一种新型转座子Tn6505及其应用

摘要

本发明涉及一种新型转座子Tn6505及其应用，所述新型转座子Tn6505具有如序列表中序列1的核苷酸序列。所述新型转座子Tn6505属于一种新型的碳青霉烯酶耐药相关转座子。其以Tn1696为骨架包含一个1型整合子In655，期间包含碳青霉烯酶耐药基因blaIMP‑8，在下游包含重金属汞的耐药基因位点merlocus。整个结构可依靠转座酶TnpA实现药物抗性的整体转移与传播。所述转座子及包含其的质粒或者微生物，可应用在制备检测生物耐药性的产品或者构建耐药性检测模型的领域。

权利要求

1.一种新型转座子Tn6505，其特征在于，所述转座子Tn6505的核苷酸序列为序列表中序列1所示的核苷酸序列。

2.一种质粒，其特征在于，所述质粒含有如权利要求1所述的新型转座子Tn6505。

3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，所述质粒为质粒P16005813B，所述质粒P16005813B的核苷酸序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

4.一种微生物，其特征在于，所述微生物含有如权利要求1所述的转座子。

5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为非脱羧勒克菌。

6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为非脱羧勒克菌p16005813，保藏编号为：CGMCC NO.17253。

7.权利要求1中所述的转座子、权利要求2-3任一所述的质粒或者权利要求4-6任一所述的微生物在制备检测生物耐药性的产品中的应用；所述耐药性中所指的药物为哌拉西林、他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明或四环素。

8.权利要求1中所述的转座子、权利要求2-3任一所述的质粒或者权利要求5-6任一所述的微生物在构建耐药性检测模型中的应用；所述耐药性中所指的药物为哌拉西林、他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明或四环素。

说明书

一种新型转座子Tn6505及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种新型转座子Tn6505及其应用。

背景技术

[0002] 非脱羧勒克菌属于非脱羧勒克菌属，且为其中唯一菌种。初期鉴定命名为非脱羧埃希菌，1986年将非脱羧埃希菌重新命名为非脱羧勒克菌。其为肠杆菌科中的一种可移动、兼性厌氧革兰阴性杆菌，广泛分布于动物肠道、人类肠道以及自然环境中。一般条件下属于条件致病菌，对于正常人群不致病，仅对免疫缺陷等病人致病。因此，临床检验上很少引起注意。其感染可引起败血症、伤口感染等。近年来，随着耐药情况的日益严重，非脱羧勒克菌成为耐药性传播的一个重要载体。

[0003] 转座子是一类在转座酶和重组酶共同作用下实现一段基因插入、剪切等一系列移动，最终实现基因的转座活动的一类移动元件。根据其结构特征，可将转座子分为8类：简单转座子(simple transposon)，即插入序列(insertion sequence，IS)；IS介导的转座单元(IS-mediated transposition unit)；复合型转座子(composite transposon)；单元型转座子(unit transposon)，通常携带一系列核心转座模块，包括转座酶，解离酶(resolvase)和解离位点(res)；整合型接合元件(integrative and conjugative element，ICE)，又称可接合型转座子(conjugative transposon)；整合型移动元件(integrative and mobilizable elements，IME)；转座型前噬菌体(transposable prophages)和整合型卫星噬菌体(integrative satellite prophages)。

[0004] 单元型转座子中Tn402属于Tn5053家族转座子是一类较常见转座子，通常包含1型整合子结构。Tn402转座子结构中通常具有完整的编码tni模块(tniABQ–res–tniR)或部分。Tn402转座子的两端具有25bp的反向重复序列(invertrepeat lift/right,IRL/IRR)，同时在其上游和下游分别有4个和2个TniA蛋白结合位点。Tn402转座子在进化的过程中，通过捕获染色体上的1型整合子而具备转座子的移动能力，同时，也可通过1型整合子的基因盒结构具备捕获外源基因的能力。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种新型转座子Tn6505及其应用。

[0006] 本发明提供一种新型转座子Tn6505，具有如序列表中序列1的核苷酸序列。

[0007] 一种质粒p16005813B，所述质粒p16005813B含有如权利要求1所述的新型转座子Tn6505。

[0008] 进一步，所述质粒p16005813B具有如序列表中序列2的核苷酸序列。

[0009] 一种质粒p16005813B的制备方法，包括如下步骤：

[0010] (1)提取非脱羧勒克菌16005813，保藏编号为：CGMCC NO.17253的基因组DNA，[0011] (2)将该基因组DNA转入大肠杆菌，

[0012] (3)鉴定重组大肠杆菌，获得含有blaIMP基因且不含有blaTEM和blaCTX-M-9基因的重组大肠杆菌；

[0013] (4)从步骤3获得的大肠杆菌中分离得到质粒，即为质粒p16005813B。

[0014] 一种微生物，所述微生物含有如权利要求1所述的转座子。

[0015] 进一步，所述微生物为非脱羧勒克菌。

[0016] 进一步，所述微生物为非脱羧勒克菌16005813，保藏编号为：CGMCC NO.17253。

[0017] 上述的转座子、上述的质粒或者上述的微生物在制备检测生物耐药性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

[0018] 其中，所述耐药性中所指的药物包括哌拉西林、他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明和四环素。

[0019] 上述的转座子、上述的质粒或者上述的微生物在构建耐药性检测模型中的应用也属于本发明的保护范围。

[0020] 本发明的新型转座子Tn6505属于一种新型的碳青霉烯酶耐药相关转座子。其以Tn1696为骨架包含一个1型整合子In655，期间包含碳青霉烯酶耐药基因blaIMP-8，在下游包含重金属汞的耐药基因位点merlocus。整个结构可依靠转座酶TnpA实现药物抗性的整体转移与传播。所述转座子及包含其的质粒或者微生物，可应用在制备检测生物耐药性的产品或者构建耐药性检测模型的领域。

附图说明

[0021] 图1为本发明的新型转座子Tn6505的结构图。

具体实施方式

[0022] 实施例1、耐药菌株的分离及耐药性分析

[0023] 一、菌株的分离、鉴定及保藏

[0024] 2016年自浙江省宁波某医院的病人痰液中分离得到一个菌株，将其命名为菌株16005813。将菌株16005813的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列2所示。经过鉴定，其16S rRNA基因鉴定与非脱羧勒克菌相似度100％，该菌株16005813属于非脱羧勒克菌，将其命名为勒克菌属非脱羧勒克菌16005813(以下简称非脱羧勒克菌
16005813)。

[0025] 非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)p16005813，已于2019年2月22日(3月8日签字)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.17253。非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)p16005813CGMCC NO.17253简称为非脱羧勒克菌16005813。

[0026] 二、非脱羧勒克菌16005813的产碳青霉烯酶情况检测

[0027] 利用改良型Carba NP法检测非脱羧勒克菌16005813的产碳青霉烯酶情况，具体步骤如下：

[0028] 1、将非脱羧勒克菌16005813接种于3ml M-H肉汤培养基中，37℃200r/min培养至菌液OD600nm值为1.0，然后将菌悬液8000rpm/min离心收集菌体沉淀。

[0029] 2、用Tris-HCl(pH7.8)重悬步骤1得到的菌体沉淀，再次8000rpm/min离心，重复洗菌2次后，重悬于500μL Tris-HCl溶液中，得到菌液。

[0030] 3、将步骤2得到的菌液进行超声(功率300w，超声5s暂歇5s，重复10-12次)，超声结束后离心8000rpm/min取上清50μL，分别加入已加50μL底物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的检测孔中吹打混匀，放置于37℃温箱孵育2h，期间观测底物颜色变化。

[0031] 底物-I:每毫升0.054％酚红溶液(pH 7.8)中含有0.1mmol/L ZnSO4。

[0032] 底物-II:每毫升0.054％酚红溶液(pH 7.8)中含有3mg/mL亚胺培南和0.1mmol/LZnSO4。

[0033] 底物-III:每毫升0.054％酚红溶液(pH 7.8)中含有3mg/mL的亚胺培南、4mg/mL他唑巴坦和0.1mmol/L ZnSO4。

[0034] 底物-IV:每毫升0.054％酚红溶液(pH 7.8)中含有3mg/mL的亚胺培南、0.003mol/LEDTA和0.1mmol/L ZnSO4。

[0035] 底物-V:每毫升0.054％酚红溶液(pH 7.8)中含有3mg/mL的亚胺培南、4mg/mL他唑巴坦、0.003mol/L EDTA和0.1mmol/L ZnSO4。

[0036] 表1显色结果判定参考

[0037]

[0038] 由表1中的结果显示，非脱羧勒克菌16005813呈现B型金属酶特征。

[0039] 三、非脱羧勒克菌16005813中部分碳青霉烯酶基因及ESBL基因检测

[0040] 采用非脱羧勒克菌16005813菌体热裂解得到的上清为模板，分别采用表2中所述的引物进行PCR扩增，检测非脱羧勒克菌16005813中，部分已知的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaIMP、blaNDM)和ESBLs基因(blaTEM、blaSHV、blaOXA-1group、blaCTX-M-9group)存在情况。

[0041] 表2引物信息

[0042]

[0043] 结果表明，非脱羧勒克菌16005813携带碳青霉烯酶基因blaTEM、blaIMP和blaCTX-M-9G。

[0044] 三、非脱羧勒克菌16005813耐药性检测

[0045] 采用BioMérieux VITEK 2检测非脱羧勒克菌16005813的最小抑菌浓度(MIC)，以判断其抗生素敏感性。

[0046] 结果显示(见表3)，非脱羧勒克菌16005813对青霉素类(哌拉西林)、一代头孢(头孢唑林)、三代头孢(头孢他啶)、碳青霉烯(亚胺培南)、单菌素类(氨曲南)、氨基糖苷(阿米卡星)、大环内脂(阿奇霉素)、磺胺(复方新诺明)、四环素类(四环素)等均表现出耐药特征。

[0047] 实施例2、转座子Tn6505的获得及其结构分析

[0048] 一、质粒p16005813B的获得

[0049] 利用 Microbial DNA Isolation kit(NO.12224-250)对非脱羧勒克菌16005813进行全基因组测序，经过大量生物信息学分析，得到新型多药耐药质粒，将其命名为耐药质粒p16005813B，其核苷酸序列如序列表的序列2所示。

[0050] 质粒p16005813B的制备，取100μL感受态细胞，加入1-3μg非脱羧勒克菌16005813的基因组提取液(体积不超过10μL)，温和吹打混匀，冰浴10min；转入预冷的电击杯(电极间距0.2cm)，冰浴10min；用电转仪条件25μF，200Ω，2.5Kv进行电击；将电击杯中的菌液转移至500μL SOB肉汤；37℃200rpm培养1h。取100μL菌液，涂布于SOB平板(4μg/mL氨苄抗性)。37℃培养18-24h，可见单菌落生长，这些单菌落即为有氨苄抗性的转化子。挑取单个菌落，检测其16S rDNA并分别使用用于检测blaTEM基因的引物对TEM-F/R、用于检测blaIMP基因的引物对IMP-F/R和用于检测blaCTX-M-9基因的引物对CTX-M-9G-F/R进行PCR扩增，筛选阳性菌株，其中阳性菌株为16S rDNA结果为大肠杆菌且电泳结果显示仅含有blaIMP基因并不含blaTEM和blaCTX-M-9基因的菌株(所述16S rDNA验证结果如序列3所示，所述blaIMP基因基因验证结果如序列4所示)。分离阳性菌株中的质粒，既可以得到质粒p16005813B。

[0051] 二、耐药质粒p16005813B精细结构分析

[0052] 1)基因初步注释

[0053] 将测序拼接结果提交RAST(http://rast.nmpdr.org/)预测ORF区，按反馈的结果中正向第一个rep基因为起始点调整序列。并再次提交RAST，获得以rep基因为起始点的GBK文件。同时，将调整后的序列提交ISSaga(http://issaga.biotoul.fr/ISsaga2/issaga_index.php)、INTEGRALL(http://integrall.bio.ua.pt/？)、CARD(https://card.mcmaster.ca/)初步预测插入序列、整合子以及耐药基因的整体分布情况。已获得质粒中移动元件及耐药基因的分布及存在的情况。

[0054] 2)基因精准注释

[0055] 现有公开数据库中，同一基因的片段大小，蛋白功能等信息注释结果存在不一致。为达到去伪存真的目的，利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、UniProtKB/Swiss-Prot(https://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)数据库和RefSeq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)数据库校准每个基因的起始位点，结合质粒结构的上下游关系以及已注释结果的分析、甄别、判断每个基因功能。同时再次将质粒序列提交ISSaga、INTEGRALL等在线数据库，分别对插入序列、转座子、整合子等非编码区、外源插入序列进行预测，并与NCBI数据库中的标准参考序列比对，校准所有插入序列、整合子、转座子的起始位点、正反向重复序列、关键基因组成等信息。整理成标准GBK文件，运用自编写脚本调用Inkscape绘制质粒圈图和耐药区精细结构图。

[0056] 新型转座子Tn6505结构图见图1，其序列如序列1所示。

[0057] 新型转座子Tn6505属于一种新型的碳青霉烯酶耐药相关转座子。其以Tn1696为骨架包含一个1型整合子In655，期间包含碳青霉烯酶耐药基因blaIMP-8，在下游包含重金属汞的耐药基因位点merlocus。整个结构可依靠转座酶TnpA实现药物抗性的整体转移与传播。

[0058] 实施例3、转座子Tn6505介导的耐药基因传播的功能验证

[0059] 基因组DNA：16005813。使用之前方法提取16005813菌株基因组DNA作为电转使用。

[0060] 感受态细胞：大肠杆菌DH5α(不具有耐药性)。购买自宝生物工程(大连)有限公司(货号：9027)。

[0061] 1、取100μL感受态细胞，加入1-3μg16005813菌株基因组DNA(体积不超过10μL)，温和吹打混匀，冰浴10min；转入预冷的电击杯(电极间距0.2cm)，冰浴10min；用电转仪条件25μF，200Ω，2.5Kv进行电击；将电击杯中的菌液转移至500μL SOB肉汤；37℃200rpm培养1h。

[0062] 2、转化子筛选：取100μL菌液，涂布于SOB平板(4μg/mL氨苄抗性)。37℃培养18-24h，可见单菌落生长，这些单菌落即为有氨苄抗性的转化子。

[0063] 3、完成步骤2后，挑取单个菌落(接合子)，检测其16S rDNA并分别使用用于检测blaTEM基因的引物对TEM-F/R、用于检测blaIMP基因的引物对IMP-F/R和用于检测blaCTX-M-9基因的引物对CTX-M-9G-F/R进行PCR扩增，筛选阳性菌株，其中阳性菌株为16S rDNA结果为大肠杆菌且电泳结果显示仅含有blaIMP基因并不含blaTEM和blaCTX-M-9基因的菌株。

[0064] 4、将步骤3筛选得到的阳性菌株(p16005813B-DH)进行耐药性检测(方法同实施例1)。结果表明，由于Tn6505的作用导致大肠菌DH5α获得碳青霉烯酶基因blaIMP，该耐药质粒导致接合细菌获得碳青霉烯酶、类等一系列抗生素抗性(详见表3)。表3中，R表示耐药，I表示中性，S表示敏感。其中，16005813B-DH表示转入质粒16005813B的大肠杆菌，在表格中用
16005813B-DH表示。MIC表示最小抑菌浓度实验。

[0065] 表3 16005813与接合子16005813B-DHMIC结果

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