分泌沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及应用

摘要

本发明公开了一种可以特异性结合沙丁胺醇的高亲和力单克隆抗体及其可变区氨基酸序列。本发明还提供了一株可以产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系(沙丁S‑846‑10)。本发明所述抗体具有特异性识别并结合沙丁胺醇抗原的能力，可用于沙丁胺醇的检测。

权利要求

1.分泌沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO：C2018154；所述杂交瘤细胞株分泌沙丁胺醇单克隆抗体，所述沙丁胺醇单克隆抗体包括如SEQ ID NO.1所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的轻链可变区氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备沙丁胺醇检测试剂盒中的应用。

说明书

分泌沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株特异性结合沙丁胺醇的高亲和力单克隆抗体及其可变区氨基酸序列，以及分泌该抗体的细胞株和应用。

背景技术

[0002] 沙丁胺醇(salbutamol)是一种短效β2肾上腺素受体激动剂，用作平喘药，能有效地抑制组胺等致过敏性物质的释放，防止支气管痉挛。适用于支气管哮喘、喘息性支气管
炎、支气管痉挛、肺气肿等症。添加微量沙丁胺醇于牲畜饲料内，可以增加牲畜的瘦肉量及
换肉率、减少脂肪，但是其毒性远高于具有相同功能的莱克多巴胺。

[0003] 近年来，我国发现或查处的沙丁胺醇违法添加案件仍时有发生，严重影响了我国畜牧业发展，破坏了行业信誉，并对人民群众身体健康造成了潜在危害。随着国家对食品安
全日益重视，不断加大违法违规行为打击力度，沙丁胺醇违法添加行为已大有收敛，整治效
果显著。

[0004] 目前，国家及行业标准规定的沙丁胺醇权威检测方法为液相色谱-质谱技术。此方法灵敏度高、特异性强，可靠性好；但是依赖大型仪器，操作繁琐费时，成本较高，不能广泛
推广使用。另外，基于抗原-抗体特异性结合的免疫学分析技术也可以被用于沙丁胺醇的检
测，该方法灵敏度、特异性较好，不依赖于大型仪器，操作方便、时间短、成本低，是一种易于
现场即时使用的检测技术。目前市场上有基于免疫层析等方法的多种沙丁胺醇检测试剂或
试纸卡片在售。

[0005] 基于免疫反应的检测方法核心是特异性识别沙丁胺醇的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测试剂盒的质量，因此好的抗沙丁胺醇单克隆抗体的研制是该
类检测试剂盒开发的关键前提。

发明内容

[0006] 本发明提供了一株可以分泌特异性识别并高亲和力结合沙丁胺醇的单克隆抗体的细胞株。命名为杂交瘤细胞株沙丁S-846-10。该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型
培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC NO：
C2018154。

[0007] 本发明还提供了上述细胞株分泌的可以特异性识别并高亲和力结合沙丁胺醇的单克隆抗体。

[0008] 所述的单克隆抗体的可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链：

[0009] SEQ ID NO.1：

[0010] EVQLQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDHAWNWIRQFPGNKLEWMGNINYSGRTSYNPSLKSRLSITRDTSKNQFFLQLNSVTNEDTATYFCTVDDWYFEVWGAGTTVTVSS

[0011] SEQ ID NO.2：

[0012] NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMRCQSSQSLLYSSNQKNFLAWYQQKPGQSPELLIYWASTRASDVPDRFTGSGSGTDFNLTISSVQAADLAVYYCLQYLSSRTFGGGTKLELK

[0013] 本发明还提供了上述细胞株或抗体在制备沙丁胺醇检测试剂盒中的应用，进行沙丁胺醇含量测定。

[0014] 相比于现有技术，本发明的有益效果在于：首次获得高效结合沙丁胺醇抗原的单克隆抗体可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供
了序列基础。

附图说明

[0015] 图1抗沙丁胺醇ELISA效价检测。

[0016] 图2可变区cDNA的5’race PCR结果，红色箭头表示目的片段。M：分子量标记；1：轻链可变区；2：重链可变区。

具体实施方式

[0017] 以下为该抗体具体制备过程。如无特殊说明，本发明所述实验过程所用试剂、材料均为常规商品化试剂和材料，所用方法为标准实验方法(具体细节参照《抗体技术实验指
南》(E.哈洛著科学出版社2005)和《抗体制备与使用实验指南》G.C.霍华德著科学出版社
2010)，所提及学术专用名词及其英文缩写如无特殊说明均按照全国科学技术名词审定委
员会编《免疫学名词》(科学出版社2008)的规定使用。

[0018] 沙丁胺醇半抗原(沙丁胺醇BSA偶联物，简称Sal-BSA)购买自深圳安提生物。

[0019] 小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0购自中科院细胞库。

[0020] 实施例1动物免疫

[0021] 实验动物采用Balb/c品系雌性6周龄小鼠。免疫流程：用RAC-BSA与Freund’s完全佐剂混合，乳化后，皮下多点注射进行免疫。RAC-BSA的剂量为0.1mg/次/只。首次免疫用完
全Freund’s佐剂，再次免疫用不完全Freund’s佐剂。每次免疫的间隔时间为3周，共3次免
疫。第三次免疫后，进行细胞融合前对小鼠进行回忆刺激，0.1mg抗原溶解于0.5ml PBS缓冲
液中，腹腔注射。回忆刺激后3天，进行细胞融合和杂交瘤构建。

[0022] 实施例2杂交瘤细胞株构建

[0023] 细胞融合前一天制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的
成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。

[0024] (1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液(RPMI1640)洗涤2次。

[0025] (2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

[0026] (3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

[0027] (4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

[0028] (5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

[0029] (6)在室温下融合：30秒内加入预热的1ml 45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入
1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

[0030] (7)离心，800rpm，6分钟。

[0031] (8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

[0032] (9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

[0033] (10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。

[0034] (11)在融合24小时后，加HAT选择培养液。用时1ml加入50ml 20％小牛血清完全培养液中。37℃、5％CO2培养3-7天。该细胞株于2018年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中
心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018154。

[0035] 实施例3杂交瘤细胞株的单克隆化(有限稀释法)

[0036] (1)制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞
5
(3T3)1×10/ml，均为100μl/孔。

[0037] (2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103/ml

[0038] (3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞
数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲
养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

[0039] (4)培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。

[0040] (5)第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

[0041] (6)采用有限稀释法连续克隆阳性杂交瘤细胞3次。构建稳定细胞株，并扩大培养、冻存。

[0042] 实施例4抗体生产

[0043] (1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。

[0044] (2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次，1 000r/min离心10min。

[0045] (3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用不完全培养液配成1.0×107细胞/ml的悬液。

[0046] (4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。

[0047] (5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1～3天取1次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。

[0048] 实施例5抗体纯化

[0049] (1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1×105转离心30min，去沉淀。

[0050] (2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

[0051] (3)此溶液置冰中30min～60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。

[0052] (4)将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。

[0053] (5)装入透析袋于Tris－HCl缓冲液(20mMol/L NaCl)中透析除盐。

[0054] (6)离心去沉淀。

[0055] (7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量：1A 280unit＝0.8mg蛋白质。

[0056] 一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg～36mg。

[0057] (8)过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为1ml～2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。
大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于
120mMol/L～150mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

[0058] 实施例6检测沙丁胺醇抗原识别(ELISA)

[0059] (1)抗原包被。取抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度的包被液，混匀。加入96孔ELISA检测板，100ul/孔。置于4℃冰箱内过夜。

[0060] (2)封闭。洗板。加封闭液(0.5％BSA溶于PBS)，200ul/孔。37℃温箱温育2小时。

[0061] (3)加一抗(待测样品)。洗板。将处理好的一抗溶液[细胞融合后杂交瘤细胞培养上清液(实施例2中第11步所描述上清液)，或免疫抗原的小鼠血清(完成实施例1免疫程序7
天后采用尾静脉采血分离制备的小鼠血清)稀释液，或实施例5纯化后的抗体]加到孔内，
100ul/孔。37℃温箱温育2小时。

[0062] (4)加二抗。洗板。稀释好的二抗(商品化羊抗鼠Ig-HRP，如：ab6789，abcam，1:2000稀释使用)加入孔内。100ul/孔。37℃温育1小时。

[0063] (5)显色。洗板。配好TMB底物，加入孔中，100ul/孔。显色5～10min。加2M硫酸100ul/孔终止反应。

[0064] (6)检测。用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度OD值。得到数据。

[0065] ELISA检测结果表明，三种抗体对沙丁胺醇抗原具有特异性识别活性，最低稀释度达到了1:128000以上。

[0066] 实施例7抗体基因序列获得

[0067] (1)RNA抽提

[0068] 胰酶消化至沙丁S-846-10细胞悬浮，1000rpm，5min离心，PBS洗涤两次，血球计数板确定细胞至107；加入1ml TRI REAGENT(Sigma-Aldrich)裂解，用微量移液器吹打混匀，
室温5min之后加入200ul氯仿(剧烈摇匀，室温5min,冰上5min)；高速离心12000g，15min，4
℃之后，取水相(600ul)加入等体积异丙醇(室温5min，冰上5min)，加完异丙醇立即上下颠
倒5－10次混匀；高速离心12000g，15min，4℃，倾倒除去上清，并用移液器吸干；1ml 75％乙
醇清洗一次，吹打均匀，离心7500g，5min，4℃去上清；在空气室温下干燥20min，加入50ul 
ddH2O(DEPC treated)；检测OD值，1％agarose电泳以确定RNA的质量和浓度。

[0069] (2)RT-PCR与5’race PCR

[0070] 将反转录引物Random Primer和RNA按比例混匀后，70℃水浴10min，冰浴2-3min；然后加入反转录系统其他试剂(Thermo Scientific Fisher)，37℃水浴1.5h，95℃水浴
5min，冰浴，-20℃冻存。反转录后用持家基因HPRT引物进行聚合酶链式反应(PCR)，检测RNA
反转录所得到的cDNA质量。

[0071]

[0072] 5′race PCR利用TdT酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上3-5个(dG)残基；然后用含有部分接头序列的通用引物Poly C(Universal 
Primer)作为上游引物，用基因特异引物作为下游引物，以G-cDNA为模板进行PCR，扩增目的
基因5′末端的cDNA片段。获得cDNA之后，取1ul的cDNA加入3ul的dGTP和2ul的TdT酶
(Promega)，在37℃温浴15分钟后迅速放入70℃温浴10分钟，即获得了加G尾的cDNA。

[0073] 在50ul的PCR反应体系中，加入1ul的G尾cDNA模版、1ul的PolyC和特异性引物(表1)，在0.5ul的Taq Platium(Qiagen)的作用下进行扩增延伸；

[0074] 表1扩增抗体可变区基因引物序列

[0075]

[0076] 反应条件为：

[0077]

[0078] (3)酶切、连接、转化DH5a

[0079] 胶回收获得PCR产物，在该末端平滑DNA片段的3'末端加上A尾，然后与pGEM-T Vector(Promega)进行连接，16℃连接3h以上用于转化，也可置于4℃连接过夜。

[0080]

[0081] 连接后取出感受态菌DH5a室温放置至半融状态。加入5ul重组质粒，轻搅至混匀。冰浴30min，42℃热休克45－50s，置冰上2－3min。加入500ul Amp－LB液体培养基，37℃摇
床培养20－30min。取菌液300ul涂平板，37℃倒置培养12－16h。在得到一系列菌落后，通过
蓝白斑筛选系统挑取阳性克隆，并且用PCR和酶切系统再次验证是否为阳性菌。获得阳性菌
之后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行质粒测序。测得的结果表明：所述的单克
隆抗体的可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链：

[0082] SEQ ID NO.1：

[0083] EVQLQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDHAWNWIRQFPGNKLEWMGNINYSGRTSYNPSLKSRLSITRDTSKNQFFLQLNSVTNEDTATYFCTVDDWYFEVWGAGTTVTVSS；

[0084] SEQ ID NO.2：

[0085] NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMRCQSSQSLLYSSNQKNFLAWYQQKPGQSPELLIYWASTRASDVPDRFTGSGSGTDFNLTISSVQAADLAVYYCLQYLSSRTFGGGTKLELK。