ROS转化成无毒害的H2O，可大幅提高细胞内ROS清除效率。

权利要求

1.一种空心纳米机器人，其特征在于，主要由空心结构的介孔二氧化硅球（HMSNs）和在所述空心结构的介孔二氧化硅球表面负载的氯化血红素（hemin）组成的纳米酶（hemin-HMSNs）。

2.根据权利要求1所述的空心纳米机器人，其特征在于，所述的空心纳米机器人中，HMSNs的粒径为150 ‒ 650 nm。

3.根据权利要求1或2所述的空心纳米机器人，其特征在于，所述的空心纳米机器人中，HMSNs的壁厚为5 ‒ 200 nm。

4.权利要求1-3任一项所述空心纳米机器人的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）SiO2球的合成

将十六烷基三甲基溴化铵和氨水加入到醇类溶剂和水构成的混合溶液中，加热，向混合物中加入正硅酸乙酯搅拌、离心和洗涤制备得到SiO2球；

2）空心结构的介孔SiO2球的合成

将步骤1）制备的SiO2球进行超声，在水浴中陈化处理，将沉淀离心分离后用水洗涤，再次将沉淀通过超声处理分散在醇类溶剂中，加入盐酸溶液搅拌除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)；

3）hemin的负载

将步骤2）制备的HMSNs加入到hemin溶液中搅拌获得hemin-HMSNs纳米酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述氨水的浓度为5 45 ~wt％。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，十六烷基三甲基溴化铵的质量与氨水的体积比为（0.1 ‒ 1.0 g）:（1 ‒ 4 mL）。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸乙酯的体积比为（0.1 ‒ 1.0 g）:（1 ‒ 5 mL）。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，陈化处理的时间为1 ‒48小时。

9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述空心纳米机器人的制备方法包括：

1）SiO2球的合成

将0.3 ‒ 0.5 g十六烷基三甲基溴化铵和1 ‒ 4 mL 25 wt％的浓氨水加入到含有20 ‒ 

100 mL无水乙醇和100 ‒ 150mL去离子水的混合溶液中，然后将混合物加热至35 ‒ 50oC ，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯1‒ 5 mL，在35 ‒ 40 oC下搅拌12‒ 48小时后，以2000 ‒ 5000 rpm离心8 ‒ 15分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次；

2）空心结构的介孔SiO2球的合成

将制成的SiO2球通过超声处理分散在200 ‒ 250 mL去离子水中，在35‒90o C 水浴中陈化处理12 ‒48小时，将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次，再次将沉淀通过超声处理分散在150 ‒ 200 mL的无水乙醇中，加入400 ‒ 500 μL 37%的盐酸溶液，并在40‒ 80 oC下搅拌1‒5 小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)；

3）hemin的负载

按照hemin与HMSNs的质量比为1:60 ‒ 1:100，在剧烈搅拌下将HMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌3 ‒ 6小时获得hemin-HMSNs纳米酶。

10.权利要求1-3任一项所述的空心纳米机器人作为抗氧化剂的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述抗氧化剂用于清除ROS，所述ROS选自H2O2、超氧自由基（O2•−）、羟基自由基（•OH）。

说明书

一种空心纳米机器人及其制备方法与作为抗氧化剂的应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米抗氧剂制备技术领域，具体涉及一种空心纳米机器人及其制备方法与作为抗氧化剂的应用。

背景技术

[0002] 在生命体系中，过表达的活性氧物种(ROS)，如超氧阴离子(O2·-)、双氧水(H2O2)、羟基自由基(·OH)等，会对机体组织造成氧化损伤。这些损伤严重时还会引发一系列的疾病，如炎症、糖尿病、心血管疾病、癌症等。随着纳米技术的不断发展，已经发现很多纳米材料包括金属化合物、贵金属以及碳基纳米材料可以清除细胞内过表达的活性氧自由基，用于细胞的保护。为了达到好的ROS的清除效率，提高纳米材料(纳米酶)使用数量是有效的方法，但会加剧纳米材料生物安全性问题。因此，在生物医学中除了要使用生物相容性好的纳米试剂外，还应尽可能使用低剂量的纳米试剂。如何兼顾清除效率和生物安全性，是纳米酶应用于生物体抗氧化所面临的关键问题之一。

[0003] 近几年，微纳米马达的研制引起了研究者的关注。通过功能化修饰微纳米马达并使其与不同大小的目标物(从分子到细胞水平)作用，可实现微纳米马达对药物、细菌、细胞等多种物质的装载、运输与释放。但是，以清除ROS为目标，构建的微纳米马达或是纳米机器人鲜有报道。

发明内容

[0004] 基于上述存在的问题，本发明旨在提供一种空心纳米机器人及其制备方法与作为抗氧化剂的应用，通过构建类酶功能的空心结构纳米材料，使其在燃料存在下发生自运动，从而在保持使用量不增加的情况下，可大幅提高细胞内ROS清除效率，实现抗氧化。

[0005] 本发明的实施例提供一种空心纳米机器人，其主要由空心结构的介孔二氧化硅球(HMSNs)和在所述空心结构的介孔二氧化硅球表面负载的氯化血红素(hemin)组成的纳米酶(hemin-HMSNs)。

[0006] 根据本发明的实施方案，所述的空心纳米机器人(hemin-HMSNs)中，HMSNs的粒径为150-650nm，优选为170-630nm，还优选为200-600nm。

[0007] 根据本发明的实施方案，所述的空心纳米机器人(hemin-HMSNs)中，HMSNs的壁厚为5-200nm，优选为6-170nm，还优选为6-70nm。

[0008] 本发明的实施例还提供如上所述空心纳米机器人的制备方法，包括如下步骤：

[0009] 1)SiO2球的合成

[0010] 将十六烷基三甲基溴化铵和氨水加入到醇类溶剂和水构成的混合溶液中，加热，向混合物中加入正硅酸乙酯搅拌、离心和洗涤制备得到SiO2球；

[0011] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0012] 将步骤1)制备的SiO2球进行超声，在水浴中陈化处理，将沉淀离心分离后用水洗涤，再次将沉淀通过超声处理分散在醇类溶剂中，加入盐酸溶液搅拌除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)；

[0013] 3)hemin的负载

[0014] 将步骤2)制备的HMSNs加入到hemin溶液中搅拌获得hemin-HMSNs纳米酶。

[0015] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，所述氨水的浓度为5～45wt％，优选为15～35wt％，还优选为25wt％。

[0016] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，十六烷基三甲基溴化铵的质量与氨水的体积比为(0.1-1.0g):(1-4mL)，优选为(0.3-0.5g):(1-4mL)。

[0017] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

[0018] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，醇类溶剂与水的体积比为(20-100):(100-150mL)。

[0019] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，加热的温度为30-75℃，优选为35-50℃。

[0020] 根据本发明的实施方案，步骤1)中，十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸乙酯的体积比为(0.1-1.0g):(1-5mL)，优选为(0.3-0.5g):(1-4mL)。

[0021] 根据本发明的实施方案，步骤2)中，陈化处理的时间为1-48小时，优选为12-48小时。

[0022] 根据本发明的实施方案，步骤2)中，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

[0023] 根据本发明的实施方案，步骤3)中，hemin与HMSNs的质量比为1:30-1:150，优选为1:60-1:100。

[0024] 作为实例，所述空心纳米机器人的制备方法包括：

[0025] 1)SiO2球的合成

[0026] 将0.3-0.5g十六烷基三甲基溴化铵和1-4mL 25wt％的浓氨水加入到含有20-100mL无水乙醇和100-150mL去离子水的混合溶液中，然后将混合物加热至35-50℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(1-5mL)，在35-40℃下搅拌12-48小时后，以2000-5000rpm离心8-15分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次；

[0027] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0028] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在200-250mL去离子水中，在35-90℃水浴中陈化处理12-48小时，将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次，再次将沉淀通过超声处理分散在150-200mL的无水乙醇中，加入400-500μL 37％的盐酸溶液，并在40-80℃下搅拌1-5小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)；

[0029] 3)hemin的负载

[0030] 按照hemin与HMSNs的质量比为1:60-1:100，在剧烈搅拌下将HMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌3-6小时获得hemin-HMSNs纳米酶。

[0031] 本发明还提供如上所述空心纳米机器人作为抗氧化剂的用途。

[0032] 根据本发明的实施方案，所述抗氧化剂用于清除ROS，所述ROS选自H2O2、超氧自由·-基(O2 )、羟基自由基(·OH)。

[0033] 本发明的有益效果

[0034] 1)本发明所述的空心纳米机器人具有类过氧化物酶(POD)、类(SOD)的性能，以H2O2、超氧自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)为燃料，通过hemin催化H2O2、超氧自由基(O2·-)、羟基自由基(·OH)释放的化学自由能为动力以引起其自身的运动，运动面积更大，将ROS转化成无毒害的H2O，可大幅提高细胞内ROS清除效率。

[0035] 2)本发明实施例制备的空心纳米机器人具有好的生物相容性，能够有效的进入细胞，实现细胞内ROS清除，保护细胞免受氧化损伤。

[0036] 3)本发明实施例制备的hemin-HMSNs空心纳米机器人，由于其空心结构具有运动面积大，扩散速率快的优点，且hemin-HMSNs还表现出良好的细胞外的ROS清除能力。因此可以应用于细胞，其以内源性产生的过多ROS为燃料推动其自主运动，实现细胞内过多ROS的清除。本文所述的通过调节纳米酶为空心纳米机器人实现其自主运动，并高效清除ROS的方法将为设计具有高催化活性的纳米酶打开一扇门，可用作未来氧化应激治疗相关临床病症的基础。

附图说明

[0037] 图1显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人的透射电镜图；

[0038] 图2显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人在H2O2溶液中的运动轨迹图；

[0039] 图3显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人类POD的性能；

[0040] 图4显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人对(a)O2·-和(b)·OH的清除效率；

[0041] 图5显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人的细胞毒性分析；

[0042] 图6显示了本发明实施例2中hemin-HMSNs-1纳米机器人的透射电镜图；

[0043] 图7显示了本发明对比例1中hemin-SMSNs纳米机器人的透射电镜图；

[0044] 图8显示了本发明对比例1中hemin-SMSNs纳米机器人在H2O2溶液中的运动轨迹图；

[0045] 图9显示了本发明实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人在细胞中清除ROS的示意图。

具体实施方式

[0046] 下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

[0047] 除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

[0048] 实施例1

[0049] 1)SiO2球的合成

[0050] 将0.3g十六烷基三甲基溴化铵和2mL 25wt％的浓氨水加入到含有60mL无水乙醇和100mL去离子水的混合溶液中。然后，将混合物加热至35℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(2mL)。在35℃下搅拌48小时后，以5000rpm离心10分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次。

[0051] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0052] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在200mL去离子水中，在90℃水浴中陈化处理48小时。将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次。再次将沉淀通过超声处理分散在160mL的无水乙醇中，加入480μL 37％的盐酸溶液，并在60℃下搅拌3小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)。

[0053] 3)hemin的负载

[0054] 按照hemin与HMSNs的质量比为1:80，在剧烈搅拌下将HMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌4小时获得hemin-HMSNs纳米酶。

[0055] 如图1所示是实施例1所制备的hemin-HMSNs的TEM图，单个纳米粒子的粒径为630nm，壁厚为70nm。

[0056] 图2给出了实施例1所制备的hemin-HMSNs在30mM H2O2溶液中的运动轨迹。与下述对比例1中所给实心的介孔二氧化硅球负载的氯化血红素(hemin-SMSNs)的运动面积相比，hemin-HMSNs纳米机器人的运动面积为hemin-SMSNs的3.5倍。

[0057] 实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人在细胞外的抗氧化活性测试实验

[0058] 类POD性能测定：混合含0.25mM hemin的hemin-HMSNs，30％H2O2，10mg mL-1 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，pH 3.0缓冲溶液(体积比为1：3：1：20)，在652nm下测量反应混合物吸光度随反应时间的变化。

[0059] 如图3所示，实施例1制备的hemin-HMSNs纳米机器人表现出类POD的性能，随着反应时间的增加，转换H2O2的量增加，使得吸光度逐渐增加。在没有hemin-HMSNs纳米机器人的混合溶液中，吸光度不随时间的增加而增加。

[0060] 清除O2·-测试：将Tris-HCl缓冲液(200μL，50mM)(pH 8.2)和40μL hemin-HMSNs混合，立即加入10μL的5mM连苯三酚，在325nm每30秒对测定样品和对照样品的吸光度进行测定。超氧自由基清除效率使用以下等式计算：

[0061] 超氧自由基清除效率(％)＝(ΔA325nm，对照/Δt-ΔA325nm，样品/Δt)/(ΔA325nm，对照/Δt)×100。

[0062] 清除·OH测试：将1,10-邻菲罗啉溶液(10μL，5mM)和hemin-HMSNs(10μL，含0.25mM hemin)混合，然后将FeSO4·7H2O溶液(10μL，7.5mM)移液到混合物中。加入35μLH2O2(0.1％v/v)引发反应。在37℃下在水浴中孵育60分钟后，在536nm下测量反应混合物的吸光度。使用不含任何抗氧化剂的反应混合物作为对照，使用不含H2O2的混合物作为空白。羟自由基清除效率通过下式计算：

[0063] 羟自由基清除效率(％)＝(A536nm，样品-A536nm，对照)/(A536nm，空白-A536nm，对照)×100。

[0064] 如图4所示，实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人表现出清除O2·-和·OH的能力。在hemin的浓度为10μM时，其清除效率分别为45.8％和75.6％，并且其清除效率随着浓度的增大而增大。

[0065] 利用常规的细胞毒性检测方法(CCK8法)检测实施例1制备的hemin-HMSNs纳米机器人的细胞毒性。最终的实验结果如图5所示：hemin的浓度为1到20μM时，均无明显的细胞毒性，说明hemin-HMSNs纳米机器人具有优异的生物相容性。

[0066] 实施例1中hemin-HMSNs纳米机器人在细胞内的抗氧化活性测试实验

[0067] 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在24孔板中并培养24小时。之后，除去细胞培养基，将贴壁细胞与实施例1制备的hemin-HMSNs(hemin终浓度为10μM)在37℃下孵育4小时。为了除去过量的纳米颗粒，用pH 7.4磷酸盐缓洗涤细胞三次。将细胞在37℃下与60μM的阳性试剂一起孵育1小时。然后，将细胞进一步与2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37℃下孵育1小时。用PBS洗涤三次后，使用酶标仪以激发波长为488nm，发射波长为525nm，测定细胞内ROS水平。

[0068] 通过定量分析表明，实施例1的hemin-HMSNs纳米机器人可有效去除近54％的ROS。与下述对比例1中所给hemin-SMSNs清除的35％ROS相比，空心纳米机器人具有更优异的清除效率。

[0069] 实施例2

[0070] 1)SiO2球的合成

[0071] 将0.3g十六烷基三甲基溴化铵和2mL 25wt％的浓氨水加入到含有30mL无水乙醇和100mL去离子水的混合溶液中。然后，将混合物加热至30℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(2mL)。在35℃下搅拌48小时后，以5000rpm离心10分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次。

[0072] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0073] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在200mL去离子水中，在90℃水浴中陈化处理48小时。将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次。再次将沉淀通过超声处理分散在160mL的无水乙醇中，加入500μL 37％的盐酸溶液，并在60℃下搅拌4小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得HMSNs-1。

[0074] 3)hemin的负载

[0075] 按照hemin与HMSNs-1的质量比为1:80，在剧烈搅拌下将HMSNs-1加入到hemin溶液中，继续搅拌4小时获得hemin-HMSNs-1。

[0076] 如图6所示是实施例2所制备的hemin-HMSNs-1的TEM图，单个纳米粒子的粒径为170nm，壁厚为6nm。

[0077] 实施例2中hemin-HMSNs-1纳米机器人同样表现出清除O2·-和·OH的能力。在hemin的浓度为10μM时，其清除效率分别为38.1％和47.5％。

[0078] 实施例3

[0079] 1)SiO2球的合成

[0080] 将0.4g十六烷基三甲基溴化铵和3mL 25wt％的浓氨水加入到含有50mL无水乙醇和120mL去离子水的混合溶液中。然后，将混合物加热至30℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(3mL)。在45℃下搅拌48小时后，以5000rpm离心10分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次。

[0081] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0082] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在200mL去离子水中，在70℃水浴中陈化处理48小时。将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次。再次将沉淀通过超声处理分散在160mL的无水乙醇中，加入500μL 37％的盐酸溶液，并在60℃下搅拌4小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球(HMSNs)。

[0083] 3)hemin的负载

[0084] 按照hemin与HMSNs的质量比为1:80，在剧烈搅拌下将HMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌4小时获得hemin-HMSNs纳米酶。

[0085] 实施例4

[0086] 1)SiO2球的合成

[0087] 将0.4g十六烷基三甲基溴化铵和3mL 25wt％的浓氨水加入到含有60mL无水乙醇和100mL去离子水的混合溶液中。然后，将混合物加热至30℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(3mL)。在45℃下搅拌48小时后，以5000rpm离心10分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次。

[0088] 2)空心结构的介孔SiO2球的合成

[0089] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在200mL去离子水中，在90℃水浴中陈化处理36小时。将沉淀离心分离后，用去离子水洗涤三次。再次将沉淀通过超声处理分散在160mL的无水乙醇中，加入500μL 37％的盐酸溶液，并在60℃下搅拌4小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得空心结构的介孔SiO2球。

[0090] 3)hemin的负载

[0091] 按照hemin与HMSNs的质量比为1:90，在剧烈搅拌下将HMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌4小时获得hemin-HMSNs纳米酶。

[0092] 对比例1

[0093] 1)SiO2球的合成

[0094] 将0.3g十六烷基三甲基溴化铵和2mL 25wt％的浓氨水加入到含有60mL无水乙醇和100mL去离子水的混合溶液中。然后，将混合物加热至35℃，并在剧烈搅拌下快速加入正硅酸乙酯(2mL)。在35℃下搅拌48小时后，以5000rpm离心10分钟收集白色产物并用乙醇洗涤三次。

[0095] 2)实心结构的介孔SiO2球的合成

[0096] 将制成的SiO2球通过超声处理分散在160mL的无水乙醇中，加入480μL37％的盐酸溶液，并在60℃下搅拌3小时除去十六烷基三甲基溴化铵，获得实心结构的介孔SiO2球(SMSNs)。

[0097] 3)hemin的负载

[0098] 按照hemin与SMSNs的质量比为1:80，在剧烈搅拌下将SMSNs加入到hemin溶液中，继续搅拌4小时获得hemin-SMSNs纳米酶。

[0099] 图7给出了对比例1中hemin-SMSNs的TEM图。由图可见，hemin-SMSNs的粒径为630nm。

[0100] 图8给出了对比例1中hemin-SMSNs的运动轨迹。

[0101] 对比例1中hemin-SMSNs纳米机器人的在细胞内的抗氧化活性测试实验

[0102] 将HUVEC接种在24孔板中并培养24小时。之后，除去细胞培养基，将贴壁细胞与hemin-SMSNs(hemin终浓度为10μM)在37℃下孵育4小时。为了除去过量的纳米颗粒，用pH 7.4磷酸盐缓洗涤细胞三次。将细胞在37℃下与60μM的阳性试剂一起孵育1小时。然后，将细胞进一步与DCFH-DA在37℃下孵育1小时。用PBS洗涤三次后，使用酶标仪以激发波长为
488nm，发射波长为525nm，测定细胞内ROS水平。

[0103] 通过定量分析表明，对比例1的hemin-SMSNs纳米机器人可清除35％的ROS，远低于实施例1的测试结果。

[0104] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。