用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法转让专利
申请号 : CN201910279792.3
文献号 : CN109971880B
文献日 : 2022-11-04
发明人 : 刘海利 , 康越景 , 王诚 , 王利君 , 李风 , 张良君 , 丁德荣 , 鲍晓明
申请人 : 北京大北农生物技术有限公司
摘要 :
本发明涉及一种用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列。本发明玉米植物DBN9508对鳞翅目昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件DBN9508的DNA分子。
权利要求 :
1.一种核酸序列，其特征在于，具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1‑873位中至少11个连续的核苷酸和SEQ ID NO:3或其互补序列第874‑1292位中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1‑553位中至少11个连续的核苷酸和SEQ ID NO:4或其互补序列第554‑1028位中至少11个连续的核苷酸；所述核酸序列源自转基因玉米事件DBN9508，所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1‑873位中22‑25个连续的核苷酸和SEQ ID NO:3或其互补序列第874‑1292位中
22‑25个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1‑553位中22‑25个连续的核苷酸和SEQ ID NO:4或其互补序列第554‑1028位中22‑25个连续的核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。
4.根据权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。
5.根据权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列。
6.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包含权利要求1‑5任一项所述核酸序列；
所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.根据权利要求6所述的检测样品中转基因玉米DBN9508的DNA存在方法，其特征在于，所述目标扩增产物还包含SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
8.根据权利要求6或7所述检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，所述两种引物包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9、或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:
11。
9.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与探针接触，所述探针包含权利要求1‑4任一项所述核酸序列；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况；
所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
10.根据权利要求9所述的检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针还包含SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
11.根据权利要求9或10所述检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
12.一种检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括权利要求1‑4任一项所述核酸序列；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的；
所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
13.根据权利要求12 所述的检测样品中转基因玉米事件DBN9508的DNA存在的方法，其特征在于，所述标记物核酸分子还包含SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
14.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包含权利要求1‑4任一项所述核酸序列，其可以作为对于转基因玉米事件DBN9508或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
15.根据权利要求14所述的DNA检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子还包含SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
16.一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1077‑8015位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列，摄食所述转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述转基因玉米植物。
17.一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤或控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第
1077‑8015位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列，所述转基因玉米植物对草铵膦除草剂具有耐受性。
18.一种培养对昆虫具有抗性和/或耐受草铵膦除草剂的玉米植物的方法，其特征在于，包括：种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1077‑8015位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
使所述玉米种子长成玉米植株；
用靶昆虫侵袭所述玉米植株和/或用有效剂量草铵膦除草剂喷洒所述玉米植株，收获与其他不具有所述特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
19.一种产生对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，包括将第一玉米植物基因组中包含的特定区域的核酸序列 引入第二玉米植物，从而产生大量子代植株；选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株，且所述子代植株对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；所述特定区域的核酸序列依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1077‑8015位和SEQ ID NO：2，或者所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:5。
20.根据权利要求18或19所述的产生对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，其特征在于，所述方法包括将转基因玉米事件DBN9508与缺少昆虫抗性和/或草铵膦耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株；
用靶昆虫侵袭和/或用草铵膦处理所述子代植株；
选择对昆虫具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的所述子代植株；
所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
21.一种产生自转基因玉米事件DBN9508的农产品或商品，其特征在于，所述农产品或商品为玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米穗丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂；所述转基因玉米事件DBN9508以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.17100保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
说明书 :
用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，特别是农业生物技术研究中的转基因农 作物育种领域。具体地，本发明涉及昆虫抗性和草铵膦除草剂耐受性的转基因 玉米事件DBN9508和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件 DBN9508的核酸序列及其检测方法。
背景技术
[0002] 玉米(Zea mays L.)在世界上很多地区都是主要的粮食作物。生物技术 已经应用于玉米以改善其农艺性状和品质。在玉米生产中昆虫抗性是一项重 要的农艺性状，特别是对鳞翅目昆虫的抗性，例如玉米螟、棉铃虫、小地老 虎等。玉米对鳞翅目昆虫的抗性可以通过转基因的方法使鳞翅目昆虫的抗性 基因在玉米植物中表达而获得。另一个重要的农艺性状是除草剂耐受性，如 已有成功的玉米转化事件NK603、GA21等，美国等玉米主要种植区域已广 泛种植。值得一提的是，草铵膦除草剂与草甘膦除草剂的作用机理不同，其 为灭生性的触杀型除草剂，且可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的手段。 玉米对草铵膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草铵膦除草剂耐受型 基因(如pat)在玉米植物中表达而获得。
[0003] 已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于 染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此， 通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因 得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表 达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如 在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模 式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因 此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为 目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和 表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其 他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特 征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种 能很好的适应当地的生长条件。
[0004] 能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是 有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于 重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟 知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反 应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常 用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转 基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种 方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生 的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的 一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含于插入序列的第 一引物和包含于插入序列的第二引物。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检 测方法，转基因玉米事件DBN9508对昆虫具有较好的抗性并对草铵膦除草剂具 有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因 玉米事件DBN9508的DNA分子。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了一种核酸序列，具有SEQ ID NO:3或其互 补序列第1‑873位中至少11个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:3或其互补序列第 874‑1292位中至少11个连续的核苷酸；和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1‑553 位中至少11个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:4或其互补序列第554‑1028位中 至少11个连续的核苷酸。
[0007] 优选地，所述核酸序列具有SEQ ID NO:3或其互补序列第1‑873位中22‑25 个连续的核苷酸、和SEQ ID NO:3或其互补序列第874‑1292位中22‑25个连续 的核苷酸；和/或SEQ ID NO:4或其互补序列第1‑553位中22‑25个连续的核苷 酸、和SEQ ID NO:4或其互补序列第554‑1028位中22‑25个连续的核苷酸。
[0008] 优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2 或其互补序列。
[0009] 所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因玉米事件DBN9508中在插入序列 的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的 5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉 米事件DBN9508的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因玉米事件 DBN9508中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核 苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA 序列和玉米插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补 序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9508的存在。
[0010] 优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4 或其互补序列。
[0011] 本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中T‑DNA 插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或 者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分 的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可 以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:1的所述SEQ ID NO:3的一部 分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引 物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方 法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因玉米 事件DBN9508或其后代的存在。所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因玉米 事件DBN9508中在T‑DNA插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长 度为1292个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由873个核苷酸的 玉米基因组5’侧翼序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第1‑873位)、203个核苷酸的 DBN10707构建体DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸第874‑1076位)和216个 核苷酸的tNos(胭脂碱合成酶)转录终止子的DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷 酸第1077‑1292位)组成，包含所述SEQ ID NO:3或其互补序列即可鉴定为转 基因玉米事件DBN9508的存在。
[0012] 所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中T‑DNA插入序列的 任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个 或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于 或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三 核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产 生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的 扩增产物是包括SEQ ID NO:2的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件 DBN9508或其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件 DBN9508中在插入序列的3’末端位于T‑DNA插入接合部位附近的一个长度为 1028个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:
4或其互补序列由271个核苷酸的pr35S 转录起始序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第1‑271位)、
282个核苷酸的DBN10707 构建体DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第272‑553位)和475个核苷酸的玉 米基因组3’侧翼序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第554‑1028位)组成，包含所述 SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9508的存在。
4或其互补序列由271个核苷酸的pr35S 转录起始序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第1‑271位)、
282个核苷酸的DBN10707 构建体DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第272‑553位)和475个核苷酸的玉 米基因组3’侧翼序列(SEQ ID NO:4的核苷酸第554‑1028位)组成，包含所述 SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9508的存在。
[0013] 进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5或其互补序列。
[0014] 所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因玉米事件DBN9508的长度为 8772个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述 SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件DBN9508的存在。
[0015] 表1、SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件
[0016]
[0017] 本领域技术人员熟知的，第一、第二、第三和第四核酸序列不必仅仅由DNA 组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作 为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探 针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22 个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约 21个到大约50个或更多的连续核苷酸。
2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约 21个到大约50个或更多的连续核苷酸。
[0018] 所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增方法中以产生扩增子，所述扩 增子用于检测生物样品中转基因玉米事件DBN9508或其后代的存在；所述核酸 序列或其互补序列可用于核苷酸检测方法中，以检测生物样品中转基因玉米事 件DBN9508或其后代的存在。
[0019] 为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件 DBN9508的DNA存在的方法，包括：
[0020] 使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
[0021] 进行核酸扩增反应；和
[0022] 检测所述目标扩增产物的存在；
[0023] 所述目标扩增产物包含所述核酸序列。
[0024] 优选地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2 或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
[0025] 具体地，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10；所述第二引物选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件 DBN9508的DNA存在的方法，包括：
[0027] 使待检测样品与探针接触，所述探针包含所述核酸序列；
[0028] 使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
[0029] 检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
[0030] 所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠) 溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各 洗膜1次。
[0031] 优选地，所述探针包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互 补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
[0032] 可选地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
[0033] 为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因玉米事件 DBN9508的DNA存在的方法，包括：
[0034] 使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括所述核 酸序列；
[0035] 使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；
[0036] 检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物 辅助育种分析以确定昆虫抗性和/或除草剂耐受性与标记物核酸分子在遗传 学上是连锁的。
[0037] 优选地，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其 互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、和/或SEQ ID NO:6‑11或其互补序列。
[0038] 为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一个 DNA分子，所述DNA分子包含所述核酸序列，其可以作为对于转基因玉米事 件DBN9508或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针。
[0039] 优选地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2 或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和/或SEQ ID NO:7或其互补序列。
[0040] 为实现上述目的，本发明还提供了一种植物细胞，包含编码昆虫抗性 Vip3Aa蛋白的核酸序列、编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列和特 定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示的序列。
[0041] 优选地，所述植物细胞包含编码昆虫抗性Vip3Aa蛋白的核酸序列、编码 草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定 区域的核酸序列包括SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
[0042] 优选地，所述植物细胞依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1077‑8015 位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列。
[0043] 为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免于昆虫侵袭的方法， 包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种转基因玉米植物细胞，所述转基因玉米植物 细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，摄食所述 转基因玉米植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述转基因玉米植物。
[0044] 优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或 SEQ ID NO:4所示的序列。
[0045] 优选地，所述转基因玉米植物细胞在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:5第1077‑8015位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5。
[0046] 为实现上述目的，本发明还提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的 损伤或控制种植玉米植物的大田中杂草的方法，包括将含有有效剂量草铵膦除 草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在 其基因组中包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列，所述转基因玉 米植物对草铵膦除草剂具有耐受性。
[0047] 优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
[0048] 优选地，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1077‑8015位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者包含SEQ ID NO:5所示的序列。
[0049] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对昆虫具有抗性和/或耐受草 铵膦除草剂的玉米植物的方法，包括：
[0050] 种植至少一粒玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含编码昆虫抗性Vip3Aa 蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦除草剂耐受性PAT蛋白的核酸序列、和特定区域 的核酸序列，或者所述玉米种子的基因组中包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
[0051] 使所述玉米种子长成玉米植株；
[0052] 用靶昆虫侵袭所述玉米植株和/或用有效剂量草铵膦除草剂喷洒所述玉米植株， 收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
[0053] 所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优 选地，所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
[0054] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对昆虫具有抗性和/或对草铵膦 除草剂具有耐受性的玉米植株的方法，包括将第一玉米植物基因组中包含的 编码昆虫抗性Vip3Aa蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核 酸序列、和特定区域的核酸序列，或者将所述第一玉米植物基因组中包含的 SEQ ID NO:5所示的核酸序列，引入第二玉米植物，从而产生大量子代植株； 选择具有所述特定区域的核酸序列的所述子代植株，且所述子代植株对昆虫 具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；所述特定区域的核酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列 为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
[0055] 优选地，所述方法包括将转基因玉米事件DBN9508与缺少昆虫抗性和/或 草铵膦耐受性的玉米植株进行有性杂交，从而产生大量子代植株，选择具有所 述特定区域的核酸序列的所述子代植株；所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；优选地，所述特定区域的核酸序列 包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列。
[0056] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生自转基因玉米事件DBN9508 的农产品或商品，所述农产品或商品为玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米穗 丝、玉米淀粉、玉米面筋、玉米饼、化妆品或填充剂。
[0057] 在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法 可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说 明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。
[0058] 所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有 植物品种，包括野生玉米种。
[0059] 所述“包含”、“包含”或“含有”是指“包括但不限于”。
[0060] 术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物 可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps) 和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种 子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的 转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以 及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的 并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。
[0061] 术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列 (5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是 指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任 何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因， 所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生 物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基 因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因” 是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的 位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。
[0062] “侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过 程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包 括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼DNA”亦称“侧翼区”或“侧翼 序列”或“侧翼基因组序列”或“侧翼基因组DNA”，是指至少3、5、10、11、15、 20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序 列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分 子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“3’侧翼”或“右边界侧翼”等。当 该侧翼区位于上游时，其也可以称为“5’侧翼”或“左边界侧翼”等。
[0063] 引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所 述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入 植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组 DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接 合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧 翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰 自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合区域”或“接合序列”是指 包含接合点的DNA。
[0064] 本发明提供了称为DBN9508的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米 事件DBN9508亦称为玉米植物DBN9508，其包括转基因玉米事件DBN9508的 植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件DBN9508的植 物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳 穗、叶和来自玉米植物DBN9508的产物，例如玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉 米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。
[0065] 本发明转基因玉米事件DBN9508包含了一个DNA构建体，当其在植物细 胞内表达时，所述转基因玉米事件DBN9508获得对昆虫的抗性和对草铵膦除草 剂的耐受性。所述DNA构建体包含两个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于 在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可 操作地连接Vip3Aa19蛋白的核酸序列，所述Vip3Aa19蛋白的核酸序列主要对 鳞翅目昆虫具有抗性。第二个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和 适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素N‑乙酰 基转移酶(phosphinothricin N‑acetyltransferase，PAT)的基因，所述PAT蛋白 的核酸序列对草铵膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物 分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，所述适合启 动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV) 35S启动子、泛素蛋白(Ubiquitin)启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、土壤农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)启动子、章鱼碱合成 酶(OCS)启动子、夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储 藏蛋白(Patatin)启动子、核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)启动子、 谷胱甘肽硫转移酶(GST)启动子、E9启动子、GOS启动子、alcA/alcR启动子、 毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)RolD启动子和拟南芥属(Arabidopsis thaliana)Suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适 合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来 源于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多 聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、来源于蛋 白酶抑制剂Ⅱ(PINⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α‑微管蛋白 (α‑tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
[0066] 此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限 于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以加强基因的表达水平，所述增强 子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活因子、CaMV35S增强子和 FMV35S增强子。所述信号肽/转运肽可以引导Vip3Aa19蛋白和/或PAT蛋白转 运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序 列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网。
[0067] 所述Vip3Aa19基因可以是从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称 Bt)中分离得到的，且可以通过优化密码子或者以其它方式改变Vip3Aa19基因 的核苷酸序列，以达到增加转化细胞中转录物的稳定性和可利用性的目的。
[0068] 所述“鳞翅目(Lepidoptera)”，包括蛾、蝶两类昆虫，是农林害虫最多的 一个目，如小地老虎、棉铃虫、斜纹夜蛾、二点委夜蛾、桃蛀螟等。
[0069] 所述膦丝菌素N‑乙酰基转移酶(PAT)基因可以是从链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)菌株分离的酶，通过乙酰化催化L‑膦丝菌素转化为其无活性 形式，以赋予植物对草铵膦除草剂的耐受性。Phosphinothricin(PTC，2‑氨基‑4‑ 甲膦酰丁酸)是谷氨酰胺合成酶的抑制剂。PTC是抗生素2‑氨基‑4‑甲膦酰‑丙氨 酰‑丙氨酸的结构单位，此三肽(PTT)具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以 及抗真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的活性。膦丝菌素N‑乙酰基转移酶(PAT) 基因也可以作为选择性标记基因。
[0070] 所述“草铵膦”又名草丁膦，是指2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，用 “草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。 为了达到有效生物学剂量而对某种草铵膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技 术人员的技能。使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂处理包含了来源于转基 因玉米事件DBN9508的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且 不影响来源于转基因玉米事件DBN9508的植物材料的生长或产量。
[0071] 所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限 于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
[0072] 所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源 DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T‑DNA区。所述载体被转化 到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的 载体的所述T‑DNA区被插入到植物基因组中。
[0073] 所述基因枪转化法即为用包含外源DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的 生物弹击转化)。
[0074] 所述花粉管通道转化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又 名花粉管引导组织)，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊。
[0075] 转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选 择具有外源DNA的后代。
[0076] DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个 表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限 制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元 件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA 分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因 元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒 被设计为最优选地在植物细胞内表达。
[0077] 转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括 至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以 产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定 植株。术语“事件”是指含有异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语 “事件”还指原始转化体和含有异源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而 得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于原始转化体亲本的插入 DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件” 还指来自原始转化体的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA 紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有 插入DNA的亲本系(例如原始转化体和其自交产生的子代)与不含有插入DNA 的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。
[0078] 本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预 产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA 分子和/或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其它情 况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操 作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。
[0079] 术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植 物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这 样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代 个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生 事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机 异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。
[0080] 本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组 合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种 分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。
[0081] 培养对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的转基因玉米 事件DBN9508，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物 有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育 自转基因玉米事件DBN9508及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件 DBN9508及其后代是通过利用本发明的对鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除 草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对鳞翅目 昆虫的抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性；然后选择对鳞翅目昆虫的侵袭 具有抗性和/或对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对鳞翅目 昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步 包括使鳞翅目昆虫抗性和/或草铵膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或 第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用鳞翅目昆虫侵袭、草铵膦除草剂施加 或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件DBN9508中插入序列 的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对 鳞翅目昆虫具有抗性且对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。
[0082] 还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以交配以产生含有两个独立的、 分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基 因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植 物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。
[0083] 术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或 报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标 核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件DBN9508 基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件 DBN9508或种子还是来源于转基因玉米事件DBN9508的植物或种子或提取物。 本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA 序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。
[0084] 术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的 目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA 聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列 扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
[0085] 探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸 或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。 这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于 目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设 计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有 完全的DNA序列同一性。
[0086] 基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法 确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件DBN9508的植物材料中分离相应的 DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序 列和玉米基因组侧翼序列，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。
[0087] 本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的 核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件DBN9508 的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异 性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构， 就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示 出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如 本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核 苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子 能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退 火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个 核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件 下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏 离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一 个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以 使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0088] 如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严 格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA 杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人 员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0× SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条 件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条 件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。 优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和 约65℃下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或 者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在 高度严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序 列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸 分子具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补 序列，或者上述序列的任一片段。本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述 序列的任一片段具有80％到100％或90％到
100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以用作植物育种方法中的标记物 以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领 域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射 性标记、抗体类标记和化学发光标记。
100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以用作植物育种方法中的标记物 以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领 域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射 性标记、抗体类标记和化学发光标记。
[0089] 关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)， “严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交 的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够 与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。
[0090] 术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与 包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。
[0091] 如本发明使用的，“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核 酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件DBN9508 通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件 DBN9508，或玉米提取物，例如粗粉、面或油是否包含转基因玉米事件DBN9508， 从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法 以产生对于转基因玉米事件DBN9508的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引 物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列 的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列， 所述序列对所述转基因玉米事件DBN9508也是诊断性的。扩增子的长度范围可以 是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约50个核苷酸碱基对，更 优选加上约250个核苷酸碱基对，最优选加上约450个核苷酸碱基对或更多。
[0092] 可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括 整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以 位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约 两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中 形成的引物二聚体。
[0093] 核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包 括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。 PCR扩增方法已经发展到可扩增多达22kb的基因组DNA和多达42kb的噬菌 体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的 外源DNA序列和来自转基因玉米事件DBN9508的侧翼DNA序列可以通过利 用所提供的引物序列对转基因玉米事件DBN9508的基因组进行扩增，扩增后对 PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。
[0094] 基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有用作引物的DNA分子，它们 在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可 提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多 方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的玉米基因组的任何部分同源或互 补的、以及与SEQ ID NO:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物 的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是 SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其扩增与转基因玉米事件DBN9508的5’转基因 /基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:1。用作 DNA引物的其它DNA分子可选自SEQ ID NO:5。
[0095] 这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是遗 传点分析(Genetic Bit Analysis)，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相 邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微 孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基 因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交， 并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预 期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代 表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
[0096] 另一种方法是焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)。该方法设计了一个跨越 插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链 和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用 一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷 酸腺苷双磷酸酶、腺苷‑5’‑磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs， 测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、 和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。
[0097] Chen等(基因组研究(Genome Res.)9:492‑498，1999)描述的荧光偏振现 象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法。使用这种方法需要设计一个跨 越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸 链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使 用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起 进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏 振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱 基延伸反应是成功的。
[0098] Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制 造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要说明如下，设计一个跨越插入DNA 序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR 引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚 合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光 部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼 序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
[0099] 基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件DBN9508的植物材料的适合 技术还可以包括Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交(Northern blot)和原位杂交(in situ hybridization)。特别地，所述适合技术包括温育探针和 样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决 于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探 针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。
[0100] Tyangi等(自然生物技术(Nature Biotech.)14:303‑308，1996)介绍了分 子标记在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相 邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致 其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该 FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个 引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增， FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭 部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列 的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
[0101] 其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样 品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA 分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管 (nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。
[0102] 可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发 DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件 DBN9508的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件DBN9508的DNA的 玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或 互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA 扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在图1 和表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的DNA结构包含：位于 转基因插入序列5’末端的玉米植物DBN9508侧翼基因组区域，来自农杆菌的左 侧边界区域(LB)的一部分插入序列，第一个表达盒由含有玉米泛素基因1启 动子(prZmUbi1)，可操作地连接到链霉菌的草铵膦耐受性的膦丝菌素N‑乙酰 基转移酶(cPAT)上，并可操作地连接到胭脂碱合酶的转录终止子(tNos)上 而组成，第二个表达盒由含有增强子区域的串联重复的花椰菜花叶病毒35S启 动子(pr35S)，可操作地连接到玉米热休克70kDa蛋白内含子(iZmHSP70) 上，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的Vip3Aa19蛋白(cVip3Aa19) 上，并可操作地连接到胭脂碱合酶的转录终止子(tNos)上而组成，来自农杆菌 的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的 玉米植物DBN9508侧翼基因组区域(SEQ ID NO:5)。在DNA扩增方法中， 作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件DBN9508中转基因插入序 列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件DBN9508的玉米基因组侧翼 DNA序列的任何部分。
[0103] 转基因玉米事件DBN9508可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如 草甘膦、麦草畏等)耐受性的转基因玉米品种，或携带其他抗虫基因的转基因 玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件 DBN9508一起育种，可以提供抗多种虫害并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉 米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量 提升等更优异的特征。
[0104] 本发明转基因玉米事件DBN9508是对鳞翅目害虫的摄食损伤有抗性的，并 且耐受含草铵膦的农业除草剂的植物毒性作用。该双重性状的玉米植株表达苏 云金芽孢杆菌的Vip3Aa19蛋白，其提供了对鳞翅目害虫(如小地老虎)摄食 损伤的抗性，并表达链霉菌的草铵膦抗性的膦丝菌素N‑乙酰基转移酶(PAT) 蛋白，其赋予植物对草铵膦的耐受性。双重性状玉米具有如下优点：1)免受 由于鳞翅目害虫(如小地老虎、棉铃虫等)造成的经济损失，小地老虎、棉铃 虫等是玉米种植区的主要害虫；2)施加含草铵膦的农业除草剂给玉米作物用 于广谱杂草控制的能力；3)玉米产量没有降低。此外，编码昆虫抗性和草铵 膦耐受性性状的转基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于转基因玉米事件 DBN9508基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用 分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明检测方法 中SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或 其互补序列、或者SEQ ID NO:7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生 诊断为转基因玉米事件DBN9508或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳 定的鉴定出来源于转基因玉米事件DBN9508的植物材料的存在。
[0105] 序列简述
[0106] SEQ ID NO:1 转基因玉米事件DBN9508中在插入序列5’末端位于插入接合部 位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1‑11位核苷酸 和第12‑22为核苷酸分别位于玉米基因组上插入位点的两侧；
[0107] SEQ ID NO:2 转基因玉米事件DBN9508中在插入序列3’末端位于插入接合部 位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1‑11位核苷酸 和第12‑22为核苷酸分别位于玉米基因组上插入位点的两侧；
[0108] SEQ ID NO:3 转基因玉米事件DBN9508中在插入序列的5’末端位于插入接 合部位附近的一个长度为1292个核苷酸的序列；
[0109] SEQ ID NO:4 转基因玉米事件DBN9508中在插入序列的3’末端位于插入接 合部位附近的一个长度为1028个核苷酸的序列；
[0110] SEQ ID NO:5 整个T‑DNA序列、5’和3’末端的玉米基因组侧翼序列；
[0111] SEQ ID NO:6 位于SEQ ID NO:3上的序列，跨越了左侧边界区域(LB)和tNos 转录终止序列；
[0112] SEQ ID NO:7 位于SEQ ID NO:4上的序列，跨越了pr35S转录起始序列和右 侧边界区域(RB)；
[0113] SEQ ID NO:8 扩增SEQ ID NO:3的第一引物；
[0114] SEQ ID NO:9 扩增SEQ ID NO:3的第二引物；
[0115] SEQ ID NO:10 扩增SEQ ID NO:4的第一引物；
[0116] SEQ ID NO:11 扩增SEQ ID NO:4的第二引物；
[0117] SEQ ID NO:12 5’侧翼基因组序列上的引物；
[0118] SEQ ID NO:13 与SEQ ID NO:12配对的位于T‑DNA上的引物；
[0119] SEQ ID NO:14 3’侧翼基因组序列上的引物，其与SEQ ID NO:12配对可以检测 转基因是纯合子或是杂合子；
[0120] SEQ ID NO:15 与SEQ ID NO:14配对的位于T‑DNA上的引物；
[0121] SEQ ID NO:16 Taqman检测Vip3Aa19基因的第一引物；
[0122] SEQ ID NO:17 Taqman检测Vip3Aa19基因的第二引物；
[0123] SEQ ID NO:18 Taqman检测Vip3Aa19基因的探针；
[0124] SEQ ID NO:19 Taqman检测pat基因的第一引物；
[0125] SEQ ID NO:20 Taqman检测pat基因的第二引物；
[0126] SEQ ID NO:21 Taqman检测pat基因的探针；
[0127] SEQ ID NO:22 玉米内源基因SSIIb的第一引物；
[0128] SEQ ID NO:23 玉米内源基因SSIIb的第二引物；
[0129] SEQ ID NO:24 Southern杂交检测中Vip3Aa19基因的探针；
[0130] SEQ ID NO:25 Southern杂交检测中pat基因的探针；
[0131] SEQ ID NO:26 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向一致；
[0132] SEQ ID NO:27 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得 侧翼序列；
[0133] SEQ ID NO:28 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得 侧翼序列；
[0134] SEQ ID NO:29 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向一致；
[0135] SEQ ID NO:30 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得 侧翼序列；
[0136] SEQ ID NO:31 位于T‑DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得 侧翼序列。
[0137] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0138] 图1为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的转基 因插入序列与玉米基因组接合部位的结构示意图，以及用于检测玉米植物 DBN9508的核酸序列相对位置的示意图(相对位置示意图参考B73RefGen v3)；
[0139] 图2为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的重组 表达载体DBN10707的结构示意图；
[0140] 图3为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的转基 因玉米事件DBN9508在小地老虎自然发生条件下的田间效果图；
[0141] 图4为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的转基 因玉米事件DBN9508接种棉铃虫的田间效果图；
[0142] 图5为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的转基 因玉米事件DBN9508在斜纹夜蛾自然发生条件下的田间效果图；
[0143] 图6为本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸序列及其检测方法的转基 因玉米事件DBN9508在甜菜夜蛾自然发生条件下的田间效果图。
具体实施方式
[0144] 下面通过具体实施例进一步说明本发明用于检测玉米植物DBN9508的核酸 序列及其检测方法的技术方案。
[0145] 第一实施例、克隆与转化
[0146] 1.1、载体克隆
[0147] 使用标准基因克隆技术构建重组表达载体DBN10707(如图2所示)。所述载 体DBN10707包含两个串联的转基因表达盒，第一个表达盒由含有增强子区域的 串联重复的花椰菜花叶病毒35S启动子(pr35S)，可操作地连接到玉米热休克70 kDa蛋白内含子(iZmHSP70)上，可操作地连接到苏云金芽孢杆菌的昆虫抗性的 Vip3Aa19蛋白(cVip3Aa19)上，并可操作地连接到胭脂碱合酶的转录终止子(tNos) 上而组成；第二个表达盒由含有玉米泛素基因1启动子(prZmUbi1)，可操作地 连接到链霉菌的草铵膦耐受性的膦丝菌素N‑乙酰基转移酶(cPAT)上，并可操作 地连接到胭脂碱合酶的转录终止子(tNos)上而组成。
[0148] 将所述载体DBN10707用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen， Chicago，USA；Cat.No：18313‑015)中，并且以4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑DL‑高 丙氨酸为选择标记对转化细胞进行筛选。
[0149] 1.2、植物转化
[0150] 采用常规的农杆菌侵染法进行转化，将无菌培养的玉米幼胚与本实施例1.1 中所述的农杆菌共培养，以将构建的重组表达载体DBN10707中的T‑DNA转入 到玉米染色体组中，以产生转基因玉米事件DBN9508。
[0151] 对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农 杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将Vip3Aa19基因的核苷酸序列和pat基 因的核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)，在此步 骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660＝0.4‑0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、 MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)1mg/L，pH 5.3))中以启动接种。幼胚 与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，幼胚在侵 染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖 20g/L、葡萄糖10g/L、AS 100mg/L、2,4‑D 1mg/L、琼脂8g/L，pH 5.8)上培 养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤 中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、 2,4‑D 1mg/L、头孢霉素250mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)中至少存在一种己 知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素150‑250mg/L)，不添加植物转化体的 选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培 养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含 选择剂(4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑DL‑高丙氨酸)的培养基上培养并选择生长着的 转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养 基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、头孢霉素250mg/L、 4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑DL‑高丙氨酸10mg/L、2,4‑D 1mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤 5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基 (MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
[0152] 筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS 维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6‑苄基腺嘌呤2mg/L、头孢霉素250mg/L、 4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑DL‑高丙氨酸5mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上，温度 25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、 MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、头孢霉素250mg/L、吲哚‑3‑乙酸1 mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8)上，温度25℃下培养至约10cm高，移至温室 培养至结实。在温室中，每天于温度28℃下培养16h，再于温度20℃下培养8h。
[0153] 1.3、转基因事件的鉴定和筛选
[0154] 一共产生200个独立转基因T0单株。
[0155] 由于遗传转化、基因插入等均可能对玉米植株造成农艺性状上的影响(例 如矮粗、叶片丛生、花叶、叶片对生、吐丝散粉异常或结实差等)，因此将 上述200个独立的转基因T0单株送入温室移栽并进行培养，以鉴定转基因 T0单株在不同时期(苗期‑拔节期、拔节期‑散粉期和灌浆期‑成熟期)的农艺 性状表现，共获得136个农艺性状表现正常的转基因T0单株。
[0156] 通过TaqManTM分析检测上述136个转基因玉米植株是否存在单拷贝的 Vip3Aa19和pat基因，且不含载体骨架序列，共获得83个转基因T0单株；通 过转基因插入位点分析，共筛选到28个T‑DNA两侧序列完整、T‑DNA没有插 入到玉米基因组的重要基因中、基因插入没有产生新的开放阅读框(ORF)的 转基因T0单株；通过对主要靶标昆虫(如小地老虎、棉铃虫、斜纹夜蛾或甜菜 夜蛾)的抗性评价和比较，共筛选到13个昆虫抗性良好的转基因T0单株；通 过对草铵膦除草剂耐受性的评价和比较，共筛选到12个草铵膦除草剂耐受性良 好的转基因T0单株；在不同世代、不同地理环境和/或不同背景材料的情况下， 通过对转基因玉米植株的农艺性状、分子生物学、靶标昆虫抗性、草铵膦耐受 性等是否可稳定遗传进行筛选，选定了转基因玉米事件DBN9508是优异的，其 具有单拷贝转基因(参见第二实施例)、良好的昆虫抗性、草铵膦除草剂耐受 性和农艺性状表现(参见第五实施例和第六实施例)。
[0157] 第二实施例、用TaqMan进行转基因玉米事件DBN9508检测
[0158] 取转基因玉米事件DBN9508的叶片约100mg作为样品，用植物DNA提取 试剂盒(DNeasy Plant Maxi Kit,Qiagen)提取其基因组DNA，通过Taqman探 针荧光定量PCR方法检测Vip3Aa19基因和pat基因的拷贝数。同时以野生型玉 米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0159] 具体方法如下：
[0160] 步骤1、取转基因玉米事件DBN9508的叶片(授粉后)100mg，在研钵中 用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0161] 步骤2、使用植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Maxi Kit,Qiagen)提取 上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
[0162] 步骤3、用超微量分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Scientific)测定上 述样品的基因组DNA浓度；
[0163] 步骤4、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范 围为80‑100ng/μL；
[0164] 步骤5、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴 定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样 品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
[0165] 以下引物和探针用来检测Vip3Aa19基因序列：
[0166] 引物1：cgaatacagaaccctgtcggc如序列表中SEQ ID NO:16所示；
[0167] 引物2：cgtgaggaaggtctcagaaatgac如序列表中SEQ ID NO:17所示；
[0168] 探针1：cgacgatggcgtgtatatgcctcttgg如序列表中SEQ ID NO:18所示；
[0169] 以下引物和探针用来检测pat基因序列：
[0170] 引物3：gagggtgttgtggctggtattg如序列表中SEQ ID NO:19所示；
[0171] 引物4：tctcaactgtccaatcgtaagcg如序列表中SEQ ID NO:20所示；
[0172] 探针2：cttacgctgggccctggaaggctag如序列表中SEQ ID NO:21所示；
[0173] PCR反应体系为：
[0174]
[0175] 所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓 度的探针50μL和860μL 1×TE缓冲液(10mM Tris‑HCl、1mM EDTA， pH8.0)，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
[0176] PCR反应条件为：
[0177]
[0178] 利用快速实时荧光定量PCR系统软件(Applied Biosystems 7900HT Fast Real‑Time PCR System SDS v2.3，Applied Biosystems)分析数据，结果表明获得 的转基因玉米事件DBN9508为单拷贝。
[0179] 第三实施例、分析转基因玉米事件DBN9508的插入位点
[0180] 3.1、基因组DNA提取
[0181] DNA提取按照常规采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法：取2g转 基因玉米事件DBN9508的幼嫩叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.5mL于温度 65℃预热的DNA提取CTAB缓冲液(20g/L CTAB、1.4M NaCl、100mM Tris‑HCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用NaOH调pH至8.0)，充分混匀后， 于温度65℃抽提90min；加入0.5倍体积苯酚和0.5倍体积氯仿，颠倒混匀；12000 rpm(每分钟转数)转速下离心10min；吸取上清液，加入2倍体积无水乙醇， 轻柔晃动离心管，于温度4℃静置30min；12000rpm转速下再离心10min；收 集DNA到管底；弃上清液，用1mL质量浓度为70％的乙醇，洗涤沉淀；12000 rpm转速下离心5min；真空抽干或在超净台吹干；DNA沉淀溶解于适量的TE 缓冲液中，保存在温度‑20℃条件下。
[0182] 3.2、侧翼DNA序列的分析
[0183] 对上述提取的DNA样品进行浓度测定，使待测样品的浓度位于80‑100 ng/μL之间。用限制性内切酶Kpn I(5’端分析)和Spe I(3’端分析)分别酶 切基因组DNA。每个酶切体系中加入26.5μL基因组DNA，0.5μL上述限制 性内切酶以及3μL酶切缓冲液(采用的限制性酶均是NEB公司的酶及其配 套的缓冲液或通用缓冲液，现称NEBCutSmart)，酶切1h。待酶切结束后， 向酶切体系中加入70μL无水乙醇，冰浴30min，12000rpm转速下离心7min， 弃上清，吹干，之后加入8.5μL双蒸水、1μL 10×T4‑DNA连接酶缓冲液(NEB T4DNA Ligase Reaction Buffer，其具体配方可访问NEB网站或参考 https://www.neb.com/products/
restriction‑endonucleases、 https://www.neb.com/products/b0202‑t4‑dna‑ligase‑reaction‑buffer)以及0.5μL T4‑DNA连接酶在温度4℃连接过夜。用一系列嵌套引物进行PCR扩增分离5’端 和3’端基因组DNA。具体的，分离5’端基因组DNA的引物组合包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:26作为第一引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28作为第 二引物，SEQ ID NO:13作为测序引物。分离3’端基因组DNA引物组合包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:29作为第一引物，SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31作为 第二引物，SEQ ID NO:15作为测序引物，PCR反应条件如表3所示。
restriction‑endonucleases、 https://www.neb.com/products/b0202‑t4‑dna‑ligase‑reaction‑buffer)以及0.5μL T4‑DNA连接酶在温度4℃连接过夜。用一系列嵌套引物进行PCR扩增分离5’端 和3’端基因组DNA。具体的，分离5’端基因组DNA的引物组合包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:26作为第一引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28作为第 二引物，SEQ ID NO:13作为测序引物。分离3’端基因组DNA引物组合包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:29作为第一引物，SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31作为 第二引物，SEQ ID NO:15作为测序引物，PCR反应条件如表3所示。
[0184] 上述PCR扩增反应所获得的扩增产物在质量分数为2.0％琼脂糖凝胶上电泳 以分离PCR扩增产物，随后使用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,目 录#_28704,Qiagen Inc.,Valencia,CA)从琼脂糖基质分离目的片段。然后对纯化 的PCR扩增产物测序(例如，使用ABI PrismTM 377,PE Biosystems，Foster City, CA)并分析(例如,使用DNASTAR序列分析软件,DNASTAR Inc.,Madison,WI)。
[0185] 使用标准PCR方法确认5’和3’侧翼序列和接合序列。5’侧翼序列和接合序 列可使用SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12，组合SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13 或SEQ ID NO:26来确认。3’侧翼序列和接合序列可使用SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14，组合SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:29来确认。PCR 反应体系和扩增条件如表2和表3所示。本领域技术人员将理解，其它引物序 列也可用于确认侧翼序列和接合序列。
[0186] PCR扩增产物的DNA测序提供了可以用于设计其他DNA分子的DNA，所 述其他DNA分子作为引物和探针可用于鉴定来源于转基因玉米事件DBN9508 的玉米植物或种子。
[0187] 发现在SEQ ID NO:5的核苷酸第1‑873位显示的为玉米基因组序列在转基 因玉米事件DBN9508插入序列的左边界侧翼(5’侧翼序列)，在SEQ ID NO:5 的核苷酸第8298‑8772位显示的为玉米基因组序列在转基因玉米事件DBN9508 插入序列的右边界侧翼(3’侧翼序列)。5’接合序列在SEQ ID NO:1中列出，3’ 接合序列在SEQ ID NO:2中列出。
[0188] 3.3、PCR接合性测定
[0189] 接合序列是相对短的多核苷酸分子，其是新的DNA序列，当在多核酸检测 分析中检测到时对于转基因玉米事件DBN9508的DNA是诊断性的。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的接合序列为转基因玉米事件DBN9508中转基因片段 的插入位点和玉米基因组DNA的每一侧的11个多核苷酸。更长或更短的多核 苷酸接合序列可以从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中选择。接合序列(5’连接 区域SEQ ID NO:1，和3’连接区域SEQ ID NO:2)作为DNA探针或作为DNA 引物分子在DNA检测方法中是有用的。接合序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7 也是转基因玉米事件DBN9508中新的DNA序列，其也可以作为DNA探针或 作为DNA引物分子检测转基因玉米事件DBN9508DNA的存在。所述SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:3的核苷酸902‑1100位)跨越了DBN10707构建体DNA序 列和tNos转录终止序列，所述SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:4的核苷酸257‑456 位)跨越了pr35S转录起始序列和DBN10707构建体DNA序列。
[0190] 此外，通过使用来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少一个引物来产生扩增 子，所述引物用于PCR方法中时产生转基因玉米事件DBN9508的诊断性扩增子。
[0191] 具体地，从转基因插入序列的5’端产生PCR扩增产物，该PCR扩增产物为 包含来源于转基因玉米事件DBN9508的植物材料的基因组中侧翼于T‑DNA插 入序列的5’端的基因组DNA的一部分。这个PCR扩增产物包含SEQ ID NO:3。 为了进行PCR扩增，设计与侧翼于转基因插入序列的5’端的基因组DNA序列 杂交的引物5(SEQ ID NO:8)，和与之配对的位于T‑DNA插入序列中tNos转 录终止序列的引物6(SEQ ID NO:9)。
[0192] 从转基因插入序列的3’端产生PCR扩增产物，该PCR扩增产物包含来源于 转基因玉米事件DBN9508的植物材料的基因组中侧翼于T‑DNA插入序列的3’ 端的基因组DNA的一部分。这个PCR扩增产物包含SEQ ID NO:4。为了进行 PCR扩增，设计位于T‑DNA插入序列中pr35S转录起始序列的引物7(SEQ ID NO:10)，和与之配对的与侧翼于转基因插入序列的3’末端的基因组DNA序列 杂交的引物8(SEQ ID NO:11)。
[0193] 表2和表3中说明的DNA扩增条件可以用于上述PCR接合性试验以产生 转基因玉米事件DBN9508的诊断性扩增子。扩增子的检测可以通过使用 Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin‑Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪等进行，或通过本领域技术人员已知的方法和设备进行。
[0194] 表2、用于转基因玉米事件DBN9508的5’端转基因插入物/基因组接合区域 鉴定的PCR步骤和反应混合物条件
[0195]
[0196]
[0197] 表3、热循环仪扩增条件
[0198]
[0199] 轻轻地混合，如果热循环仪上没有保温帽，可以在每个反应液上方添加1‑2滴 矿物油。使用表3中的循环参数在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、 MJ Engine(MJ R‑Biorad，Hercules，CA)、Perkin‑Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston， MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)热循环 仪上进行PCR反应。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪应当在 计算的模式下运行。Perkin‑Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速度(ramp speed) 设定为最大值。
[0200] 实验结果表明：引物5和6(SEQ ID NO:8和9)，当其用在转基因玉米事件 DBN9508基因组DNA的PCR反应中时，产生1292bp片段的扩增产物，当其用在 未转化玉米基因组DNA和非DBN9508玉米基因组DNA的PCR反应中时，没有片 段被扩增；引物7和8(SEQ ID NO:10和11)，当其用在转基因玉米事件DBN9508 基因组DNA的PCR反应中时，产生1028bp片段的扩增产物，当其用在未转化玉 米基因组DNA和非DBN9508玉米基因组DNA的PCR反应中时，没有片段被扩增。
[0201] PCR接合性测定还可用于鉴定来源于转基因玉米事件DBN9508的材料是纯 合子或是杂合子。将引物9(SEQ ID NO:12)、引物10(SEQ ID NO:13)和引 物11(SEQ ID NO:14)用于扩增反应以产生转基因玉米事件DBN9508的诊断 性扩增子。表4和表5中说明的DNA扩增条件可以用于上述接合性试验以产生 转基因玉米事件DBN9508的诊断性扩增子。
[0202] 表4、接合性测定反应液
[0203]
[0204] 表5、接合性测定的热循环仪扩增条件
[0205]
[0206] 使用表5中的循环参数在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、 MJ Engine(MJ R‑Biorad，Hercules，CA)、Perkin‑Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany) 热循环仪上进行PCR反应。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循 环仪应当在计算的模式下运行。Perkin‑Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速度 (ramp speed)设定为最大值。
[0207] 在所述扩增反应中，含有模板DNA的生物样品含有诊断该样品中转基因玉 米事件DBN9508的存在情况的DNA。或者扩增反应将由含有来源于玉米基因 组的DNA的生物样品产生两个不同的DNA扩增子，所述来源于玉米基因组的 DNA相对于转基因玉米事件DBN9508中存在的插入DNA对应的等位基因是杂 合的。这两个不同的扩增子将对应于来源于野生型玉米基因组基因座的第一扩 增子(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14)和诊断转基因玉米事件DBN9508DNA 的存在情况的第二扩增子(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)。仅产生对应于针 对杂合基因组描述的第二扩增子的单个扩增子的玉米DNA样品，可诊断确定该 样品中转基因玉米事件DBN9508的存在，且该样品由相对于转基因玉米植物 DBN9508中存在的插入DNA对应的等位基因为纯合的玉米种子所产生。
[0208] 需要说明的是，转基因玉米事件DBN9508的引物对被用于产生对转基因玉 米事件DBN9508基因组DNA为诊断性的扩增子。这些引物对包括但不限于， 引物5和6(SEQ ID NO:8和9)，和引物7和8(SEQ ID NO:10和11)，用于 所述的DNA扩增方法中。另外，用于扩增玉米内源基因的一个对照引物12和 13(SEQ ID NO:22和23)被包括在内，其作为反应条件的一个内在标准。对转 基因玉米事件DBN9508DNA抽提样品的分析应该包括一个转基因玉米事件 DBN9508的阳性组织DNA抽提物对照，一个来源于非转基因玉米事件DBN9508 的阴性DNA抽提物对照和一个不含有模板玉米DNA抽提物的阴性对照。除了 这些引物对之外，还可以使用来自SEQ ID NO:3或其互补序列、或者SEQ ID NO:4或其互补序列的任何引物对，当它们被用于DNA扩增反应时分别产生对 于来源于转基因事件玉米植物DBN9508的组织为诊断性的包含SEQ ID NO:1或 SEQ ID NO:2的扩增子。表2‑表5中说明的DNA扩增条件可以用于使用合适的 引物对以产生转基因玉米事件DBN9508的诊断性扩增子。当在DNA扩增方法 中测试时产生对转基因玉米事件DBN9508为诊断性扩增子的、推定含有转基因 玉米事件DBN9508的玉米植物或种子DNA的提取物，或来源于转基因玉米事 件DBN9508的产物，可以被用作扩增的模板，来确定是否存在转基因玉米事件 DBN9508。
[0209] 第四实施例、利用Southern印迹杂交检测转基因玉米事件DBN9508
[0210] 4.1、用于Southern印迹杂交的DNA提取
[0211] 利用研钵和研杵，在液氮中研磨大约5‑10g叶片组织。在20mL CTAB裂解 缓冲液(100mM Tris‑HCl pH 8.0、20mM EDTA pH 8.0、1.4M NaCl、0.2％v/vβ‑ 疏基乙醇、2％w/v CTAB)中重悬浮4‑5g研磨后的叶片组织，在温度65℃温育60min。在温育期间，每10min将样品颠倒混匀一次。温育后，加入等体积的苯 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀进行抽提，以转速4000rpm离心20min。 取水相用等体积氯仿/异戊醇(24:1)重复抽提一次。再次收集水相后加入等体积 异丙醇，混匀后在温度‑20℃放置1h以沉淀DNA，再以转速4000rpm离心5min 得到DNA沉淀，然后在1mL TE缓冲液(10mM Tris‑HCl、1mM EDTA，pH 8.0) 中重悬浮DNA沉淀。为了降解任何存在的RNA，在温度37℃下，将DNA和40 μL 10mg/mL RNase A温育30min，以4000rpm离心5min，并且在0.1倍体积 浓度为3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积无水乙醇存在的情况下，以转速12000rpm 离心10min沉淀DNA。弃掉上清液后，用70％(v/v)的1mL乙醇洗涤沉淀， 室温干燥后在1mL TE缓冲液中将DNA重新溶解。
[0212] 4.2、限制酶消化
[0213] 用超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)测定上述样 品的基因组DNA浓度。
[0214] 在100μL反应体系中，每次消化5μg DNA，用限制性内切酶Nco I和Nde I 分别消化基因组DNA，以T‑DNA上Vip3Aa19基因和pat基因的部分序列作为探 针。对于每种酶，在适当的温度下过夜温育消化物。利用真空离心蒸发浓缩器 (speed Vacuum，Thermo Scientific)旋转样品以减少体积至20μL。
[0215] 4.3、凝胶电泳
[0216] 向来源于本实施例4.2中的每个样品添加溴酚蓝上样缓冲液，并且将每个样 品加样到含有溴化乙锭的0.7％TAE琼脂糖凝胶上，在TAE电泳缓冲液(40mM Tris‑醋酸、2mM EDTA，pH 8.5)中电泳分离，在电压20V下电泳凝胶过夜。
[0217] 电泳结束后，用0.25M HCl处理凝胶10min以使DNA脱嘌呤，然后分别用变 性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris‑HCl，pH 7.2) 处理凝胶各30min。在瓷盘中倒入5×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)， 搭上一块玻璃板，然后依次放浸湿的滤纸桥、凝胶、带正电的尼龙膜(Roche，Cat.No. 11417240001)、三张滤纸、纸塔、重物。在室温下转膜过夜后，在去离子水中漂洗 尼龙膜2次，通过紫外交联仪(UVP，UV Crosslinker CL‑1000)将DNA固定在膜上。
[0218] 4.4、杂交
[0219] 用PCR扩增适合的DNA序列用于探针制备。所述DNA探针为SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25，或者与上述序列部分同源或互补。用DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒(Roche，Cat.No.11585614910)进行探针的DIG 标记、Southern印迹杂交、洗膜等操作，具体方法参考其产品说明书。最后用X 光片(Roche，Cat.No.11666916001)检测探针结合的位置。
[0220] 每个Southern上包括两种对照样品：(1)来自阴性(未转化的)分离子的 DNA，其用于鉴定任何可与元件‑特异性探针杂交的内源玉米序列；(2)来自 阴性分离子的DNA，其中引入了Nco I‑消化的DBN10707质粒，其量基于探针 长度等价于一个拷贝数，其作为杂交的阳性对照并用于说明实验的灵敏度。
[0221] 杂交数据提供了确证的证据支持TaqManTMPCR分析，即玉米植物DBN9508含 有Vip3Aa19基因和pat基因的单拷贝。利用该Vip3Aa19基因探针，Nco I和Ned I酶 解分别产生大小约9.5 kb和7.5 kb的单一条带；利用该pat基因探针，Nco I和Ned I 酶解分别产生大小约2.3 kb和8 kb的单一条带，这表明Vip3Aa19基因和pat基因各 一个拷贝存在于玉米植物DBN9508中。另外，对于骨架探针，未得到杂交条带，说 明在转化过程中未有任何DBN10707载体骨架序列进入玉米植物DBN9508基因组中。
[0222] 第五实施例、事件的昆虫抗性检测
[0223] 5.1、玉米植物DBN9508的生物测定
[0224] 将转基因玉米事件DBN9508和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种植 株分别对小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg，BCW)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura，TCW)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，BAW)、大螟(Sesamia inferens， PSB)、高粱条螟(Chilo sacchariphagus，SGB)和粟灰螟(Chilo infuscatellus， MSB)按照如下方法进行生物测定：
[0225] 分别取转基因玉米事件DBN9508和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种 植株的新鲜叶片(V3‑V4时期)，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干， 然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约1 cm×3 cm的长条状，取1‑3片(根据昆虫 食量确定叶片数量)剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤 纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放5‑10头人工饲养的初孵幼虫，虫试培养皿加盖后， 在温度26‑28℃、相对湿度70％‑80％、光周期(光/暗)16:8的条件下放置3天后统 计结果。统计幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分(满分 300分)：抗性总分＝100×死亡率+[100×死亡率+90×(初孵虫数/接虫数)+60×(初 孵‑阴性对照虫数/接虫数)+10×(阴性对照虫数/接虫数)]+100×(1‑叶片损伤率)。 其中，接虫数是指接虫的数量，即每皿5或10头(视昆虫的取食量而定)；幼虫 发育进度已通过抗性总分公式体现；叶片损伤率是指被害虫取食的叶片面积占叶片 总面积的比例。从转基因玉米事件DBN9508和野生型玉米植株(非转基因，NGM) 分别选5株进行测试，每株重复6次。结果如表6和表7所示。
[0226] 表6、转基因玉米事件DBN9508的抗虫生物测定结果‑死亡率(％)
[0227]
[0228] 表7、转基因玉米事件DBN9508的抗虫生物测定结果‑抗性总分(分)
[0229]
[0230] 结果表明：转基因玉米事件DBN9508对小地老虎、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、 大螟、高粱条螟和粟灰螟均具有较好的抗性，且转基因玉米事件DBN9508的 试虫死亡率和抗性总分均显著高于NGM。
[0231] 5.2、转基因玉米事件DBN9508的田间效果
[0232] 将转基因玉米事件DBN9508和野生型玉米植株(非转基因，NGM)2种植株 的种子设2
为2个处理，每个处理按随机区组设计，3次重复，小区面积为30m (5 m×6m)，行距60cm，株距25cm，常规栽培管理，全生育期不喷施杀虫剂。不 同昆虫接虫试验小区之间有2m的间隔，避免昆虫在不同小区之间的扩散。
为2个处理，每个处理按随机区组设计，3次重复，小区面积为30m (5 m×6m)，行距60cm，株距25cm，常规栽培管理，全生育期不喷施杀虫剂。不 同昆虫接虫试验小区之间有2m的间隔，避免昆虫在不同小区之间的扩散。
[0233] (1)小地老虎
[0234] 仅在小地老虎自然发生较为严重的地区进行自然感虫(自然虫害发生条件： 小地老虎造成危害的为第一代幼虫，在环境条件适宜情况易发生，如温度在 16‑26℃，相对湿度为80‑90％，土壤含水量15‑20％；此外第一代成虫诱到一定 量时，如20头以上)。在玉米苗期，材料长至V2‑V3左右时玉米植株发育至 展2‑3叶期，开始跟踪调查NGM中是否发生植株萎蔫，当NGM的萎蔫植株根 际附近发生多为4‑6龄高龄幼虫危害时，逐株调查小地老虎对玉米植株的为害率 (为害率＝被害虫取食的玉米植株数量/总植株数量×100％)。转基因玉米事件 DBN9508对小地老虎的抗性结果如表8所示。
[0235] 表8、转基因玉米事件DBN9508自然感虫条件下对小地老虎的抗性结果
[0236]
[0237] 结果表明：在小地老虎自然发生条件下，与NGM相比，小地老虎对转基因玉米事 件DBN9508的为害率显著降低，由此说明转基因玉米事件DBN9508对小地老虎具有较 好的抗性，转基因玉米事件DBN9508在小地老虎自然发生条件下的田间效果如图3所示。
[0238] (2)棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner，CBW)
[0239] 在玉米吐丝期进行人工接虫，接虫2次，每小区人工接虫不少于40株，在每株 玉米花丝中接人工饲养的初孵幼虫约20头，接虫3天后，第二次接虫，接虫数量同第 一次。在接虫14‑21天后，逐株调查雌穗被害率、每个雌穗存活幼虫数、雌穗被害长 度。通常接虫后14天开始调查，若NGM的为害级别达到感或高感，则视为有效，若 没有达到可适当推迟调查，但接虫后21天仍未达到相应级别，则本次接虫视为无效。 根据雌穗被害率、存活幼虫数、雌穗被害长度(cm)，计算各小区玉米穗期棉铃虫对 雌穗的为害级别平均值，判断标准如表9所示，然后按表10的标准判别玉米穗期对棉 铃虫的抗性水平。转基因玉米事件DBN9508吐丝期对棉铃虫的抗性结果如表11所示。
[0240] 表9、玉米雌穗受棉铃虫为害程度的分级标准
[0241] 雌穗被害级别 症状描述0 雌穗没有受害
1 仅花丝被害
2 穗顶被害1cm
3+ 穗顶下被害每增加1cm，相应的被害级别增加1级
…N
1 仅花丝被害
2 穗顶被害1cm
3+ 穗顶下被害每增加1cm，相应的被害级别增加1级
…N
[0242] 表10、玉米雌穗对棉铃虫的抗性评价标准
[0243]雌穗被害级别平均值 抗性水平
0‑1.0 高抗(HR)
1.1‑3.0 抗(R)
3.1‑5.0 中抗(MR)
5.1‑7.0 感(S)
≥7.1 高感(HS)
0‑1.0 高抗(HR)
1.1‑3.0 抗(R)
3.1‑5.0 中抗(MR)
5.1‑7.0 感(S)
≥7.1 高感(HS)
[0244] 表11、转基因玉米事件DBN9508吐丝期对棉铃虫的抗性结果
[0245]
[0246] 结果表明：在人工接种的条件下，转基因玉米事件DBN9508的雌穗被害 率、幼虫存活数、雌穗被害长度和雌穗被害级别显著低于NGM，由此说明转基 因玉米事件DBN9508对棉铃虫呈中抗(MR)水平，转基因玉米事件DBN9508 接种棉铃虫的田间效果如图4所示。
[0247] (3)斜纹夜蛾
[0248] 仅在斜纹夜蛾自然发生较为严重的地区进行自然感虫(自然虫害发生条件： 为害盛期在7‑9月，害虫发育最适温度在28‑30℃)。在初次发生虫害10‑15天 后，且NGM多为4‑6龄高龄幼虫危害时，逐株调查斜纹夜蛾对玉米植株的为害 率(为害率＝被害虫取食的玉米植株数量/总植株数量×100％)。转基因玉米事件DBN9508对斜纹夜蛾的抗性结果如表12所示。
[0249] 表12、转基因玉米事件DBN9508自然感虫条件下对斜纹夜蛾的抗性结果
[0250]
[0251] 结果表明：在斜纹夜蛾自然发生条件下，与NGM相比，斜纹夜蛾对转基 因玉米事件DBN9508的为害率显著降低，由此说明转基因玉米事件DBN9508 对斜纹夜蛾具有较好的抗性，转基因玉米事件DBN9508在斜纹夜蛾自然发生 条件下的田间效果如图5所示。
[0252] (4)甜菜夜蛾
[0253] 试验设计和试验方法基本上与如上所述的评价斜纹夜蛾的抗性一致。不同 的是，在初次发现虫害10‑15天后，且NGM多为4‑5龄高龄幼虫危害时，逐株 调查甜菜夜蛾对玉米植株的为害率(为害率＝被害虫取食的玉米植株数量/总植株 数量×100％)。转基因玉米事件DBN9508对甜菜夜蛾的抗性结果如表13所示。
[0254] 表13、转基因玉米事件DBN9508自然感虫条件下对甜菜夜蛾的抗性结果
[0255]
[0256] 结果表明：在甜菜夜蛾自然发生条件下，与NGM相比，甜菜夜蛾对转基 因玉米事件DBN9508的为害率显著降低，由此说明转基因玉米事件DBN9508 对甜菜夜蛾具有较好的抗性，转基因玉米事件DBN9508在甜菜夜蛾自然发生 条件下的田间效果如图6所示。
[0257] 特别值得一提的是，根据中国专利(申请)第201310289848.6、 201310573441.6、201410806573.3、201510259396.6、201610006375.8号中记 载的内容，和本申请转基因玉米事件DBN9508的对昆虫的田间效力与其生物 测定结果，表明本申请转基因玉米事件DBN9508实现了控制害虫的方法和/或 用途，具体为大螟、斜纹夜蛾、粟灰螟、高粱条螟和桃蛀螟；也即任何表达 Vip3Aa19蛋白的转基因玉米植物均可以实现控制大螟、斜纹夜蛾、粟灰螟、高 粱条螟和/或桃蛀螟害虫的方法和/或用途。
[0258] 第六实施例、事件的除草剂耐受性检测
[0259] 本试验选用保试达(Basta)除草剂(有效成分为18％的草铵膦铵盐水剂) 进行喷2
施。采用随机区组设计，3次重复。小区面积为15m (5m×3m)，行 距60cm，株距25cm，常规栽培管理，小区之间有1m的宽隔离带。将转基因 玉米事件DBN9508进行如下2种处理：(1)不喷施，在处理(2)喷洒除草剂 的同时，喷洒等体积的清水；(2)按800g a.i./ha(a.i./ha是指“活性成分每公 顷”)剂量在V2‑V3叶期喷洒保试达除草剂。需要说明的是，草铵膦除草剂(如 Basta)为触杀型除草剂，如田间使用操作不当，如局部积累药液过多，可出现 药害状，并非转基因玉米事件DBN9508耐受性存在问题；不同含量和剂型的草 铵膦除草剂换算成上述等量有效成分草铵膦均适用于以下结论。
施。采用随机区组设计，3次重复。小区面积为15m (5m×3m)，行 距60cm，株距25cm，常规栽培管理，小区之间有1m的宽隔离带。将转基因 玉米事件DBN9508进行如下2种处理：(1)不喷施，在处理(2)喷洒除草剂 的同时，喷洒等体积的清水；(2)按800g a.i./ha(a.i./ha是指“活性成分每公 顷”)剂量在V2‑V3叶期喷洒保试达除草剂。需要说明的是，草铵膦除草剂(如 Basta)为触杀型除草剂，如田间使用操作不当，如局部积累药液过多，可出现 药害状，并非转基因玉米事件DBN9508耐受性存在问题；不同含量和剂型的草 铵膦除草剂换算成上述等量有效成分草铵膦均适用于以下结论。
[0260] 分别在用药后1周和2周调查药害症状，并在收获时测定小区的产量；药 害症状分级如表14所示。用除草剂受害率作为评价转化事件的除草剂耐受性的 指标，具体地，除草剂受害率(％)＝∑(同级受害株数×级别数)/(总株数× 最高级别)；其中除草剂受害率是指草铵膦受害率，草铵膦受害率是根据草铵 膦处理后2周的药害调查结果而确定的，并由除草剂(草铵膦)受害率判别玉 米对除草剂的耐受水平。每个小区的玉米产量是称量各小区中间3行的玉米粒 总产量(重量)，不同处理间的产量差异以产量百分率的形式进行度量，产量 百分率(％)＝喷施产量/不喷施产量。转基因玉米事件DBN9508对除草剂耐受 性的结果和玉米产量结果如表15所示。
[0261] 表14、草铵膦除草剂对玉米药害程度的分级标准
[0262] 药害级别 症状描述1 生长正常，无任何受害症状
2 轻微药害，药害少于10％
3 中等药害，以后能恢复，不影响产量
4 药害较重，难以恢复，造成减产
5 药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产
2 轻微药害，药害少于10％
3 中等药害，以后能恢复，不影响产量
4 药害较重，难以恢复，造成减产
5 药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产
[0263] 表15、转基因玉米事件DBN9508对草铵膦除草剂耐受性的结果和玉米产量结果[0264]
[0265] 结果说明，在草铵膦除草剂受害率方面：转基因玉米事件DBN9508在草 铵膦除草剂(800g a.i./ha)处理下受害率为0；由此，转基因玉米事件DBN9508 具有良好的草铵膦除草剂耐受性。
[0266] 在产量方面：转基因玉米事件DBN9508在不喷施和喷施800g a.i./ha草 铵膦2种处理下产量没有明显差异，在喷施草铵膦除草剂后，转基因玉米事 件DBN9508的产量略有增加，由此，进一步表明转基因玉米事件DBN9508 具有良好的草铵膦除草剂耐受性。
[0267] 第七实施例
[0268] 可由转基因玉米事件DBN9508生产诸如农产品或商品。如果在所述农产 品或商品中检测到足够的表达量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因 玉米事件DBN9508材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品 或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀 粉、以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或 化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或 试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的 来源于转基因玉米事件DBN9508的核苷酸序列，其中探针序列或引物序列选自 如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 中所示的序列或其部分，以诊断转基因玉米事件DBN9508的存在。
[0269] 综上所述，本发明转基因玉米事件DBN9508对鳞翅目昆虫具有较好的抗 性，同时对草铵膦除草剂具有较高的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以 准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件DBN9508的DNA分子。
[0270] 对应于转基因玉米事件DBN9508的种子已根据布达佩斯条约于2019年1 月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，分类命名：玉米(Zea mays)，保藏编号为CGMCC No.17100，保藏 状态：存活。保藏物将在保藏处保藏30年。
[0271] 最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方 案的精神和范围。