一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗转让专利
申请号 : CN201910289602.6
文献号 : CN109999191B
文献日 : 2022-06-24
发明人 : 曹文龙 , 孔迪 , 滕小锘 , 易小萍 , 张大鹤
申请人 : 苏州世诺生物技术有限公司
摘要 :
本发明提供了一种免疫组合物及亚单位疫苗，所述免疫组合物包括一种蛋白，所述蛋白选自以下的一种或者两种以上的任意组合：采用SEQ ID NO:1或3或5或7或9的核酸分子或者与SEQ ID NO:1或3或5或7或9的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体相关蛋白。该疫苗使用真核表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，保护效果好，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。
权利要求 :
1.一种免疫组合物，其特征在于，包括：采用SEQ ID NO:1的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1；
采用SEQ ID NO:3的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2；
采用SEQ ID NO:5的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3；
采用SEQ ID NO:7的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3；
采用SEQ ID NO:9的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5。
2.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；
所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡毒支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。
4.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受鸡毒支原体感染的药剂的用途。
5.一种蛋白组合物，其特征在于，包括：SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4的氨基酸序列SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
SEQ ID NO:8的氨基酸序列；
SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
6.一种适用于在受试动物体内产生针对鸡毒支原体的免疫反应的免疫组合物，包含：权利要求5所述的蛋白组合物，和佐剂。
7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，所述佐剂选自：白油M52、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。
说明书 :
一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗
技术领域
[0001] 本申请涉及动物免疫药物技术领域，具体涉及一种鸡毒支原体新型基因工程疫苗的制备方法与应用。
背景技术
[0002] 鸡毒支原体(MycoplasmaGalliscepticum，MG)感染是鸡呼吸道病的一种，主要引起慢性呼吸道病、气囊炎和窦炎，临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕，呼吸时发出罗音，严重时张口呼吸。据统计，鸡毒支原体感染鸡群后，雏鸡的弱雏率增加10％左右，蛋鸡的产蛋率下降10％‑20％，肉鸡的体重减少38％，出栏期延长，饲料转化率降低21％，并可间接地引起大量的药费开支，是危害养鸡业的重要疾病之一。
[0003] 鸡毒支原体(MG)是支原体目，支原体科，支原体属的一个致病种，为很小的原核生物，无细胞壁，仅细胞膜包裹。
[0004] 目前鸡毒支原体的防治主要有疫苗预防和药物治疗。鸡毒支原体的感染特征主要在气管粘膜的纤毛上和气囊上定植，而气管纤毛末端和气囊上没有血管，而药物是通过血
液运输到达作用部位，再通过扩散作用于毒支原体，因此药物只能减少气管纤毛和气囊上
定植的毒支原体数量和减轻临床症状，而不能完将其杀灭，而鸡毒支原体感染一般为一次
感染会终生处于持续性感染的带菌状态，因此从目前来看，疫苗可以有效提供保护。
液运输到达作用部位，再通过扩散作用于毒支原体，因此药物只能减少气管纤毛和气囊上
定植的毒支原体数量和减轻临床症状，而不能完将其杀灭，而鸡毒支原体感染一般为一次
感染会终生处于持续性感染的带菌状态，因此从目前来看，疫苗可以有效提供保护。
[0005] 目前用于预防、控制鸡毒支原体感染的疫苗都是传统灭活疫苗，但鸡毒支原体培养困难，需要血清，抗原含量低。同时在鸡毒支原体培养过程中，由于培养温度、培养基成分等条件发生变化以及自身的不断复制，鸡毒支原体表面的抗原蛋白极易发生突变以及缺
失，导致灭活疫苗存在免疫保护力较弱的问题。因此，研究新的免疫力强的疫苗势在必行。
研究开发以基因工程疫苗为主的新型疫苗是本世纪的主导方向。
失，导致灭活疫苗存在免疫保护力较弱的问题。因此，研究新的免疫力强的疫苗势在必行。
研究开发以基因工程疫苗为主的新型疫苗是本世纪的主导方向。
发明内容
[0006] 本发明旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。
[0007] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，包括一种蛋白，所述蛋白选自以下的一种或者两种以上的任意组合：
[0008] 采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1；
[0009] 采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2；
[0010] 采用SEQ ID NO:5的核酸分子或者与SEQ ID NO:5的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3。
[0011] 采用SEQ ID NO:7的核酸分子或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3；
[0012] 采用SEQ ID NO:9的核酸分子或者与SEQ ID NO:9的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5。
[0013] 优选的技术方案是，所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0014] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0015] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
[0016] 所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0017] 所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡毒支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。
[0019] 本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鸡毒支原体感染的药剂的用途。
[0020] 本发明的又一目的在于提供一种免疫组合物，包括一种用于编码鸡毒支原体血凝相关蛋白或者粘附素蛋白的核酸分子，所述核酸分子选自以下的一种或者两种以上的任意
组合：
组合：
[0021] SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；
[0022] SEQ ID NO:3的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；
[0023] SEQ ID NO:5的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:5的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；
[0024] SEQ ID NO:7的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；
[0025] SEQ ID NO:9的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:9的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。
[0026] 本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡毒支原体抗原的免疫反应的药剂的用途。
[0027] 本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸡毒支原体感染的药剂的用途。
[0028] 本发明的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：
[0029] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0030] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0031] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
[0032] 所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；
[0033] 所述的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。
[0034] 本发明的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对鸡毒支原体的免疫反应的免疫组合物，包含：
[0035] 所述的鸡毒支原体粘附素蛋白与血凝相关蛋白和佐剂。
[0036] 优选的技术方案是，所述佐剂选自：
[0037] 白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。
[0038] 本发明公开了一种Sf9细胞表达的鸡毒支原体重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸡能够抵御鸡毒支原体感
染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的
鸡毒支原体重组亚单位疫苗的制备方法：先构建重组穿梭载体，通过分别克隆包含血凝蛋
白VLH3(variably expressed lipoprotein and hemagglutinin lipoproteins 3，后面的
3等数字是一个作者的命名，根据基因的簇以及其方向命名，有时也称为pMGA)、VLH5
(variably expressed lipoprotein and hemagglutinin lipoproteins 5，命名同上)及
粘附素蛋白1(Mycoplasma gallisepticum cytadhesin 1，MGC1)、粘附素蛋白2
(Mycoplasma gallisepticum cytadhesin 2，MGC2)、粘附素蛋白3(Mycoplasma
gallisepticum cytadhesin3，MGC3)编码基因到穿梭载体pFastBac 1载体上。然后构建重
组杆状病毒株，包括蛋白SDS‑PAGE，WB，免疫荧光检测，病毒滴度检测，进行蛋白大规模生产表达以及含量测定；在野生鸡毒支原体基因组中，表达这五个和鸡毒支原体感染密切相关
的蛋白比如血凝相关蛋白VLH3、VLH5及粘附素蛋白MGC1、MGC2以及MGC3的基因存在大量的
同源假基因，真基因与其同源的假基因极易发生同源重组，所以在支原体繁殖过程中血凝
相关蛋白VLH3、VLH5及粘附素蛋白MGC1、MGC2以及MGC3中氨基酸序列极易发生突变，导致一个群体中不同个体或者不同群体野生的鸡毒支原体这五个膜表面蛋白差异很大，呈现不同
的群体性分布，为了尽可能提高疫苗的保护效果，抵消野生鸡毒支原体中存在的抗原差异，本发明表达五种抗原蛋白与佐剂混合制备疫苗。
染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的
鸡毒支原体重组亚单位疫苗的制备方法：先构建重组穿梭载体，通过分别克隆包含血凝蛋
白VLH3(variably expressed lipoprotein and hemagglutinin lipoproteins 3，后面的
3等数字是一个作者的命名，根据基因的簇以及其方向命名，有时也称为pMGA)、VLH5
(variably expressed lipoprotein and hemagglutinin lipoproteins 5，命名同上)及
粘附素蛋白1(Mycoplasma gallisepticum cytadhesin 1，MGC1)、粘附素蛋白2
(Mycoplasma gallisepticum cytadhesin 2，MGC2)、粘附素蛋白3(Mycoplasma
gallisepticum cytadhesin3，MGC3)编码基因到穿梭载体pFastBac 1载体上。然后构建重
组杆状病毒株，包括蛋白SDS‑PAGE，WB，免疫荧光检测，病毒滴度检测，进行蛋白大规模生产表达以及含量测定；在野生鸡毒支原体基因组中，表达这五个和鸡毒支原体感染密切相关
的蛋白比如血凝相关蛋白VLH3、VLH5及粘附素蛋白MGC1、MGC2以及MGC3的基因存在大量的
同源假基因，真基因与其同源的假基因极易发生同源重组，所以在支原体繁殖过程中血凝
相关蛋白VLH3、VLH5及粘附素蛋白MGC1、MGC2以及MGC3中氨基酸序列极易发生突变，导致一个群体中不同个体或者不同群体野生的鸡毒支原体这五个膜表面蛋白差异很大，呈现不同
的群体性分布，为了尽可能提高疫苗的保护效果，抵消野生鸡毒支原体中存在的抗原差异，本发明表达五种抗原蛋白与佐剂混合制备疫苗。
[0039] 本发明目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的鸡毒支原体基因工程亚单位疫苗，本发明使用Sf9细胞表达重组鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3、VLH5，以及粘附素蛋白(MGC1、MGC2以及MGC3)。本发明生产过程不涉及支原体培养，通过Sf9细胞进行蛋白表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似且表达的抗原不存在突变以及缺失的情况，表达
水平较高。悬浮培养，易于大规模生产。
水平较高。悬浮培养，易于大规模生产。
[0040] 采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：
[0041] 本发明的免疫组合物本发明使用Sf9细胞表达血凝蛋白VLH3，VLH5及粘附素蛋白(MGC1、MGC2以及MGC3)，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，且表达的抗原不存在突变以及缺失的情况，免疫原性强，对鸡没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。
[0042] 本发明使用了优化的血凝蛋白VLH3、VLH5及粘附素蛋白MGC1、MGC2以及MGC3序列，使用悬浮培养Sf9细胞进行表达，表达水平较高，蛋白免疫原性好。本发明的亚单位疫苗可以大规模生产，供量充足，质控容易；安全性高，免疫原性好；批次间稳定；生产成本低。
附图说明
[0043] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0044] 图1为将MGC1基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个2.9kbp的条带；其中1为阴性对照；2为MG‑MGC1基因；M为分子量标记；
[0045] 图2为多个MGC1基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，2.9kbp条带出现为阳性样品。其中2～7均为MGC1基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，1
为非阳性样品；M为分子量标记；
为非阳性样品；M为分子量标记；
[0046] 图3为构建的含有目的基因的转移载体pF‑MG‑MGC1图谱；
[0047] 图4为将MGC2基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个0.6kbp的条带；其中1为阴性对照；2为MG‑MGC2基因；M为分子量标记；
[0048] 图5为多个MGC2基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，0.6kbp条带出现为阳性样品。其中2～6均为MGC2基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，1
为非阳性样品；M为分子量标记；
为非阳性样品；M为分子量标记；
[0049] 图6为构建的含有目的基因的转移载体pF‑MG‑MGC2图谱；
[0050] 图7为将MGC3基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个2.7kbp的条带；其中1为阴性对照，2为MG‑MGC3基因；M为分子量标记；
[0051] 图8为多个MGC3基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，2.7kbp条带出现为阳性样品。其中2～7均为MGC2基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，1
为非阳性样品；M为分子量标记；
为非阳性样品；M为分子量标记；
[0052] 图9为构建的含有目的基因的转移载体pF‑MG‑MGC2图谱；
[0053] 图10为将VLH3基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个1.8kbp的条带；其中1为阴性对照，2为MG‑VLH3基因；M为分子量标记；
[0054] 图11为多个VLH3基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.8kbp条带出现为阳性样品。其中2～7均为VLH3基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，1
为非阳性样品；M为分子量标记；
为非阳性样品；M为分子量标记；
[0055] 图12为构建的含有目的基因的转移载体pF‑MG‑VLH3图谱；
[0056] 图13为将VLH5基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个1.7kbp的条带；其中1为阴性对照，2为MG‑VLH5基因；M为分子量标记；
[0057] 图14为多个VLH5基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.7kbp条带出现为阳性样品。其中2～7均为VLH5基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，1
为非阳性样品；M为分子量标记；
为非阳性样品；M为分子量标记；
[0058] 图15为构建的含有目的基因的转移载体pF‑MG‑VLH5图谱；
[0059] 图16为实施例7中收获的rBac‑MGC1细胞培养物上清进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约106kDa附近出现目的条带，其中2为rBac‑MGC1细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0060] 图17为实施例7中收获的rBac‑MGC2细胞培养物上清进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约23kDa附近出现目的条带，其中2为rBac‑MGC2细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0061] 图18为实施例7中收获的rBac‑MGC3细胞培养物上清进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约100kDa附近出现目的条带，其中2为rBac‑MGC2细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0062] 图19为实施例7中收获的rBac‑VLH3细胞培养物上清进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约67kDa附近出现目的条带，其中2为rBac‑MGC2细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0063] 图20为实施例7中收获的rBac‑VLH5细胞培养物上清进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约63kDa附近出现目的条带，其中2为rBac‑VLH5细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0064] 图21为实施例8中的MG‑MGC1重组杆状病毒细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中2为MG‑MGC1重组杆状病毒细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0065] 图22为实施例8中的MG‑MGC2重组杆状病毒细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中2为MG‑MGC2重组杆状病毒细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0066] 图23为实施例8中的MG‑MGC3重组杆状病毒细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中2为MG‑MGC3重组杆状病毒细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0067] 图24为实施例8中的MG‑VLH3重组杆状病毒细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中2为MG‑VLH3重组杆状病毒细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0068] 图25为实施例8中的MG‑VLH5重组杆状病毒细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中2为MG‑VLH5重组杆状病毒细胞培养物上清；1为阴性对照；M为分子量标记；
[0069] 图26为空杆状病毒Sf9细胞和重组杆状病毒Sf9细胞荧光图，其中，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光。
具体实施方式
[0070] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0071] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0072] 本发明提供了一种免疫组合物，包括一种蛋白，所述蛋白选自以下的一种或者两种以上的任意组合：
[0073] 采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC1；
[0074] 采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC2；
[0075] 采用SEQ ID NO:5的核酸分子或者与SEQ ID NO:5的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体粘附素蛋白MGC3。
[0076] 采用SEQ ID NO:7的核酸分子或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH3；
[0077] 采用SEQ ID NO:9的核酸分子或者与SEQ ID NO:9的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡毒支原体血凝相关蛋白VLH5；
[0078] 本发明也涉及一种诱导针对鸡毒支原体抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。
[0079] 本发明也涉及一种保护受试动物免受鸡毒支原体感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。
[0080] 本发明进一步涉及一种保护已诊断有鸡毒支原体感染的受试动物的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。
[0081] 本发明还包括适用于诱导针对鸡毒支原体的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL‑12、IL‑15、IL‑28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM‑CSF、表皮生长因子(EGF)、IL‑1、IL‑2、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑10、IL‑18、IL‑21、IL‑31、IL‑33或其组合；
并且在一些实施方案中，可为IL‑12、IL‑15、IL‑28或RANTES。
并且在一些实施方案中，可为IL‑12、IL‑15、IL‑28或RANTES。
[0082] 疫苗可包含蛋白分子。所述蛋白分子选自一种或者两种以下的任意组合：包含SEQ ID NO:2或4或6或8或10的蛋白；在SEQ ID NO:2或4或6或8或10的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；SEQ ID NO:2或4或6或8或10的片段；与SEQ ID NO:2或4或6或8或10的片
段95％相同的蛋白。
段95％相同的蛋白。
[0083] 本文还提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2或4或6或8或10；(b)在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的
蛋白；(c)SEQ ID NO:2或4或6或8或10的包含SEQ ID NO:2或4或6或8或10的20个或更多个
氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或4或6或8或10的氨基酸序列的整个长度
上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。
蛋白；(c)SEQ ID NO:2或4或6或8或10的包含SEQ ID NO:2或4或6或8或10的20个或更多个
氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或4或6或8或10的氨基酸序列的整个长度
上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。
[0084] 本发明的疫苗可为包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1或3或5或
7或9；在SEQ ID NO:1或3或5或7或9的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段；与SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段95％相同的核苷酸序
列。
7或9；在SEQ ID NO:1或3或5或7或9的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段；与SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段95％相同的核苷酸序
列。
[0085] 本发明一些方面提供诱导针对鸡毒支原体的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用鸡毒支原体抗原和/或其组合物。
[0086] 本发明另外的方面提供保护个体免受鸡毒支原体感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核
酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反
应。
酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反
应。
[0087] 本发明的一些方面提供一种诱导针对鸡毒支原体抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。
[0088] 本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受鸡毒支原体感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。
[0089] 本发明的一些方面提供一种保护已诊断有鸡毒支原体感染的受试动物的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。
[0090] 在另一方面，本发明提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2或4或6或8；(b)在SEQ ID NO:2或4或6或8的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQ
ID NO:2或4或6或8的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或
4或6或8的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原
性片段。
ID NO:2或4或6或8的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或
4或6或8的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原
性片段。
[0091] 本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对鸡毒支原体的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL‑12、IL‑15、IL‑28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM‑CSF、表皮生长因子(EGF)、IL‑1、IL‑2、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑10、IL‑18、IL‑21、IL‑31、IL‑33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL‑12、IL‑15、IL‑28或RANTES。
[0092] 本发明的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白。
[0093] 1.定义.
[0094] 本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。
[0095] 对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6‑9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0‑7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
[0096] 如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的DNA质粒疫苗中来增强由下文所述的DNA质粒和编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。
[0097] 如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。
[0098] 如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多
聚腺苷酸化信号。
聚腺苷酸化信号。
[0099] 如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson‑Crick(例如，A‑T/U和C‑G)或者Hoogsteen碱基配对。
[0100] 如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定鸡毒支原体抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定鸡毒支原体抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些
蛋白的共有序列和/或核酸分子。
蛋白的共有序列和/或核酸分子。
[0101] 如本文可互换使用的“电穿孔”、“电‑透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。
[0102] 如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株鸡毒支原体抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可
以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。
以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。
[0103] 就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株鸡毒支原体抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少
30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个
氨基酸或更多。
30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个
氨基酸或更多。
[0104] 如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包
括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所
用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。
括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所
用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。
[0105] 如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术
语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。
语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。
[0106] 在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以
产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果
乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多
个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计
算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等
同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。
产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果
乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多
个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计
算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等
同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。
[0107] 如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如鸡毒支原体共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。
[0108] 如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。
[0109] 核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方
法来获得。
法来获得。
[0110] 如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基
因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况
下进行调整。
因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况
下进行调整。
[0111] 如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元
件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子
或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动
子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子‑启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV‑LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。
件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子
或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动
子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子‑启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV‑LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。
[0112] “信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的鸡毒支原体蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。
[0113] 如本文所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5‑10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定
的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01‑1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10‑50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去
稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。
的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01‑1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10‑50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去
稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。
[0114] 如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、
360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。
360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。
[0115] 如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。
100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。
[0116] “亚型”或“血清型”：如本文交换使用的并且关于鸡毒支原体，意指鸡毒支原体的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。
[0117] 本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者
(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
[0118] 就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基
酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105‑132
(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似
的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为
±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取
代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经
被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性
值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的
亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特
定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨
基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。
酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105‑132
(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似
的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为
±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取
代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经
被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性
值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的
亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特
定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨
基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。
[0119] 如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。
[0120] 2.疫苗
[0121] 本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种鸡毒支原体血清型的免疫反应的程度或强度。所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可
针对所述免疫原诱导抗鸡毒支原体免疫反应。鸡毒支原体抗原可以包括全长翻译产物、其
变体、其片段或其组合。
针对所述免疫原诱导抗鸡毒支原体免疫反应。鸡毒支原体抗原可以包括全长翻译产物、其
变体、其片段或其组合。
[0122] 一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有96％同源性的
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的
核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的
编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编
码序列的5’末端的序列。
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的
核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的
核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的
编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编
码序列的5’末端的序列。
[0123] 在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。
[0124] 一些实施方案涉及SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或3或5或7或9。片段可与SEQ ID
NO:1或3或5或7或9的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序
列，例如像IgE前导物的编码序列。
96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或3或5或7或9。片段可与SEQ ID
NO:1或3或5或7或9的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1或3或5或7或9的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序
列，例如像IgE前导物的编码序列。
[0125] 一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4或6或8或10同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些
实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫
原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白序列具有97％
同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白
序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQID NO:2中所述的蛋白序
列具有99％同源性的免疫原性蛋白。
实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫
原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白序列具有97％
同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的蛋白
序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQID NO:2中所述的蛋白序
列具有99％同源性的免疫原性蛋白。
[0126] 一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4或6或8或10相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长
度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4
或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序
列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长
共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实
施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨
基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ
ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同
的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中
所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性
蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序
列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具
有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度
上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或
6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列
的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共
有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施
方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基
酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨
基酸序列的免疫原性蛋白。
度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4
或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序
列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长
共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实
施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨
基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ
ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同
的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中
所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性
蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序
列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具
有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度
上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或
6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列
的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共
有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施
方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基
酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨
基酸序列的免疫原性蛋白。
[0127] 在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少
40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2或4或6或8或10的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少
15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2或4或6或8或10。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2或4或6或8或10的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少
15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2或4或6或8或10。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
[0128] 可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4或6或8或10的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少
30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2或4或6或8或1095％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋
白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序
列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的
免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫
原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2或4或6或8或1095％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋
白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序
列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的
免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫
原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
[0129] 可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4或6或8或10的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少
30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2或4或6或8或10中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。
[0130] 蛋白或者核酸分子可以以任何量存在于组合物中。免疫组合物中不同蛋白分子以任意比例存在于组合物中；免疫组合物中不同核酸分子以任意比例存在于组合物中。当进
行使用时，向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所
述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免
疫反应。术语“有效量”是有效地改善动物疾病的症状的量。
行使用时，向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所
述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免
疫反应。术语“有效量”是有效地改善动物疾病的症状的量。
[0131] 3.疫苗构建体和质粒
[0132] 疫苗可包括编码鸡毒支原体血凝相关蛋白、鸡毒支原体抗原以及鸡毒支原体血凝相关蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的鸡毒支
原体抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开
的鸡毒支原体表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染
色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型
染色体。
原体抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开
的鸡毒支原体表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染
色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型
染色体。
[0133] 所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物
或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
[0134] 遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。
[0135] 核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。
[0136] 编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。
[0137] 所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密
码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动
子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠
乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重
复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉
瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋
白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。
码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动
子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠
乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重
复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉
瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋
白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。
[0138] 所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在鸡毒支原体核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信
号或人β‑球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体
(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。
号或人β‑球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体
(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。
[0139] 载体也可包含在共有鸡毒支原体核心蛋白编码序列或共有鸡毒支原体表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。
[0140] 载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或者
pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA‑1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本
文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137‑724处。T7启动子/引发位点位于碱基664‑
683处。多克隆位点位于碱基696‑811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829‑1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226‑2020处。pUC起点是在碱基2320‑2993处。
pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA‑1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本
文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137‑724处。T7启动子/引发位点位于碱基664‑
683处。多克隆位点位于碱基696‑811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829‑1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226‑2020处。pUC起点是在碱基2320‑2993处。
[0141] 所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可
以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，
Calif.)，其可用于在动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。所述载体可以是通
过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括
Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor
(1989)。
以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNA I或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，
Calif.)，其可用于在动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。所述载体可以是通
过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括
Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor
(1989)。
[0142] 编码血凝蛋白VLH3.01，VLH5.02及粘附素蛋白(MGC2以及MGC3，MGC1)的基因序列可以是原始序列，增加以及截短的序列。疫苗的组成可以是其中任何一个蛋白或者任意组
合物，优选的是五个蛋白等比例混合。重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体
包括但不限于pFastBac1，Pvl1393等，例如可以优选采用pFastBac1。Sf9细胞系可以是为
Sf9、High Five、S2或Sf21细胞，优选的用Sf9。
合物，优选的是五个蛋白等比例混合。重组杆状病毒载体中的杆状病毒表达系统转移载体
包括但不限于pFastBac1，Pvl1393等，例如可以优选采用pFastBac1。Sf9细胞系可以是为
Sf9、High Five、S2或Sf21细胞，优选的用Sf9。
[0143] 实施例1转移载体pF‑MGC1构建与鉴定
[0144] 1.MGC1基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的MGC1基因(SEQ ID NO:1)并克隆到pUC17载体上，得到pUC‑MGC1质粒载体。以pUC‑MGC1质粒作为模板，MGC1‑F、MGC1‑R作为上下游引物进行PCR扩增(MGC1‑F、MGC1‑R的基因序列如SEQ ID NO.11、12所示)，扩增体系见表1。
[0145] 表1 MGC1基因扩增体系
[0146]
[0147] 反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0148] 将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图1所示，在2.9kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0149] 2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和MGC1基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2、表3。
[0150] 将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及MGC1基因片段。
[0151] 表2 MGC1基因酶切反应体系
[0152]
[0153]
[0154] 表3 pFastbac 1质粒酶切反应体系
[0155]
[0156] 3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和MGC1基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表4。
[0157] 表4 MGC1基因与pFastBac1质粒连接体系
[0158]
[0159] 4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
[0160] 5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，MGC1‑F和MGC1‑R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图2所示，出现2.9kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF‑MGC1其示意图如图3。
[0161] 实施例2转移载体pF‑MGC2构建与鉴定
[0162] 1.MGC2基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的MGC2基因(SEQ ID NO:3)并克隆到pUC17载体上，得到pUC‑MGC2质粒载体。以pUC‑MGC2质粒作为模板，MGC2‑F、MGC2‑R作为上下游引物进行PCR扩增(MGC2‑F、MGC2‑R的基因序列如SEQ ID NO.13、14所示)，扩增体系见表5。
[0163] 表5 MGC2基因扩增体系
[0164]
[0165]
[0166] 反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0167] 将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图4所示，在0.6kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0168] 2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和MGC2基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表6、表7。
[0169] 将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及MGC2基因片段。
[0170] 表6 MGC2基因酶切反应体系
[0171]
[0172] 表7 pFastbac 1质粒酶切反应体系
[0173]
[0174] 3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和MGC2基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表8。
[0175] 表8 MGC2基因与pFastBac1质粒连接体系
[0176]
[0177] 4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
[0178] 5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，MGC2‑F和MGC2‑R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图5所示，出现0.6kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF‑MGC2其示意图如图6。
[0179] 实施例3转移载体pF‑MGC3构建与鉴定
[0180] 1.MGC3基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的MGC3基因(SEQ ID NO:5)并克隆到pUC17载体上，得到pUC‑MGC3质粒载体。以pUC‑MGC3质粒作为模板，MGC3‑F、MGC3‑R作为上下游引物进行PCR扩增(MGC3‑F、MGC3‑R的基因序列如SEQ ID NO.15、16所示)，扩增体系见表9。
[0181] 表9 MGC3基因扩增体系
[0182]
[0183] 反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0184] 将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图7所示，在2.7kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0185] 2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和MGC3基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表10、表11。
[0186] 将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及MGC3基因片段。
[0187] 表10 MGC3基因酶切反应体系
[0188]
[0189] 表11 pFastbac 1质粒酶切反应体系
[0190]
[0191]
[0192] 3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和MGC3基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表12。
[0193] 表12 MGC3基因与pFastBac1质粒连接体系
[0194]
[0195] 4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
[0196] 5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，MGC3‑F和MGC3‑R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图8所示，出现2.7kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF‑MGC3其示意图如图9。
[0197] 实施例4转移载体pF‑VLH3构建与鉴定
[0198] 1.VLH3基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的VLH3基因(SEQ ID NO:7)并克隆到pUC17载体上，得到pUC‑VLH3质粒载体。以pUC‑VLH3质粒作为模板，VLH3‑F、VLH3‑R作为上下游引物进行PCR扩增(VLH3‑F、VLH3‑R的基因序列如SEQ ID NO.17、18所示)，扩增体系见表13。
[0199] 表13 VLH3基因扩增体系
[0200]
[0201] 反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0202] 将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图10所示，在1.8kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0203] 2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和VLH3基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表14、表15。
[0204] 将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及VLH3基因片段。
[0205] 表14 VLH3基因酶切反应体系
[0206]
[0207] 表15 pFastbac 1质粒酶切反应体系
[0208]
[0209] 3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和VLH3基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表16。
[0210] 表16 VLH3基因与pFastBac1质粒连接体系
[0211]
[0212] 4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
[0213] 5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VLH3‑F和VLH3‑R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图11所示，出现1.8kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF‑VLH3其示意图如图12。
[0214] 实施例5转移载体pF‑VLH5构建与鉴定
[0215] 1.VLH5基因扩增与纯化在南京金斯瑞公司合成了密码子优化后的VLH5基因(SEQ ID NO:9)并克隆到pUC17载体上，得到pUC‑VLH5质粒载体。以pUC‑VLH5质粒作为模板，VLH5‑F、VLH5‑R作为上下游引物进行PCR扩增(VLH5‑F、VLH5‑R的基因序列如SEQ ID NO.19、20所示)，扩增体系见表17。
[0216] 表17 VLH5基因扩增体系
[0217]
[0218] 反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性45秒，54℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
[0219] 将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图13所示，在1.7kbp的位置出现目的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
[0220] 2.酶切与纯化将pFastBac1质粒和VLH5基因表达框PCR扩增产物使用BamHⅠ、HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表18、表19。
[0221] 将酶切产物进行凝胶电泳，分别使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pFastBac1质粒以及VLH5基因片段。
[0222] 表18 VLH5基因酶切反应体系
[0223]
[0224] 表19 pFastbac 1质粒酶切反应体系
[0225]
[0226]
[0227] 3.连接将双酶切的pFastBac1质粒和VLH5基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜。具体连接反应体系见表20。
[0228] 表20 VLH5基因与pFastBac1质粒连接体系
[0229]
[0230] 4.转化将10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。
[0231] 5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，VLH5‑F和VLH5‑R作为引物进行菌落PCR鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因的大小，如图14所示，出现1.7kbp条带的样品为阳性样品。将鉴定阳性的菌液送测序公司进行测序，选择测序正确的菌液保存。构建的含有目的基因的转移载体pF‑VLH5其示意图如图15。
[0232] 实施例6重组杆状病毒基因组Bac‑MGC1、Bac‑MGC2、Bac‑MGC3、Bac‑VLH3和Bac‑VLH5构建
[0233] 1.DH10Bac菌转化分别取实施例1‑5中各1μl pF‑MGC1质粒、pF‑MGC2质粒、pF‑MGC3质粒、pF‑VLH3质粒和pF‑VLH5质粒加入100μl的DH10Bac感受态细胞中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，各加入900μl不含Amp的LB液体培养基，37℃培养5小时。分别取100μl菌液稀释81倍后，取100μl稀释的菌液涂布到含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X‑gal以及IPTG的LB固体培养基上，37℃培养48小时。
[0234] 2.挑选单克隆分别使用接种针挑取大的白色菌落，然后在含有庆大霉素、卡那霉素、四环素、X‑gal以及IPTG的LB固体培养基上划线，37℃培养48小时，然后挑取单菌落接种含有庆大霉素、卡那霉素、四环素的LB液体培养基培养，保存菌种，抽提质粒。分别获得重组质粒Bacmid‑MGC1、Bacmid‑MGC2、Bacmid‑MGC3、Bacmid‑VLH3和Bacmid‑VLH5。
[0235] 实施例7重组杆状病毒转染
[0236] 六孔板中每个孔接种0.8×106个Sf9细胞，细胞汇合度为50～70％。对于每一个孔制备以下的复合物：用100μl转染培养基T1稀释4μl的Cellfectin转染试剂，短暂的漩涡震荡；分别用100μl转染培养T1基稀释3μg实施例6中的重组Bacmid‑MGC1、Bacmid‑MGC2、Bacmid‑MGC3、Bacmid‑VLH3和Bacmid‑VLH5质粒，分别将稀释的转染试剂和质粒混合，轻轻吹匀，制备转染混合物。待细胞贴壁后加入上述的转染复合物，27℃孵育5小时，移除上清，添加2ml SF‑SFM新鲜培养基，27℃培养4～5日收获上清。分别获得重组杆状病毒rBac‑
MGC1、rBac‑MGC2、rBac‑MGC3、rBac‑VLH3和rBac‑VLH5，对收获的P1代重组杆状病毒使用MTT
7
相对效力法检测病毒滴度，rBac‑MGC1P1种毒病毒滴度为5.4×10pfu/mL，rBac‑MGC2P1种
7 7
毒病毒滴度为2.3×10pfu/mL，rBac‑MGC3P1种毒病毒滴度为3.4×10pfu/mL，rBac‑VLH3P1
7 7
种毒病毒滴度为3.7×10 pfu/mL，rBac‑VLH5P1种毒病毒滴度为3.9×10pfu/mL。扩增重组
杆状病毒rBac‑MGC1、rBac‑MGC2、rBac‑MGC3、rBac‑VLH3和rBac‑VLH5作为种毒备用。
MGC1、rBac‑MGC2、rBac‑MGC3、rBac‑VLH3和rBac‑VLH5，对收获的P1代重组杆状病毒使用MTT
7
相对效力法检测病毒滴度，rBac‑MGC1P1种毒病毒滴度为5.4×10pfu/mL，rBac‑MGC2P1种
7 7
毒病毒滴度为2.3×10pfu/mL，rBac‑MGC3P1种毒病毒滴度为3.4×10pfu/mL，rBac‑VLH3P1
7 7
种毒病毒滴度为3.7×10 pfu/mL，rBac‑VLH5P1种毒病毒滴度为3.9×10pfu/mL。扩增重组
杆状病毒rBac‑MGC1、rBac‑MGC2、rBac‑MGC3、rBac‑VLH3和rBac‑VLH5作为种毒备用。
[0237] 实施例8SDS‑PAGE检测
[0238] 将实施例7中收获的细胞培养物分别进行SDS‑PAGE检测，同时分别使用感染空杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS‑PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。
[0239] 如图16所示，rBac‑MGC1细胞培养物在分子量约106kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0240] 如图17所示，rBac‑MGC2细胞培养物在分子量约23kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0241] 如图18所示，rBac‑MGC3细胞培养物在分子量约100kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0242] 如图19所示，rBac‑VLH3细胞培养物在分子量约67kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0243] 如图20所示，rBac‑VLH5细胞培养物在分子量约63kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。
[0244] 实施例9Western Blot鉴定
[0245] 分别将实施例8中SDS‑PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗MG阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图21至图
25所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。
25所示，重组杆状病毒表达样品有目的条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达。
[0246] 实施例10间接免疫荧光检测
[0247] 分别向96孔细胞培养板中加入转染过rBac‑MGC1、rBac‑MGC2、rBac‑MGC3、rBac‑5 5
VLH3和rBac‑VLH5的Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓度为2.5×10～4.0×10个/ml)，接种4
孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与鸡源抗MG多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鸡IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图26所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病
毒构建正确。
VLH3和rBac‑VLH5的Sf9细胞悬液，100μl/孔(细胞浓度为2.5×10～4.0×10个/ml)，接种4
孔，27℃静置15分钟，使Sf9细胞贴于培养板底壁，然后每孔加入10μl稀释10倍的毒种。同时设空白细胞对照。接种后细胞置27℃恒温培养箱中培养72～96小时，弃培养液，冷甲醇/丙酮(1:1)固定。首先与鸡源抗MG多抗血清反应，然后与FITC标记的羊抗鸡IgG反应，倒置荧光显微镜观察结果。如图26所示，接种空杆状病毒Sf9细胞不能观察到荧光，而接种了重组杆状病毒Sf9细胞能够观察到荧光，说明目的抗原蛋在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病
毒构建正确。
[0248] 实施例11抗原蛋白血凝检测
[0249] VLH3以及VLH5两个蛋白有血凝效价，使用鸡红血球检测VLH3以及VLH5两个蛋白血凝效价。收获表达VLH3以及VLH5蛋白细胞悬液样品，将样品在‑80℃反复冻融三次后离心取得上清用于检测。在微量板上，从第1孔至12孔，用移液器每孔加入PBS 0.025mL,用移液器吸取被检样品0.025mL,从第一孔起，依次作2倍系列稀释，至最后1个孔，弃去移液器内
0.025mL液体(稀释倍数依次为2,4,8,16,32……)。每孔加入1％鸡红细胞悬液0.025mL，并
设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20～40℃分钟或置2～8
℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈显显著纽扣状时判定结果。使红细胞完全凝集的最
高稀释度作为判定重点。检测显示VLH3以及VLH5两个蛋白的血凝效价分别为1:32和1:32。
0.025mL液体(稀释倍数依次为2,4,8,16,32……)。每孔加入1％鸡红细胞悬液0.025mL，并
设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20～40℃分钟或置2～8
℃40～60分钟，当对照孔中的红细胞呈显显著纽扣状时判定结果。使红细胞完全凝集的最
高稀释度作为判定重点。检测显示VLH3以及VLH5两个蛋白的血凝效价分别为1:32和1:32。
[0250] 实施例12昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及MGC1、MGC2、MGC3、VLH3和VLH5蛋白的表达定量以及琼扩效价测定
[0251] 在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3‑4天，待浓度长到3‑5×106cell/mL，活力5
大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3‑8×10 cell/mL。当细胞浓度
6
达到3‑55×10 cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3‑55×
6 6
10cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2‑85×10cell/mL时，接种重组杆
状病毒rBac‑MGC1，反应器培养条件为pH值6.0‑6.5、温度25‑27℃、溶氧30‑80％、搅拌速度
100‑180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧
50％、搅拌速度100‑180rpm。在感染之后继续培养5‑9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na2S2O3终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2‑8℃保存疫苗原液。同时以同样的方式制备表达MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白的疫苗原液。
大于95％时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3‑8×10 cell/mL。当细胞浓度
6
达到3‑55×10 cell/mL时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3‑55×
6 6
10cell/mL，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2‑85×10cell/mL时，接种重组杆
状病毒rBac‑MGC1，反应器培养条件为pH值6.0‑6.5、温度25‑27℃、溶氧30‑80％、搅拌速度
100‑180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧
50％、搅拌速度100‑180rpm。在感染之后继续培养5‑9天后，加入千分之一终浓度BEI，37℃作用48h后，加千分之二终浓度Na2S2O3终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2‑8℃保存疫苗原液。同时以同样的方式制备表达MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白的疫苗原液。
[0252] 制备的上述疫苗抗原中MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5的蛋白含量分别使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释鸡抗鸡毒支原体多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体‑MGC1蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗‑即HRP标记的羊抗鸡IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H2SO4终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中MSPA蛋白的量。
[0253] 同样方法分别检测待检样品中MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白的含量。
[0254] 按照实施例12，大规模制备的MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白，Elisa检测结果如下表，从表中结果可以看出，疫苗原液中五个蛋白的平均含量分别约163mg/L、210mg/L、182mg/L、156mg/L和231mg/L。
[0255] 制备的疫苗抗原中，分别使用琼扩效价法检测MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白：分别在5块琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入鸡毒支原体抗血清，5块板周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5次方的5种疫苗原液。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价琼扩效价检测结果。疫苗原液中MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白的琼扩效价分别为1:16、1:32、1:32、1:16、1:32。
[0256] 实施例13疫苗的制备
[0257] 取实施例12中表达的五种疫苗原液进行混合，使得这5个抗原蛋白每个抗原的浓度达到30mg/mL，然后将混合好的疫苗原液与油佐剂按照2：3的比例配置成油乳剂疫苗。具体的，每1L的混合疫苗原液加入白油1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后用乳化破碎机破碎乳化制备成油乳佐剂灭活苗。同时制备分别只含有MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5蛋白中的一种的疫苗，每个抗原浓度为30mg/mL。
[0258] 实施例14免疫实验
[0259] 用21日龄SPF鸡70只，分为7组，每组10支，第一组为阴性对照组，注射PBS；第二组为疫苗组，注射五个抗原混合制备的疫苗，第三到第七组为对照组，分别注射只含有MGC1、MGC2、MGC3、VLH3以及VLH5五个蛋白中的一种的疫苗。各颈部皮下注射实施例13中制备疫苗0.3ml(一羽份)。21日后，以相同剂量和途径进行第2次接种。第2次接种后21日，所有鸡采血，检测血凝抑制(HI)抗体效价，将采完血的鸡喷雾攻击鸡毒支原体强毒株SN1株600ml
8 9
(10‑10ccu/ml)，喷雾持续时间不少于5分钟，雾滴在2μm左右。观察14日，剖检，观察气囊病变，并对病变进行计分，统计出现2分以及以上病变的鸡的数目，计算保护效率。HI效价以及保护率见下表，阴性对照组10支鸡全部出现3分以上病变，其中出现8只4分气囊严重出现病变的鸡，发病率为100％；五个抗原制备的疫苗免疫组所有鸡气囊病变小于2分，其中完全没有病变的鸡的数目为8，出现1分病变的鸡的数目为2，保护率为100％。其余五个只含有一个抗原的疫苗免疫组，保护率为70％‑80％不等，有的还出现了病变程度为4分的较严重病变，保护效力较五个抗原制备的疫苗免疫组要差。说明本发明制备的疫苗气囊保护率为100％，疫苗效力合格。
8 9
(10‑10ccu/ml)，喷雾持续时间不少于5分钟，雾滴在2μm左右。观察14日，剖检，观察气囊病变，并对病变进行计分，统计出现2分以及以上病变的鸡的数目，计算保护效率。HI效价以及保护率见下表，阴性对照组10支鸡全部出现3分以上病变，其中出现8只4分气囊严重出现病变的鸡，发病率为100％；五个抗原制备的疫苗免疫组所有鸡气囊病变小于2分，其中完全没有病变的鸡的数目为8，出现1分病变的鸡的数目为2，保护率为100％。其余五个只含有一个抗原的疫苗免疫组，保护率为70％‑80％不等，有的还出现了病变程度为4分的较严重病变，保护效力较五个抗原制备的疫苗免疫组要差。说明本发明制备的疫苗气囊保护率为100％，疫苗效力合格。
[0260] 表21鸡毒支原体基因工程疫苗攻毒效力检验结果
[0261]
[0262]
[0263] a:HI效价为计算的平均值。
[0264] b：按照以下的标准给气囊病变程度打分，
[0265] 0分——正常的气囊，清洁透明而薄；
[0266] 1分——气囊稍有增厚和轻度浑浊，局部有少数灰色或者黄色渗出物斑点；
[0267] 2分——部分气囊区域有可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有气囊中度增厚；
[0268] 3分——大片气囊布满黄色干酪样渗出物；
[0269] 4分——整个气囊布满黄色干酪样渗出物，气囊失去弹性；
[0270] c：保护率计算公式
[0271] 保护率＝气囊病变程度小于2分的鸡的数目/总的鸡的数目。
[0272] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
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