链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用

摘要

本发明提供链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用。所述亲和柱是以N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将能够高亲和力、高特异性识别链格孢酚的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后的产物作为填料装填亲和柱。本发明的亲和柱可至少重复使用20次，上样体积可达30mL，对链格孢酚有很好的净化和富集效果，主要用于水果、蔬菜、饲料、食品、粮食作物以及其他复杂样本中链格孢霉毒素的净化和富集，以利于后期对样本中该毒素的高效液相色谱和快速检测，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.链格孢酚特异性DNA适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含有权利要求1所述适配体的检测试剂、检测试纸条、检测试剂盒或亲和柱。

3.权利要求1所述适配体的以下任一应用：

(1)在制备链格孢酚适配体亲和柱中的应用；

(2)在制备链格孢酚的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中的应用；

(3)在链格孢酚检测中的应用。

4.链格孢酚适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述适配体与载体进行共价偶联得到的。

5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。

6.根据权利要求5所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，得到氨基修饰的适配体。

7.权利要求6所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)NHS修饰的琼脂糖的制备

①将10-15mL琼脂糖凝胶4FF水洗抽干，于漏斗中依次用30-50％和50-70％丙酮洗涤，最后用二氧六环洗涤数次，抽干，转移到三角瓶中，加入10-15mL二氧六环、100-300μL烯丙基缩水甘油醚和300-1000μL三氟化硼乙醚，30-40下120-180rpm摇床反应45-60min；反应后所得基质依次用30-50％和50-70％丙酮洗涤，最后用去离子水洗涤干净，得到活化基质；

②巯基乙酸羧化：取10-15mL活化基质，加入1.20-2mL巯基乙酸、10-15mL去离子水以及

0.25-0.5g过硫酸铵，60-80℃下反应8-12h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶；

③NHS基团的偶联：取10-15mL巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30-50％、70-90％和

100％丙酮溶液清洗，再用二氧六环清洗数次，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到三角瓶中，加入10-15mL二氧六环、1-5g NHS和1-5g N,N-二环己基碳酰亚胺，25-30℃振荡反应8-12h；最后依次用二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到NHS修饰的琼脂糖，于异丙醇中避光贮存备用；

2)氨基修饰的链格孢酚适配体的制备

在核酸适配体的3’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-，然后在C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体；

3)NHS修饰的琼脂糖的洗涤：取300-500μL所述NHS修饰的琼脂糖于离心管中，用1-

1.5mM盐酸洗涤数次，每次1-2mL，得到洗涤后的载体；

4)适配体复性：取1-5OD所述氨基修饰的链格孢酚适配体溶于Na2HPO4缓冲液200-1000μL中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min，得到复性的适配体溶液；其中，所述Na2HPO4缓冲液为：200mM Na2HPO4，5mM MgCl2，pH 8.0；

5)偶联：向步骤3)洗涤后的载体中加入步骤4)复性的适配体溶液200-1000μL，于25-35℃摇床震荡过夜；

6)封闭：步骤5)所得偶联产物离心去上清后，加入1-5mL封闭缓冲液，于30-40℃摇床震摇反应2-5h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；其中，所述封闭缓冲液为：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0；

7)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液洗涤数次，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1-5mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，所述清洗缓冲液为：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2；所述结合缓冲液为：10mM Tris HCl,120mM NaCl,

5mM KCl,1mM MgCl2；

8)装柱：取容积1-5mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为

1-2cm，加入0.02-0.05％w/v NaN3溶液0.5-3mL，于4-10℃保存。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤8)所述固相萃取柱及下筛板的材质选自聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯；和/或所述下筛板的孔径为10μm。

9.权利要求4-6任一项所述亲和柱的以下任一应用：

①在富集和纯化样品中链格孢酚中的应用；

②在净化样品中链格孢酚中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述样品包括食品、饲料、粮食作物及中药。

说明书

链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，具体地说，涉及链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 链格孢酚(链格孢霉毒素，AOH)是一种由链格孢属真菌产生的次级代谢产物，是一种普遍存在于水果、蔬菜和田间作物等环境中毒素，由于链格孢属真菌可以在低温、潮湿的环境下生长繁殖，因此在冷藏或长途运输过程中水果、蔬菜、谷物等腐烂变质的样品中普遍存在链格孢酚毒素的污染。链格孢酚对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性等慢性或急性毒性作用，AOH具有潜在的基因毒性，当AOH浓度≥1μM时，对人类细胞中DNA的破坏性更强。AOH的真菌毒素特性可以显著抑制拓扑异构酶IIα的活性从而导致DNA链断裂。因此，对链格孢霉毒素的研究引起了科学家们的高度重视。欧盟已就食品与饲料中链格孢霉毒素对人畜的健康风险发布了科学意见。由于链格孢酚化学性质比较稳定，在加工和贮藏过程中即使在高温烹调中仍难以去除，这使得在日常生活中该毒素的形成无法避免，而微量或痕量污染可引起严重毒害，需要高灵敏度，准确可靠的方法进行检测。

[0003] 目前食品、饲料和粮食样品中的链格孢酚检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法、酶联免疫吸附法，毛细管电泳法、液质联用法等。酶联免疫吸附法具有检测特异性好、灵敏度高，并且检测成本较低的优点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用。酶联免疫吸附法的主要问题是容易造成假阳性，这主要与抗体的效价不高，小分子毒素抗体制备困难有关。

[0004] 高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用的食品中毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理过程，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的要求。而传统的前处理技术包括免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，且多为一次性的。因此，建立高选择性、快速有效的样品前处理技术已成为链格孢酚检测分析中亟需解决的重要问题。

[0005] 适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)进行多次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究还处于起步阶段，但是已经表现出一些有别于抗体的优势，如批次间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。

[0006] 基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的。适配体亲和柱结合常规仪器分析已成为真菌毒素分析的一个重要发展方向。

[0007] 目前，国内外报道的适配体亲和柱主要针对赭曲霉毒素，实际应用中难以满足对样品中链格孢酚富集/净化的要求。国内外尚未发现有关链格孢酚适配体亲和柱的报道。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供链格孢酚适配体亲和柱及其制备方法。

[0009] 本发明的另一目的是提供所述链格孢酚适配体亲和柱在富集和纯化，以及净化样品中链格孢酚中的应用。

[0010] 本发明的构思如下：将高特异性、高亲和力的链格孢酚适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到链格孢酚特异性亲和柱填料。装柱后制成高亲和力的适配体亲和柱。

[0011] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供链格孢酚特异性DNA适配体，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0012] 第二方面，本发明提供含有所述适配体的检测试剂、检测试纸条、检测试剂盒或亲和柱。

[0013] 第三方面，本发明提供所述适配体的以下任一应用：

[0014] (1)在制备链格孢酚适配体亲和柱中的应用；

[0015] (2)在制备链格孢酚的检测试剂、检测试纸条或检测试剂盒中的应用；

[0016] (3)在链格孢酚检测中的应用。

[0017] 第四方面，本发明提供链格孢酚适配体亲和柱，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将SEQ ID NO:1适配体与载体进行共价偶联得到的。

[0018] 优选地，所述适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。

[0019] 更优选地，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)或C6间接臂(-(CH2)6-)，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，得到氨基修饰的适配体。

[0020] 第五方面，本发明提供所述亲和柱的制备方法，包括以下步骤：

[0021] 1)NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)修饰的琼脂糖的制备

[0022] ①将10-15mL琼脂糖凝胶4FF水洗抽干，于漏斗(优选砂芯漏斗)中依次用(优选琼脂糖凝胶5-8倍体积的)30-50％和50-70％丙酮洗涤，最后用(优选琼脂糖凝胶5-10倍体积的)二氧六环(分析纯)洗涤5-8次，抽干，转移到三角瓶(优选100mL具塞三角瓶)中，加入10-15mL二氧六环、100-300μL烯丙基缩水甘油醚和300-1000μL三氟化硼乙醚，30-40下120-
180rpm(优选35℃下140rpm)摇床反应45-60min(优选水浴)；反应后所得基质依次用(优选琼脂糖凝胶5-8倍体积的)30-50％和50-70％丙酮洗涤，最后用去离子水洗涤干净，得到活化基质；

[0023] ②巯基乙酸羧化：取10-15mL活化基质，加入1.20-2mL巯基乙酸、10-15mL去离子水以及0.25-0.5g过硫酸铵，60-80℃下反应8-12h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶；

[0024] ③NHS基团的偶联：取10-15mL巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30-50％、70-90％和100％丙酮溶液清洗，再用二氧六环清洗数次(优选5-8次)，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到三角瓶(优选100mL具塞三角瓶)中，加入
10-15mL二氧六环、1-5g NHS和1-5g N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC)，25-30℃振荡反应8-
12h；最后依次用二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到NHS修饰的琼脂糖(作为载体)，于异丙醇中避光贮存备用；

[0025] 2)氨基修饰的链格孢酚适配体的制备

[0026] 在核酸适配体的3’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-，然后在C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体；

[0027] 3)NHS修饰的琼脂糖的洗涤：取300-500μL所述NHS修饰的琼脂糖于离心管(优选容积1.5-2mL的离心管)中，用1-1.5mM盐酸(优选1mM)洗涤数次(优选2-5次)，每次1-2mL，得到洗涤后的载体；

[0028] 4)适配体复性：取1-5OD所述氨基修饰的链格孢酚适配体溶于Na2HPO4缓冲液200-1000μL中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min，得到复性的适配体溶液；其中，所述Na2HPO4缓冲液为：200mM Na2HPO4，5mM MgCl2，pH 8.0；

[0029] 5)偶联：向步骤3)洗涤后的载体中加入步骤4)复性的适配体溶液200-1000μL，于25-35℃(优选30℃)摇床震荡过夜；

[0030] 6)封闭：步骤5)所得偶联产物离心去上清后，加入1-5mL封闭缓冲液(0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0)，于30-40℃摇床震摇反应2-5h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；

[0031] 7)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液(50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2)洗涤数次(优选3-5次)，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1-5mL结合缓冲液(10mM Tris HCl,120mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl2)重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；

[0032] 8)装柱：取容积1-5mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-2cm(优选1cm左右)，加入0.02-0.05％w/v NaN3(优选0.05％w/v)溶液0.5-3mL，于4-10℃(优选4℃)保存。

[0033] 优选地，前述方法中步骤1)-8)如下：

[0034] 1、NHS修饰的琼脂糖的制备

[0035] ①将10mL琼脂糖凝胶4FF水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用琼脂糖凝胶5倍体积的100％二氧六环洗涤5次，抽干，转移到
100mL具塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、100μL烯丙基缩水甘油醚和300μL三氟化硼乙醚，
35℃下140rpm水浴摇床中反应45min。反应后的基质依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和
70％丙酮洗涤，最后用大量去离子水洗涤干净，得到活化基质。

[0036] ②巯基乙酸羧化：取10mL活化基质，加入1.20mL巯基乙酸、10mL去离子水、0.25g过硫酸铵，60℃下反应8h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶。

[0037] ③NHS基团的偶联：取10mL巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30％、90％和100％丙酮溶液清洗，再用100％二氧六环清洗5次，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到100mL带塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、1gNHS和1g DCC，25℃振荡8h；最后依次用大量二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到NHS修饰的琼脂糖载体，于异丙醇溶液中避光贮存备用。

[0038] 2、氨基修饰的链格孢酚适配体的制备

[0039] 在核酸适配体(SEQ ID NO:1)的3’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-，然后在C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。

[0040] 3、NHS修饰的琼脂糖的洗涤：取300μL上述NHS修饰的琼脂糖置于1.5mL离心管中，用1mM盐酸洗涤2次，每次1mL，得到洗涤后的载体。

[0041] 4、适配体复性：取1OD所述氨基修饰的链格孢酚适配体溶于Na2HPO4缓冲液500μL中，于95℃复性5min，然后室温放置30min，得到复性的适配体溶液。

[0042] 5、偶联：向步骤3洗涤后的载体中加入步骤4复性的适配体溶液500μL，于30℃摇床震荡过夜。

[0043] 6、封闭：步骤5所得偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于30℃摇床震摇反应2h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶。

[0044] 7、洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液洗涤5次，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液(作为柱填料)准备装柱。

[0045] 8、装柱：将上述偶联胶悬液用5mL结合缓冲液重悬，然后装入空的SPE柱管中。

[0046] (1)取空的1mL SPE柱管，垫好下方筛板(孔径10μm)，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干。

[0047] (2)加下方出样口堵头，在SPE柱管中加入偶联胶悬液，至胶高度为1cm左右，静止5min，使载体自然沉降。

[0048] (3)加入上方筛板(孔径10μm)，并按压筛板，使其到达载体上方。

[0049] (4)拔掉出样口堵头，用注射器取5mL结合缓冲液，将注射器接在进样口上，缓慢的将结合缓冲液注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒，直至全部液体注入亲和柱。

[0050] (5)加入0.05％NaN3(w/v)缓冲液0.5mL，并加上方进样口堵头后，于4℃冰箱保存。

[0051] 本发明中，所述固相萃取柱及下筛板的材质选自聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯等材料。

[0052] 优选地，所述下筛板的孔径为10μm左右。

[0053] 第六方面，本发明提供所述链格孢酚适配体亲和柱的以下任一应用：

[0054] ①在富集和纯化样品中链格孢酚中的应用；

[0055] ②在净化样品中链格孢酚中的应用。

[0056] 所述样品包括但不限于食品、饲料、粮食作物、中药以及其他复杂样品。

[0057] 本发明链格孢酚适配体亲和柱的结构示意图如图1所示，其工作原理如图2所示。

[0058] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0059] (一)本发明的链格孢酚适配体亲和柱，制备简便，价格低廉，上样体积可达30mL，亲和柱可至少重复使用20次，回收率在85％以上，降低了成本，提高了样品的前处理效率。具有节约成本，节省样品，纯化效率高，可重复使用的优点。样品经过简单的提取后，即可上柱进行净化，一次净化能够除去绝大部分干扰物，净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测。

[0060] (二)本发明充分利用了核酸适配体高特异性、高亲和力的优点，利用链格孢酚适配体特异性结合样品中的链格孢酚，降低了基于抗体的免疫亲和柱经常遇到的交叉反应，亲和柱的净化效率大幅度提高。核酸适配体受操作环境和有机溶剂的影响较小，尤其适合真菌毒素类脂溶性物质的纯化。相比之下，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂的存在常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂可能导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可反复多次使用，大幅度降低了使用成本。

[0061] (三)本发明提供的核酸适配体通过体外化学合成法获得，以核酸适配体代替抗体作为识别元件，与传统的免疫亲和柱相比，能够保证序列的正确性、批间的一致性，大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或兔子，导致抗体间质量差异较大，从而使免疫亲和柱的质量存在批间差。

[0062] (四)N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖发生共价偶联，偶联产物稳定，且偶联率高。

[0063] (五)本发明以筛选到的链格孢酚特异性核酸适配体作为亲和元件，制备用于净化富集链格孢酚的适配体亲和柱。在实际样品检测前去除样品中的杂质，降低了前处理成本和时间，提高前处理的效率，在基层和实验室检测中有广泛的应用前景。

[0064] (六)样品提取液经本发明的适配体亲和柱净化后，所得链格孢酚纯度高，后续无需再做其他纯化处理，可以直接用于高效液相色谱等仪器检测，节省了操作者的时间和费用。

附图说明

[0065] 图1为本发明实施例1中制备的链格孢酚适配体亲和柱的结构示意图；其中，1-进样口塞(进样口堵头)；2-柱体；3-上筛板(上方筛板)；4-载体填料；5-下筛板(下方筛板)；6-出样堵口(出样口堵头)。

[0066] 图2为本发明链格孢酚适配体亲和柱的净化原理。

[0067] 图3为本发明实施例2中链格孢酚适配体亲和柱重复使用次数与回收率测试结果。

[0068] 图4为本发明实施例3中所设计文库的二级结构。

[0069] 图5为本发明实施例3中流式细胞仪检测所建立文库质量的结果。

[0070] 图6为本发明实施例3中样品单链扩增的Q-PCR结果。

[0071] 图7为本发明实施例3中AOH适配体亲和力测定结果。

[0072] 图8为本发明实施例3中适配体特异性检测结果。

[0073] 图9为本发明实施例3中AOH及其结构类似物AME的结构差异。

[0074] 图10为本发明实施例3中以AME为干扰物的AOH特异性检测结果。

具体实施方式

[0075] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0076] 实施例1利用氨基修饰的链格孢酚适配体制备适配体亲和柱

[0077] 1、NHS修饰的琼脂糖的制备

[0078] ①将10mL琼脂糖凝胶4FF水洗抽干，于砂芯漏斗中依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和70％丙酮洗涤，最后用琼脂糖凝胶5倍体积的100％二氧六环洗涤5次，抽干，转移到
100mL具塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、100μL烯丙基缩水甘油醚和300μL三氟化硼乙醚，
35℃下140rpm水浴摇床中反应45min。反应后的基质依次用琼脂糖凝胶5倍体积的30％和
70％丙酮洗涤，最后用大量去离子水洗涤干净，得到活化基质。

[0079] ②巯基乙酸羧化：取10mL活化基质，加入1.20mL巯基乙酸、10mL去离子水、0.25g过硫酸铵，60℃下反应8h，得到巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶。

[0080] ③NHS基团的偶联：取10mL巯基乙酸羧化的琼脂糖凝胶，分别用30％、90％和100％丙酮溶液清洗，再用100％二氧六环清洗5次，得到二氧六环修饰的琼脂糖凝胶；将二氧六环修饰的琼脂糖凝胶转移到100mL带塞三角瓶中，加入10mL二氧六环、1gNHS和1g DCC，25℃振荡8h；最后依次用大量二氧六环、甲醇、丙酮清洗介质，得到NHS修饰的琼脂糖载体，于异丙醇溶液中避光贮存备用。

[0081] 2、氨基修饰的链格孢酚适配体的制备

[0082] 在核酸适配体(SEQ ID NO:1)的3’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-，然后在C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。

[0083] 3、NHS修饰的琼脂糖的洗涤：取300μL上述NHS修饰的琼脂糖置于1.5mL离心管中，用1mM盐酸洗涤2次，每次1mL，得到洗涤后的载体。

[0084] 4、适配体复性：取1OD所述氨基修饰的链格孢酚适配体溶于Na2HPO4缓冲液500μL中，于95℃复性5min，然后室温放置30min，得到复性的适配体溶液。

[0085] 5、偶联：向步骤3洗涤后的载体中加入步骤4复性的适配体溶液500μL，于30℃摇床震荡过夜。

[0086] 6、封闭：步骤5所得偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于30℃摇床震摇反应2h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶。

[0087] 7、洗涤：将上述载体-适配体偶联胶用清洗缓冲液洗涤5次，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液(作为柱填料)准备装柱。

[0088] 8、装柱：将上述偶联胶悬液用5mL结合缓冲液重悬，然后装入空的SPE柱管中。

[0089] (1)取空的1mL SPE柱管，垫好下方筛板(孔径10μm)，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干。

[0090] (2)加下方出样口堵头，在SPE柱管中加入偶联胶悬液，至胶高度为1cm左右，静止5min，使载体自然沉降。

[0091] (3)加入上方筛板(孔径10μm)，并按压筛板，使其到达载体上方。

[0092] (4)拔掉出样口堵头，用注射器取5mL结合缓冲液，将注射器接在进样口上，缓慢的将结合缓冲液注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒，直至全部液体注入亲和柱。

[0093] (5)加入0.05％NaN3(w/v)缓冲液0.5mL，并加上方进样口堵头后，于4℃冰箱保存。

[0094] 实施例1制备的亲和柱结构示意图如图1所示，适配体亲和柱制备和工作原理见图2，重复使用次数与回收率测试结果见图3。本发明链格孢酚适配体亲和柱可重复使用20次以上，平均回收率在85％以上。

[0095] 实施例2利用链格孢酚适配体亲和柱纯化莲子样品中的链格孢酚及其检测[0096] 本实施例通过向莲子样品中定量加入链格孢酚标准品，然后用实施例1制备的链格孢酚适配体亲和柱进行净化，净化后用高效液相色谱-荧光检测器检测，测定回收率。具体如下：

[0097] 1、莲子样品处理

[0098] 1)将莲子样品粉碎。

[0099] 2)分别按照每克样品0.5ng、5ng、50ng的标准，向粉碎后的莲子样品中添加链格孢酚标准品。

[0100] 3)称取5g样品，加入25mL甲醇-水(7:3，v/v)，置于多管振荡器上2500rpm高速匀浆20min。

[0101] 4)取5mL上清液，加入45mL Binding Buffer(结合缓冲液)，涡旋，离心10000rpm，10min，用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液。

[0102] 5)取上述滤液20mL用于上样净化，检测。

[0103] 2、取出链格孢酚适配体亲和柱，打开进样口塞，用5mL结合缓冲液(10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2，pH 7.5)平衡亲和柱，将上述滤液20mL加入亲和柱中，进样口与注射器针筒连接，使液体以1-2滴/秒的流速流出，直至样品全部流出亲和柱。

[0104] 3、用1mL Binding Buffer洗涤亲和柱，向柱中注入2～3mL空气。

[0105] 4、加入1mL甲醇，收集洗脱产物，向柱中注入2～3mL空气。

[0106] 5、再次加入1mL甲醇，该洗脱产物不进行收集。

[0107] 6、取上述收集的洗脱产物，于40℃氮吹仪中氮吹干后，1mL甲醇-水(55:45，v/v)复溶，用0.22μm滤膜过滤后，用于HPLC-荧光检测器(HPLC-FLD)检测。

[0108] 7、高效液相色谱检测结果见表1。

[0109] 表1莲子中链格孢酚含量HPLC-FLD检测结果

[0110]

[0111] 可见，莲子样品经链格孢酚适配体亲和柱纯化后，用HPLC-FLD可以检测到链格孢酚。从检测结果可以看出，在1g粉碎后莲子样品中加入0.5、5和50ng的链格孢酚，用本发明的适配体亲和柱回收率AOH在85.73％-109.56％之间。

[0112] 实施例3链格孢酚特异性DNA适配体的设计及筛选

[0113] 本实施例针对小分子靶标与核酸的结合位点少，分离难度大，不易固定且固定后会对其化学键有很大影响从而导致筛选失败的问题，以固定文库代替固定小分子的传统方法，建立了适宜AOH这类小分子化合物的筛选方法，解决了小分子目标物不易固定和分离难度大的难题。主要原理是将生物素修饰的捕获核酸与文库退火配对上，通过生物素与SA的相互作用，将文库连接到SA磁珠上与靶标孵育，特异性结合的aptamer会被竞争洗脱下来收集结合的核酸扩增，制备单链，用于下一轮筛选。

[0114] 1.设计文库：

[0115] 5′-ATTGGCACTCCACGCATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′

[0116] 文库二级结构见图4。

[0117] 2.文库的固定和筛选：

[0118] (1)取100ul次级文库到PCR管中，加lib10S1CS(100uM,DPBS溶)1.4uL,离心混匀。

[0119] (2)于PCR仪内进行缓慢变复性。PCR仪设置的程序为：95℃10min，以0.1℃/sec降温至60℃，保持1min，再以0.1℃/sec降温至25℃，得到样品池(pool)。

[0120] (3)取70ul SA beads，用DPBS清洗5次，每次200ul。用磁铁垂钓磁珠，除上清。

[0121] (4)将步骤(2)中pool加入到SA beads中，室温摇床孵育0.5h。

[0122] (5)用磁铁垂钓磁珠，除上清。用DPBS(98ul DPBS+2uL甲醇)清洗6遍，每遍200ul。用磁铁垂钓磁珠，除上清。上清记为wash1、wash2、wash3、wash4、wash5和wash6。

[0123] (6)取少量磁珠，用流式细胞仪检测文库的质量。结果见图5。

[0124] (7)用荧光光谱仪检测加入磁珠前后，pool浓度的变化，用Q-pcr定量漂洗过程中，文库从磁珠上解离的情况见表2。

[0125] 表2荧光光谱仪测定文库固定效果

[0126]

[0127] (8)加入100ulAOH溶液(2uLAOH加到98ul DPBS中，AOH终浓度为100uM)到SA beads中。混匀，室温摇床孵育1h。磁铁垂钓磁珠，回收上清，即为elution 1。

[0128] (9)Q-PCR检测。40ul mix加入样品1ul。单链扩增的Q-PCR结果见图6。

[0129] (10)收集结合的核酸扩增，制备单链，用于下一轮筛选。通过6轮筛选获得最终的适配体并进行测序(SEQ ID NO：1)。

[0130] 3.筛选获得的适配体的亲和力和特异性测定

[0131] 采用荧光法检测亲和力，由于AOH有激发波长，可通过检测荧光来检测适配体和目标毒素的亲和力，若发现荧光增强的现象，可以说明AOH与DNA有结合。

[0132] (1)AOH的终浓度为1uM，单克隆按照下表的终浓度稀释加样，每个样品体积为100uL，稀释缓冲液为DPBS。每个样品做三个重复。

[0133]对照克隆15nM aptamer1 15nM aptamer2 15nM aptamer3 15nM
对照克隆31nM aptamer1 31nM aptamer2 31nM aptamer3 31nM
对照克隆62nM aptamer1 62nM aptamer2 62nM aptamer3 62nM
对照克隆125nM aptamer1 125nM aptamer2 125nM aptamer3 125nM
对照克隆250nM aptamer1 250nM aptamer2 250nM aptamer3 250nM
对照克隆500nM aptamer1 500nM aptamer2 500nM aptamer3 500nM
对照克隆1000nM aptamer1 1000nM aptamer2 1000nM aptamer3 1000nM|[0134] (2)酶标仪扫描，350nm激发，检测440nm处发射荧光，得到的数据将三个重复的孔求平均值。获得的AOH适配体亲和力测定结果见图7。

[0135] (3)用荧光法以其他5种毒素为干扰物测定适配体的特异性。适配体特异性检测结果见图8。

[0136] 对于AOH和其结构类似物交链格孢酚单甲醚AME之间在化学结构上只有一个甲基的差别(图9)，但筛得的适配体对两种化合物的亲和力差异显著，证明本发明筛选到的适配体具有非常好的特异性(图10)。

[0137] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。