高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用

摘要

本发明涉及糖苷转化技术领域，具体涉及高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用。本发明将高速逆流色谱仪作为糖苷类成分进行生物酶转化反应的反应器，利用糖苷及苷元在两相溶剂之间的分配差异，预先将糖苷水解酶加入水相溶液中作为固定相，将待转化的糖苷底物加入流动相中。逆流色谱运转时，酶位于固定相中，由于底物糖苷更易溶于水溶液，在流动过程中会从流动相进入固定相与糖苷水解酶发生充分酶解反应生成小分子苷元，生成的苷元随流动相流出，完成生物转化及分离过程。本发明将高速逆流色谱仪作为生物转化反应器，能够一次性完成转化及分离，并且能够消除酶解反应过程中的抑制效应，增加转化率，具有显著的技术效果及经济意义。

权利要求

1.一种基于高速逆流色谱的糖苷转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制适合高速逆流色谱两相溶剂系统，即流动相与固定相；其中，糖苷水解酶加入固定相中，糖苷底物加入流动相中；

（2）将加入酶的固定相溶液泵入高速逆流色谱仪，设置仪器参数，泵入空白流动相达到流体动力学平衡；

（3）将加入糖苷底物的流动相以一定流速泵入高速逆流色谱仪进行酶解反应，出口端收集产物溶液；

（4）将步骤（3）中得到的产物溶液浓缩，烘箱干燥，即得苷元；

所述高速逆流色谱仪采用正转反接或反转正接模式；

所述两相溶剂体系为水相溶剂及与其不互溶的有机相溶剂，所述水相溶剂作为固定相，糖苷底物在水相溶液中的分配系数大于在有机相中的分配系数，生成的苷元在有机相中的分配系数大于在水相中的分配系数，所述糖苷底物在水相溶剂中的分配系数大于苷元产物在水相溶剂中的分配系数；

所述水相溶剂为两相系统的下相，有机相溶剂为两相系统的上相。

2.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，通过HPLC法测定糖苷底物与苷元在两相溶剂系统中的分配系数KD值。

3.如权利要求2所述的转化方法，其特征在于，所述分配系数KD值测定方法步骤如下：按溶剂系统的比例，配制一定体积溶剂，充分振摇，静置分层；先取部分水相于试管中，加入等量的底物和产物， HPLC测定水相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积有机相，充分振摇，静置分层，再测定水相中目标峰的峰面积，记为A2；样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD = (A1-A2) / A2。

4.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述有机相溶剂为乙酸乙酯或正己烷，所述水相溶剂为含有缓冲盐的水溶液，该水溶液具有适宜糖苷水解酶的浓度及pH值。

5.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述配置好的两相溶剂体系在泵入高速逆流色谱仪之前需放置于水浴锅中保温待用，水浴锅的温度为35-45℃。

6.如权利要求5所述的转化方法，其特征在于，水浴锅的温度为40℃。

7.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述糖苷水解酶是α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、壳三糖苷酶、硫代糖苷酶中的一种。

8.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的转速为750-

1000rpm/min。

9.如权利要求8所述的转化方法，其特征在于，所述高速逆流色谱仪的转速为800-

850rpm/min。

10.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，步骤（3）中加入了底物的流动相溶液以

20-40 mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪。

说明书

高速逆流色谱仪在糖苷类成分生物转化中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及糖苷转化技术领域，具体涉及高速逆流色谱仪作为酶解反应器将糖苷类物质生物转化为苷元的应用。

背景技术

[0002] 糖苷，又称配糖体，由弱极性的配基与强极性的糖基组成，其中非糖部分称为苷元。因而糖苷类化合物分子具有极性大、脂溶性差、分子质量大的特点，不易透过肠壁黏膜吸收。糖苷由于在肠内滞留时间较长，部分糖苷在肠道内特异菌群分泌的酶的作用下发生了转化，转化产物极性减小，脂溶性增加，更容易透过肠壁进入血液循环，进而发挥药效。例如，大豆异黄酮为大豆中的主要活性成分，具有降低乳腺癌发病率、改善性脑血管疾病的功效，而自然界中天然的大豆异黄酮主要为结合型葡糖苷的形式，需要在肠道菌群的代谢作用下转化为苷元后才能被机体吸收利用。京尼平苷是从栀子果中提取的一种环烯醚萜苷，其苷元为京尼平，具有良好的利胆作用。商陆中的主要成分商陆皂苷，其苷元为三萜皂苷，祛痰作用显著强于商陆皂苷。将天然植物中的成分经过体外生物转化得到活性更好的苷元，将有助于进一步明确苷类药物口服起效的机制，同时对指导开发以苷元为药效物质基础的高效制剂具有潜在的价值。

[0003] 生物转化法具有反应温和、专一性强以及环境污染小等优势，具有广阔的应用前景。常见的生物转化的反应器主要包括均相反应器、固定化酶反应器、酶膜反应器、陶瓷膜反应器等，具有反应量大，酶处理简单等优势，同时存在产物抑制现象严重、膜物理损伤严重、易污染、回收困难、清洗和更换麻烦等劣势。

[0004] 高速逆流色谱法于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，依靠被分离物质在两相中分配系数K值的不同，实现样品的有效分离，可以达到几千个理论塔板数。高速逆流色谱能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响，已经在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用。同时高速逆流色谱使用简单的螺旋空管，进料方式简单灵活，样品不需要严格的预处理，可处理带固体悬浮物的物料，这些优点使高速逆流色谱作为生物反应器潜力巨大。现有技术中通常向糖苷中加入酶完成生物转化反应后，再经高速逆流色谱将反应后的苷元分离，步骤较为繁琐，尚未公开将高速逆流色谱仪直接作为生物酶转化反应器的技术方案。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术中的空白，针对常规生物反应器的劣势，本发明目的在于提供一种基于高速逆流色谱的生物转化方法，该方法适用于绝大多数糖苷类物质的转化，具有操作方便、转化率高，可直接得到高纯度苷元。

[0006] 本发明将高速逆流色谱仪作为酶解反应的反应器，基于逆流色谱的工作方式，为糖苷与酶的反应提供了新的反应形式。由于多数的糖苷及酶更易溶于水溶液，本发明预先将糖苷水解酶加入水相溶液中作为固定相，将待转化的糖苷底物加入流动相中。逆流色谱运转时，酶位于固定相中，处于相对固定的状态，由于底物糖苷更易溶于水溶液，在流动过程中会从流动相进入固定相与糖苷水解酶发生酶解反应生成小分子苷元，苷元往往极性较小、更易溶于有机相溶液，生成的苷元回到流动相中，完成生物转化及分离过程。

[0007] 针对上述生物转化形式，本发明中的两性溶剂体系依据糖苷及苷元的溶解性进行确定，其中固定相为更易溶解酶和糖苷的水相溶液，可以是加入了缓冲盐的水溶液，该缓冲盐溶液的设置是为了保持酶的活性、提供相应的离子浓度及pH值。流动相选择与固定相不互溶的有机溶液，生成的苷元在该有机溶液中的溶解度大于在固定相中的溶解度，促使生成的苷元能够随流动相一同流出。确定两相溶剂体系后，对酶进行酶活力测试，测定该溶剂体系下酶解效率最佳的酶或酶组合。

[0008] 为了实现以上技术目的，本发明技术方案如下：

[0009] 本发明第一方面，提供一种基于高速逆流色谱的糖苷转化方法，该转化方法包括以下步骤：

[0010] (1)配制适合逆流色谱两相溶剂系统，即流动相与固定相；其中，糖苷水解酶加入固定相中，糖苷底物加入流动相中；

[0011] (2)将加入酶的固定相溶液泵入高速逆流色谱仪，设置仪器参数，泵入空白流动相达到流体动力学平衡；

[0012] (3)将加入底物的流动相以一定流速泵入逆流色谱仪进行酶解反应，出口端收集产物溶液；

[0013] (4)将步骤(3)中得到的产物溶液浓缩，烘箱干燥，即得苷元。

[0014] 优选的，上述逆流色谱的两相溶剂为水相溶液及与其不互溶的有机相溶液，其中水相溶液作为固定相，有机相溶液作为流动相。糖苷底物在水相溶液中的分配系数大于在有机相中的分配系数，生成的苷元在有机相中的分配系数大于在水相中的分配系数，糖苷底物在水相溶液中的分配系数应当大于苷元在水相溶液中的分配系数。

[0015] 进一步优选的，通过HPLC法测定糖苷底物和苷元在逆流色谱两相溶剂系统中的分配系数(KD)值，具体步骤如下：

[0016] 按溶剂系统的比例，配制一定体积溶剂，充分振摇，静置分层。先取部分水相于试管中，加入等量的底物和产物，HPLC测定水相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积有机相，充分振摇，静置分层，再测定水相中目标峰的峰面积，记为A2。样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD＝(A1-A2)/A2。通过计算，选择底物KD大于产物KD的溶剂体系。

[0017] 进一步优选的，其中水相溶液为两相系统的下相，有机相溶液为两相系统的上相。现有技术中，为了实现良好的分离效果，一般将质地更轻的上相溶液作为固定相，以确保分离过程中能够具有良好的固定相保留率。而本发明的方案中，采用下相作为固定相，为了保证一定的固定相保留率，操作难度更大。

[0018] 更进一步优选的，上述有机相溶液为乙酸乙酯、正己烷为主要成分的有机溶液，水相溶液为含有缓冲盐的水溶液，具有适宜上述糖苷水解酶存活浓度和pH值。

[0019] 优选的，上述配置好的两相溶液在泵入逆流色谱仪之前需放置于水浴锅中保温待用，水浴锅的温度为35-45℃。具体的，为40℃。

[0020] 优选的，该糖苷水解酶的设置依据底物中糖苷键的类型及酶在溶剂体系中的活力进行选择，可以是α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、壳三糖苷酶、硫代糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、纤维素酶、柚苷酶、果胶酶中的一种或几种的混合。

[0021] 优选的，上述转化方法中，逆流色谱采用正转反接或反转正接模式；更优选的，采用正转反接模式。本发明研究表明，正转反接和反转正接两种模式下均具有较高的固定相保留率，可达到80％以上，适合于作为逆流色谱反应器的洗脱模式。

[0022] 优选的，逆流色谱仪的转速为750-1000rpm/min；更优选的，为800-850rpm/min。

[0023] 优选的，步骤(3)中加入了底物的流动相溶液以20-40mL/min的流速泵入逆流色谱仪。本领域公知，逆流色谱仪工作时需要保证良好的固定相保留率，当流动相流速相对慢时，不利于固定相的保留，使酶解反应无法进行，而流动相流动相流速过快时，则不利于流动相中的糖苷进行固定相与酶进行充分的反应。因此，固定相和流动相的流速应当处于一个相对的有效范围，既能够实现良好的固定相保留率，又能够使底物与酶发生充分的酶解反应。

[0024] 优选的，步骤(3)中逆流色谱仪按FED-OUT模式运行。

[0025] 优选的，当糖苷底物为染料木苷时，其苷元为染料木素，采用的两相溶剂体系为乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系。

[0026] 进一步优选的，该乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系的配制方法如下：将乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统按照比例置于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，待两相达到平衡，分别取上、下相，超声脱气后备用。

[0027] 进一步优选的，固定相中加入的酶为β-葡萄糖苷酶。

[0028] 进一步优选的，取部分流动相溶液加入染料木苷，超声使其充分溶解，配制成62.5mg/L的底物溶液；固定相中加入β-葡萄糖苷酶，充分混匀，配制成0.75mg/mL的酶溶液。

[0029] 优选的，当糖苷底物为虎杖苷时，其苷元为白藜芦醇，采用的两相溶剂体系为乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系。

[0030] 针对逆流色谱进行酶解反应的两相溶剂进行考察，考察对象包括正己烷/缓冲溶液(1：1，v/v)、乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)、氯仿/缓冲溶液(1：1，v/v)和正丁醇/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统。利用HPLC法测定虎杖苷和白藜芦醇在逆流色谱两相溶剂系统中的分配系数值，最终选择了乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)为两相溶剂系统。

[0031] 进一步优选的，该乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)体系的配制方法如下：将乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统按照比例置于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，待两相达到平衡，分别取上、下相，超声脱气后备用。

[0032] 进一步优选的，固定相中加入的酶为β-葡萄糖苷酶。

[0033] 进一步优选的，固定相中加入酶及曲拉通X-100，配置成为配制成0.75mg/mL的酶溶液。

[0034] 优选的，当糖苷底物为大豆黄酮苷时，其苷元为大豆异黄酮，采用两相溶剂体系为正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(1：1.6：1：1.6，v/v)溶剂系统。

[0035] 进一步优选的，糖苷水解酶为β-葡萄糖苷酶和蜗牛酶。

[0036] 进一步优选额，流动相中加入大豆异黄酮苷，配制成0.2mg/mL的底物溶液；固定相中加入β-葡萄糖苷酶及蜗牛酶，充分混匀，配制成0.75mg/mL的生物反应器酶溶液。

[0037] 本发明的第二方面，提供高速逆流色谱仪作为酶解反应器的应用；优选的，高速逆流色谱仪作为酶解反应器在糖苷类成分转化方面的应用。

[0038] 本发明的有益效果

[0039] 1.逆流色谱是一组螺旋空管，无内部构件，轴向流动和径向周期变化的强离心力产生双向多角度的强烈振荡来实相的混合和澄清，这种作用有利于酶与底物的充分混合，使生物转化反应进行的更为彻底。

[0040] 2.选择逆流色谱仪作为反应器内无构件，无机械搅拌，对酶无损伤，有利于保持酶的活性和浓度；本领域技术人员可以通过选择合适的两相或三相，实现固定化酶促反应的反应-分离的耦合，且反应完成后能够方便的对生物酶进行回收。

[0041] 3.现有技术中往往采用向糖苷溶液中加入酶或产酶的菌类进行共培养的方式进行生物转化反应，随着产物的浓度升高，使得产物抑制作用增强，正向反应难以进行，使酶解反应的转化率难以提升。本发明中，生成的苷元分配于流动相，酶分配于固定相中，基本消除了反应过程产物抑制现象，使反应朝着有利于苷元生成的方向进行，提高反应效率。

[0042] 4.本发明转化方法，相比现有技术中采用先加入酶进行生物转化反应再将染料木素分离的方法更为简便易行，且采用逆流色谱仪完成生物转化反应还具有降低产物抑制作用，方便回收酶剂，分离得到高纯度苷元的效果，技术效果十分优越。

[0043] 5.本发明中的生物转化方法可应用于多种糖苷类物质，是一种具有普适性的生物转化方法，将天然提取物糖苷转化为生物活性更好的苷元具有重要的经济意义，本发明的方法有望应用于工业生产，具有重要的经济意义。

附图说明

[0044] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

[0045] 图1实施例1的工艺流程图；

[0046] 图2实施例1中分离模式对固定相保留率柱形图；

[0047] 图3实施例1中转速对固定相保留率柱形图；

[0048] 图4实施例1中流速与产物纯度关系图；

[0049] 图5实施例1中产物与标准品的高效液相色谱图。

[0050] 其中，a为混合标样，b为产物，c为底物。

[0051] 图6实施例2的工艺流程图；

[0052] 图7实施例2中分离模式对固定相保留率的影响；

[0053] 图8实施例2中流速对固定相保留率的影响；

[0054] 图9实施例2中转速对产物纯度的影响；

[0055] 图10实施例2中流速与产物纯度关系图；

[0056] 图11实施例2中产物纯度与反应时间关系图。

[0057] 图12实施例3的工艺流程图；

[0058] 图13蜗牛酶和β-葡萄糖苷酶的逆流色谱生物反应器反应效果图；

[0059] 图14大豆异黄酮苷元的单次逆流色谱分离图；

[0060] 图15大豆异黄酮苷元的连续进样逆流色谱分离图；

[0061] 图16实施例3中分离的单体化合物的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0062] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0063] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0064] 正如背景技术所介绍的，现有技术中生物转化器存在产物抑制现象严重、膜物理损伤严重、易污染、回收困难、清洗和更换麻烦等劣势，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种基于逆流色谱的高效转化方法。

[0065] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

[0066] 实施例1染料木苷的生物转化

[0067] 1.两相溶剂及样品溶液的配制

[0068] 将乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统按照比例置于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，待两相达到平衡，分别取上、下相，超声脱气后备用。

[0069] 按照逆流色谱生物反应器的要求配置如下三种溶液：(1)取部分上相溶液作为逆流色谱的流动相，加入染料木苷，超声使其充分溶解，配制成62.5mg/L的底物溶液；(2)下相为固定相，加入β-葡萄糖苷酶，充分混匀，配制成0.75mg/mL的生物反应器酶溶液；(3)取部分上相溶液作为空白流动相，待用。上述三种溶液使用前放置于40℃水浴锅中，保温待用。

[0070] 2.逆流色谱反应器参数的优化

[0071] 图2显示乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统在正转反接、反转正接、正转正接和反转反接四种逆流色谱洗脱模式下的固定相保留率。结果表明，正转反接和反转正接两种模式下均具有较高的固定相保留率，分别为83.41％和83.43％，适合于作为逆流色谱反应器的洗脱模式。而正转正接和反转反接两种模式下固定相保留率为0，不能应用于逆流色谱反应器。

[0072] 图3显示了正转反接模式下，转速分别为550、600、650、700、750、800转/分钟，不同转速对固定相保留率的影响。结果表明，当转速为550转/分钟时，固定相保留值为0，继续增大转速，固定相保留率增加显著，当转速为800转/分钟时，固定相保留率可高达64.5％。因此，选择正转反接和800转/分钟作为最优参数用于逆流色谱生物反应器。

[0073] 3.逆流色谱生物反应器的运行

[0074] 首先以30mL/min流速将生物反应器的酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，按FWD-OUT模式，即顺时针方向旋转，流动相自逆流色谱仪的尾端泵入，转速调至800rmp，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱。当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有染料木苷的底物流动相溶液，开启检测器，设定检测器波长为
254nm，并开启记录仪进行数据采集，流出液收集于10mL试管。

[0075] 染料木苷样品经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1mL，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用HPLC法检测目标峰的转化率。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出，并计算固定相保留值(Rs)的大小。

[0076] 4.HPLC分析条件

[0077] 采用HPLC检测流出液中染料木素和染料木素的面积归一化含量。HPLC分析条件：Agilent Zorbax C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇：水＝70:30(v/v)，检测波长为254nm，柱温30℃。

[0078] 5.逆流色谱生物反应器效果

[0079] 图4显示了流速分别为1.0、2.0、2.2、2.5mL/min时，逆流色谱生物反应器生物转化染料木苷为染料木素的逆流色谱图和纯度结果。当流速为1.0mL/min时(图4A)，固定相保留率为75％，1.6-2.4h的吸收值为上升期，染料木苷转化率达到100％，这可能是由于进底物的初始阶段，底物反应时间较长，可充分在HSCCC反应器中转化，之后转化缓慢下降，反应时间12h内，染料木苷可被β-葡萄糖苷酶高效转化，转化率达到99％以上。当流速为2.0mL/min时(图4B)，固定相保留率为62％，染料木苷转化率也呈先高后低的趋势，反应时间12h内，转化率达到90％以上。当流速继续增大至2.2mL/min时(图4C)，固定相保留率为57％，吸收曲线波动较大，染料木苷转化率也呈先高后低的趋势，8h后开始下降迅速，14h时染料木苷转化率下降至70％。在流速为2.5mL/min时(图4D)，固定相保留率为50％，反应3h内转化率下降显著，3-12h，转化率维持在60-65％。流速为2.0mL/min时，反应时间12h内，转化率达到90％以上，可以作为最优的反应流速。生物的产物的纯度见图5。

[0080] 实施例2虎杖苷的生物转化

[0081] 1.溶剂系统选择

[0082] 依据虎杖苷的转化，本实施例中选择如下两相溶剂系统用于逆流色谱酶反应器，即正己烷/缓冲溶液(1：1，v/v)、乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)、氯仿/缓冲溶液(1：1，v/v)和正丁醇/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统，利用HPLC法测定虎杖苷(底物)和白藜芦醇(产物)在逆流色谱两相溶剂系统中的分配系数(KD)值，方法如下：按溶剂系统的比例，配制20mL溶剂，充分振摇，静置分层。先取5mL下相于试管中，加入虎杖苷和白藜芦醇样品各约1mg，用HPLC测定下相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积上相，充分振摇，静置分层，再测定下相中目标峰的峰面积，记为A2。则样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD＝(A1-A2)/A2。最终选择了乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)为两相溶剂系统。

[0083] 2.逆流色谱反应器参数的优化

[0084] 逆流色谱仪的运行中，主机的旋转方向有正转和反转两种模式，进液口可以为主机的进口或者出口，因此，有正转反接、反转正接、正转正接和反转反接四种逆流色谱洗脱模式。测定方法为首先以30mL/min的流速将固定相充满整个高速逆流色谱仪的分离柱，启动主机，将转速慢慢调为800rmp，控制温度为40℃，待转速稳定后，用2mL/min的速度泵入流动相，直至达到动力学平衡状态，停止转速，用氮气将分离管柱中的溶剂吹出，计算固定相保留值(Rs)的大小。正转反接和反转正接两种模式下具有较高的固定相保留率，分别为83.41％和83.43％，适合于作为逆流色谱反应器的洗脱模式(图7)。

[0085] 图8显示了正转反接和反转正接两种模式下，不同流速(2、4、6、8、10毫升/分钟)对固定相保留率的影响。当流速增大至10.0毫升/分钟时，固定相保留率仍高于60％，并且FWD-OUT和REV-IN两种模式的趋势一致，无明显区别。

[0086] 图9显示了正转反接和反转正接两种模式下，转速分别为400、600、800和900转/分钟下，不同转速对固定相保留率的影响。800rpm和900转/分钟时，固定相保留率分别为83.61％和86.20％。800转/分钟和900转/分钟下增加不明显，考虑到仪器的稳定性，故选用
800转/分钟作为该逆流色谱生物反应器的最适转速。最终本实验选择了正转反接和800转/分钟作为最优参数用于逆流色谱生物反应器。

[0087] 3.两相溶剂系统及样品溶液的准备

[0088] 将乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统按照比例置于分液漏斗中，充分震荡，静置分层，待两相达到平衡，分别取上、下相，超声波脱气后备用。按照逆流色谱生物反应器的要求配置如下三种溶液：(1)取部分上相为流动相，加入200mg/L虎杖苷样品，超声使其充分溶解，得到底物溶液；(2)下相为固定相，配制成116.46mg/L的曲拉通X-100，再配制成0.75mg/mL的酶，充分混匀，作为生物反应器酶溶液；(3)取适量剩余上相，作为空白流动相，待用。上述三种溶液置于水浴锅中，40℃恒温，待用。

[0089] 4.逆流色谱生物反应器的运行

[0090] 首先以30mL/min流速将生物反应器的酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，按正转反接模式，即顺时针方向旋转，转速调至800rmp，将空白流动相以一定的流速自尾端进入逆流色谱分离柱。当两相溶剂系统达到流体动力学平衡后，泵入含有虎杖苷的底物溶液，开启检测器，设定检测波长为280nm，并开启记录仪进行数据采集，流出液收集于10mL试管。

[0091] 虎杖苷经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1mL，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用HPLC法检测白藜芦醇的纯度。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出并，计算固定相保留值(Rs)大小。

[0092] 5.HPLC分析条件

[0093] 流动相为乙腈/0.1％乙酸水溶液(30：70，v/v)，等度洗脱，流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长为280nm，进样量10μL。

[0094] 6.逆流色谱生物反应器效果

[0095] 图10显示了流速分别为3、4、5mL/min时，逆流色谱生物反应器生物转化虎杖苷为白藜芦醇的逆流色谱图和纯度结果(图5A：5mL/min；图5B：4mL/min；图5C：3mL/min；)。当流速为5mL/min时，固定相保留率为64.52％，白藜芦醇转化率较差，3h时出口处的白藜芦醇纯度为89.18％，降至80％以下，虎杖苷不能被充分酶解。当降低流速至4mL/min时，固定相保留率为66.70％，当逆流色谱生物反应器反应时间为8h时，白藜芦醇纯度降为89.09％，当反应时间为11h时，白藜芦醇纯度降为80.12％，逆流色谱反应器的酶解效率有了一定提高。进一步的调整逆流色谱生物反应器流速为3mL/min时，固定相保留率为68.18％，反应时间为9h时，白藜芦醇纯度仍为90％以上，当反应到12h，纯度降为84.30％。经过逆流色谱生物反应器流速的优化，最终选择流速为2mL/min，取得了满意的实验效果，固定相保留率
71.18％，当反应时间为10h时，白藜芦醇纯度为99.15％，继续延长反应时间当反应时间为
25h时，白藜芦醇纯度为90.82％(图11)。

[0096] 7.样品后处理

[0097] 将上述样品溶液减压浓缩除去乙酸乙酯，水溶解3次除去增溶剂，样品烘箱干燥，即得高纯度白藜芦醇单体。

[0098] 实施例3大豆黄酮苷的转化

[0099] 1.溶剂系统选择

[0100] 针对大豆黄酮苷的转化，本实施例选取如下两相溶剂系统用于逆流色谱酶反应器，即正己烷/缓冲溶液(1：1，v/v)、乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)、氯仿/缓冲溶液(1：1，v/v)和正丁醇/缓冲溶液(1：1，v/v)溶剂系统，利用HPLC法测定总大豆异黄酮苷(底物)和总大豆异黄酮苷元(产物)在逆流色谱两相溶剂系统中的分配系数(KD)值，方法如下：按溶剂系统的比例，配制20mL溶剂，充分振摇，静置分层。先取5mL下相于试管中，加入底物和产物各约1mg，用HPLC测定下相中各目标峰的峰面积，记为A1，再加入等体积上相，充分振摇，静置分层，再测定下相中目标峰的峰面积，记为A2。则样品在两相溶液的分配系数按如下公式计算：KD＝(A1-A2)/A2。最终选择了乙酸乙酯/缓冲溶液(1：1，v/v)为两相溶剂系统。

[0101] 2.最适酶的筛选

[0102] 根据KD值的测定，在乙酸乙酯/0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠水溶液(pH＝5)溶剂系统中，大豆苷、黄豆黄苷和染料木苷的K值分别为0.33、0.36和0.66，同时其对应的大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的K值均大于10，适合作为逆流色谱生物反应器的基础溶剂系统。选取β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、纤维素酶、柚苷酶、果胶酶和α-葡萄糖苷酶进行酶活力测试，测定各种酶对大豆异黄酮苷的酶解效果，从而选定酶解效果最佳的酶进行生物反应器反应，具体操作如下：

[0103] 取大豆异黄酮苷粗品20mg置于三角瓶中，加入200mL乙酸乙酯，超声使其充分溶解，得大豆异黄酮苷乙酸乙酯溶液，待用。

[0104] 配制浓度为0.1mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠水溶液，混匀，过滤，即得pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠空白缓冲溶液，待用。

[0105] 分别称取5mgβ-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、纤维素酶、柚苷酶、果胶酶和α-葡萄糖苷酶置于具塞三角瓶中，分别加入25mL的柠檬酸-柠檬酸钠空白缓冲液，充分震荡溶解，再加入25mL大豆异黄酮苷乙酸乙酯溶液，置于分液漏斗震荡仪上持续震荡，分别取1h、3h、6h和9h的上相溶液(乙酸乙酯相)和下相(水相)各1mL，上相溶液氮气吹干，等体积甲醇复溶，0.45μm针头过滤器过滤，进行液相色谱检测。

[0106] 最终选择了蜗牛酶和β-葡萄糖苷酶作为最适的酶进行下一步筛选。

[0107] 3.逆流色谱生物反应器的运行

[0108] 3.1两相溶剂及样品溶液的配制

[0109] 将正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(1：1.6：1：1.6，v/v)溶剂系统按比例置于2L分液漏斗，晃动使其充分饱和，静置，待两相达到平衡，分别放出上、下相，超声除气泡后备用。称取适量反应后的大豆异黄酮苷元样品，加入上相和下相各10mL，超声使其充分溶解，即为样品溶液。溶液使用前放置于40℃水浴锅中，保温待用。

[0110] 3.2逆流色谱生物反应器的运行

[0111] 首先以30mL/min流速将生物反应器的酶溶液泵入整个逆流色谱分离柱，充满后启动主机，按正转-反接模式，即顺时针方向旋转，转速调至800rmp，空白流动相以一定的流速自尾端进入分离柱。当逆流色谱两相达到流体动力学平衡状态，再泵入含有虎杖苷的底物溶液，开启检测器，设定检测波长为254nm，并开启记录仪进行数据采集。

[0112] 大豆异黄酮样品经过逆流色谱生物反应器生物转化后，定时取出流出液1mL，氮气吹干，甲醇复溶，0.45μm针头滤器过滤，采用HPLC法检测目标峰的转化率。待转化率低于一定纯度时，停止运行，用氮气将分离柱中的液体吹出，并计算固定相保留值(Rs)的大小。

[0113] 图13显示了流速为3、5、6mL/min时，β-葡萄糖苷酶和蜗牛酶酶解大豆异黄酮苷的逆流色谱图和纯度结果。当流动相流速为6mL/min时，添加β-葡萄糖苷酶的溶剂系统反应时间为9h时，出口处的大豆异黄酮苷元纯度降至90％以下(图13A)，添加蜗牛酶反应时间为3h时，出口处的大豆异黄酮苷元纯度降至90％以下，7h时降至50％以下(图13B)。当流动相流速调整为5mL/min时，添加β-葡萄糖苷酶溶剂系统反应时间为12h时，出口处的大豆异黄酮苷元纯度为99.70％(图13C)。而添加蜗牛酶溶剂系统反应时间为3h时，出口处的大豆异黄酮苷元纯度降至90％以下，10h时降至60％以下(图13D)。继续调整流速为3mL/min。当流动相流速为3mL/min时，添加β-葡萄糖苷酶溶剂系统当反应时间为20h，出口处的大豆异黄酮苷元纯度仍为99％以上(图13E)，而添加蜗牛酶溶剂系统反应时间为12h时，产物的纯度降为89.43％，反应时间为15h时，纯度下降为80％左右(图13F)。最终选择β-葡萄糖苷酶和3mL/min作为最终反应参数。

[0114] 3.3逆流色谱分离大豆苷元单体

[0115] 首先以30mL/min的流速将上相(固定相)泵入整个分离柱，待溶液充满后，启动主机，顺时针方向旋转，将转速调至800rmp，以2mL/min流速自逆流色谱仪的首端泵入流动相，当两相达到流体动力学平衡后，进样，开启检测器和记录仪，检测波长设置为254nm，手动收集流出液，每10mL收集一管，使用HPLC进行检测。分离完成后，停止转速，用氮气将分离柱中的液体吹出置于量筒中，计算固定相保留值(Rs)大小。

[0116] 图14和图15进行的一次和两次的样品分离结果表明，采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(1：1.6：1：1.6，v/v)溶剂系统，化合物1(大豆苷元)、2(黄豆黄素)和3(染料木素)得到了很好的分离，HPLC分析纯度均为98％以上(图16)。

[0117] HPLC流动相为乙腈/0.1％乙酸水溶液(30：70，v/v)，等度洗脱，流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长为254nm，进样量10μL。

[0118] 根据UV、ESI-MS和1H-NMR数据对分离得到的化合物进行结构确认，具体数据如下：

[0119] 峰1：黄色粉末，UVλmax(nm)：248.6，302.1；ESI-MS m/z：255[M+H]+，253[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：10.68(1H，s，7-OH)，9.45(1H，s，4'-OH)，8.23(1H，s，H-2)，7.97(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，7.38(2H，d，J＝8.5Hz，H-2'，6')，6.94(1H，dd，J＝2.0，2.1Hz，H-6)，
6.86(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.80(2H，d，J＝8.5Hz，H-3'，5')。与文献数据报道一致，峰1被鉴定为大豆苷元。

[0120] 峰2：白色粉末，UVλmax(nm)：256.9，318.8；ESI-MS m/z：285[M+H]+，283[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：3.88(3H，s，OCH3)，6.80(2H，d，J＝8.7Hz，H-3'，5')，6.94(1H，s，H-8)，7.38(2H，d，J＝8.7Hz，H-2'，6')，7.44(1H，s，H-5)，8.27(1H，s，H-2)，9.49(1H，s，OH-4')，10.55(1H，s，OH-7)。与文献数据报道一致，峰2被鉴定为黄豆黄素。

[0121] 峰3：黄色粉末，UVλmax(nm)：261.6；ESI-MS m/z：271[M+H]+，269[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ：12.93(1H，s，5-OH)，10.83(1H，s，7-OH)，9.55(1H，s，4'-OH)，8.29(1H，s，H-2)，7.35(2H，d，J＝8.5Hz，H-2'，6')，6.80(2H，d，J＝8.5Hz，H-3'，5')，6.36(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)。与文献数据报道一致，峰3被鉴定为染料木素。

[0122] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。