耐热基因CRY1及其应用、酵母菌及酵母菌的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种耐热基因CRY1及其应用、酵母菌及酵母菌的制备方法和应用，耐热基因CRY1是一种可激发植物、酵母菌和人类细胞的热激反应，提高耐热性的基因，可应用于提高植物、动物和微生物耐高温能力、提高微生物对毒性蛋白抗性。本发明还提供了一种转入有耐热基因CRY1的酵母菌，该酵母菌的制备方法为：由CRY1序列的PCR扩增产物与载体连接得到的重组子转化至大肠杆菌中，提取质粒；将质粒DNA与变性后的鲑鱼精DNA转化至感受态酵母中得到含有pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS的耐热酵母菌。该耐热酵母菌具有较强的高温耐受能力，可以避免高温对发酵风味和代谢产物产量的影响，在食品、医药等领域具有较大前景。

权利要求

1.一种耐热基因CRY1在提高动物和微生物耐高温能力中的应用，其特征在于，所述耐热基因CRY1基因的DNA序列由SEQ ID NO.1所示。

2.一种耐热基因CRY1在增强微生物蛋白质内稳态中应用，其特征在于，所述耐热基因CRY1基因的DNA序列由SEQ ID NO.1所示，所述微生物为酵母菌。

说明书

耐热基因CRY1及其应用、酵母菌及酵母菌的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及耐热基因CRY1及其应用、酵母菌及酵母菌的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近百年来，全球气候呈现出变暖的趋势，气候变化会诱发作物发生热害的可能性增加，会严重影响农作物的产量，影响我国的粮食安全。

[0003] 由于植物固定在土地上不能移动，它们必须整合周围的环境信号，通过调整生长发育和新陈代谢来适应环境的变化。植物对环境中光和温度的感知尤为重要。植物对光的感知是通过一系列光感受器来实现的。高等植物在长期的进化过程中形成了一整套精细的光受体系统和光信号转导系统，在光形态建成中参与光信号的接收、传递及转导。模式植物拟南芥中，研究较多的光受体有光敏色素（Phytochrome, PHYs），感受红光和远红光；隐花色素（Cryptochrome, CRYs），感受蓝光及紫外光‑A（UV‑A），其中CRY1是蓝光受体。

[0004] 植物通过热激反应来感知温度和进行信号转导，从而适应环境。热胁迫会使蛋白解折叠、错误折叠或者降解，这会造成很严重的细胞毒性。热激反应是动植物细胞或器官对热胁迫的一种自我保护机制。面对热胁迫，细胞会调节分子伴侣来使蛋白质稳定、再折叠、分类，降解蛋白质来恢复蛋白质内稳态。

[0005] 热激因子（HSF）可以调节分子伴侣的表达，是热激反应的主要调节者。拟南芥中发现有21个热激家族基因，人类细胞中有4个热激家族基因，而酵母中有一个。拟南芥中的研究发现分子伴侣基因大多受光周期调节。前人的研究表明，在光照下拟南芥HSF家族蛋白HsfA1d会进入到细胞核中。而且光被证明可以加强激活内质网未折叠蛋白应答。但是植物中是否存在光和热激反应的直接信号通路仍然不十分清楚。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐热基因CRY1，CRY1基因是一种可激发植物、酵母菌和人类细胞的热激反应，提高耐热性的耐热基因；可应用于提高植物、动物和微生物耐高温能力。还提供了含有该耐热基因CRY1的酵母菌，及酵母菌的制备方法，该酵母菌对高温的耐受能力更强，可以避免高温对发酵风味和代谢产物产量的影响，在食品、医药等领域具有较大的应用前景。

[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种耐热基因CRY1，所述耐热基因CRY1基因的DNA序列由SEQ ID NO.1所示。

[0008] 做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的耐热基因CRY1在提高植物、动物和微生物耐高温能力中的应用。

[0009] 做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种酵母菌，所述酵母菌转入有上述的耐热基因CRY1和核定位信号。

[0010] 上述的酵母菌，优选的，所述核定位信号为NLS。NLS可以帮助蛋白质进入细胞核。

[0011] 做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述酵母菌的制备方法，包括以下步骤：

[0012] S1、根据CRY1基因序列设计引物对，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增得到PCR扩增产物；

[0013] S2、用XhoⅠ和BamHⅠ同时双酶切载体pNH604‑mKate‑NLS和PCR产物，然后用T4连接酶连接得到重组子，

[0014] S3、将所述重组子进行转化至大肠杆菌中，提取pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS质粒；

[0015] S4、将所述pNH604‑CRY1‑ mKate‑NLS质粒DNA与变性后的鲑鱼精DNA转化至感受态酵母中得到含有pNH604‑CRY1‑NLS基因的耐热酵母菌。

[0016] 上述的制备方法，优选的，所述S1中所述引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0017] 做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述酵母菌在制备发酵制品中的应用。

[0018] 上述发酵制品包括食品、药品。

[0019] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0020] （1）本发明提供了一种耐热基因CRY1，该耐热基因首先在拟南芥中发现。在光照条件下，拟南芥中CRY1基因编码的蛋白隐花色素CRY1蛋白能够和热激蛋白HSFA1d结合性形成复合体，并转移到细胞核中，激发热激反应，提高拟南芥耐热性。同时，CRY1基因在酵母菌和人类细胞中均可以激发热激反应，提高细胞的耐热性。因此，CRY1基因是一种可激发植物、酵母菌和人类细胞的热激反应，提高耐热性的耐热基因，为提高植物、酵母菌和人细胞耐热性提供了新的理解和可能途径。

[0021] （2）本发明提供了一种耐热基因在提高植物耐高温能力中的应用，避免了全球气候变暖，导致热害导致植物减产的风险，提高了植物的抗热害能力。

[0022] （3）本发明提供了一种耐热基因在提高微生物耐高温能力中的应用，微生物对高温敏感，例如酵母菌，高温可以使酵母菌活性降低，发酵风味和产率降低。当微生物中转入了耐热基因后，对高温的抗性提高，可以提高微生物对高温的适应性，为今后的基因工程、发酵工程等领域提供了方便。

[0023] （4）本发明提供了一种耐热基因在提高微生物对毒性蛋白抗性中应用。微生物面对高温等逆境胁迫时细胞内蛋白的合成、折叠、运输、聚集、解集和降解通路会发生异常，内稳态遭到破坏，产生毒性蛋白。CRY1会激发细胞内的热激反应，热激反应会激活HSF104等分子伴侣的转录，这些分子伴侣会和毒性蛋白结合，帮助毒性蛋白恢复蛋白质内稳态，进而提高了微生物对毒性蛋白的抗性。

[0024] （5）本发明提供了一种耐热酵母菌，酵母同时也是遗传工程和细胞周期研究的模式生物，可以应用在酿造工艺和基因工程上。

[0025] （6）本发明提供了一种耐热酵母菌在提高酿造过程中温度耐受性的应用，高温可导致酵母菌的活性会大幅度降低，影响发酵风味，代谢产物的产量降低。如果采用耐热酵母菌，其对高温的耐受能力更强，可以避免高温对发酵风味和代谢产物产量的影响，对食品、医药等领域具有较大帮助。

附图说明

[0026] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

[0027] 图1为本发明实施例1中用不同波长范围的光对拟南芥幼苗进行预处理，再进行45℃热激处理的结果图。

[0028] 图2为本发明实施例1中对不同的光受体缺失突变体进行45℃热激处理的结果图。

[0029] 图3 为本发明实施例2中含有CRY1基因的植物高温处理后的植物成活情况；图3A为单子叶植物小麦经过高温处理后的植物成活情况，图3B为双子叶植物油菜经过高温处理后的植物成活情况。

[0030] 图4为本发明实施例3中含有CRY1基因的微生物热激反应后的流式细胞图。

[0031] 图5为本发明实施例4中含有CRY1基因的人纤维母细胞中的热激反应结果图。

[0032] 图6为本发明实验例1中不同酵母菌株在50℃热激处理后存活能力结果图。

[0033] 图7为本发明实验例2中不同酵母菌株在热激反应后荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况。

具体实施方式

[0034] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

[0035] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

[0036] 实施例1：

[0037] 一种耐热基因CRY1，其基因序列为如SEQ ID NO.1所示，具体为：

[0038] ATGTCTGGTTCTGTATCTGGTTGTGGTTCTGGTGGTTGTAGTATTGTATGGTTTAGAAGAGATCTTAGGGTTGAAGATAATCCAGCTTTAGCAGCAGCAGTAAGAGCTGGTCCAGTGATT GCTCTGTTTGTTTGGGCACCAGAAGAAGAAGGACACTATCATCCAGGTAGGGTTTCTAGGTGGTGGCTCAAGAACAGTTTGGCTCAGCTTGATTCTTCTCTTAGAAGTCTTGGTACTTGTCTTATCACCAAGAGATCTACTGATAGTGTTGCTTCTCTTCTTGATGTTGTTAAATCCACT GGTGCTTCTCAGATCTTCTTCAACCATTTGTATGATCCATTGTCTTTGGTGCGTGATCACCGAGCTAAAGATGTTTTGACGGCGCAAGGCATAGCGGTTCGATCATTCAACGCAGACTTG CTTTATGAGCCATGGGAAGTGACTGATGAATTAGGCCGTCCTTTCTCTATGTTTGCTGCG TTTTGGGAGAGATGTCTTAGTATGCCTTATGACCCTGAGTCTCCTCTTCTTCCACCTAAG AAGATCATTTCAGGGGATGTGTCTAAATGTGTTGCGGATCCATTGGTGTTTGAGGATGACTCTGAGAAAGGAAGCAATGCACTTCTGGCTCGTGCTTGGTCTCCTGGATGGAGTAATGGTGATAAAGCTCTCACAACGTTTATAAACGGTCCATTGCTTGAATACTCTAA GAACCGCAGA AAAGCCGATA GTGCTACAAC CTCGTTTCTTTCTCCACACT TGCATTTTGG GGAAGTGAGTGTGAGAAAAGTTTTTCATCTTGTTCGGATCAAACAGGTCGCGTGGGCAAACGAAGGAAACGAGGCCGGGGAAGAAAGCGTGAATCTTTTCCTGAAATCTATTGGTCTCAGGGAGTATTCTAGGTACATAAGTTTTAACCATCCATATTCCCATGAAAGACCACTTCTTGGCCATCTAAAGTTCTTCCCTTGGGCTGTGGATGAGAACTATTTCAAGGCATGGAGGCAAGGCCGGACTGGATATCCGTTGGTCGATGCCGGGATGAGAGAGTTATGGGCTACTGGTTGGTTGCATGATCGCATAAGAGTAGTTGTTTCAAGCTTCTTTGTTAAAGTGCTTCAATTACCATGGAGATGGGGGATGAAGTATTTCTGGGACACACTTCTTGATGCGGATTTAG AAAGCGATGCTCTTGGTTGGCAATACATTACCGGTACTCTCCCGGATAGCCGGGAGTTTGATCGCATAGATAACCCTCAGTTTGAAGGGTACAAGTTTGATCCAAATGGTGAATACGTAAGGCGATGGCTTCCTGAACTCTCTAGACTCCCGACAGACTGGATACATCATCCGTGGAACGCACCTGAGTC CGTTCTTCAAGCTGCTGGTATCGAGCTTGGATCAAACTATCCTCTACCAATTGTAGGATTAGACGAAGCA AAAGCACGGCTTCATGAAGCGCTTTCACAGATGTGGCAACTAGAAGCTGCTTCAAGAGCTGCAATAGAGA ACGGATCCGAAGAAGGACTTGGAGATTCTG CTGAGGTAGAGGAAGCTCCTATAGAGTTCCCAAGGGACATTACAATGGAAGAGACTGAACCAACCAGACTCAACCCAAACAGGAGATATGAGGATCAGATGGTTCCAAGCATTACTTCTTCTTTGATCAGACCTGAAGAAGACGAAGAGTCGTCTCTTAATTTGAGAAATTCAGTAGGAGATAGCAGAGCAGAGGTTCCAAGGAACATGGTTAACACCAACCAAGCTCAGCAGCGGAGAGCAGAACCGGCTTCAAACCAAGTCACTGCTATGATTCCAGAATTTAATATCAGAATTGTTGCAGAGAGCACTGAAGACTCAACAGCGGAATCTTCCAGCAGCGGAAGGAGAGAAAGAAGCGGAGGCATAGTCCCCGAGTGGTCTCCAGGGTACTCAGAGCAGTTCCCTAGTGAAGAAAATGGTATTGGAGGAGGAAGTACAACGTCTAGCTACTTGCAGAATCACCATGAAATACTGAACTGGAGACGGCTTTCACAAACCGGGTAA。

[0039] 上述耐热基因CRY1是从拟南芥中发现的。我们发现，光可以诱导植物的获得性耐热性。植物所吸收的白光是由不同的光质组合而成。为了了解具体是哪一波长范围的光可以诱导植物的获得性耐热性，用不同波长范围的光：红光、远红光和蓝光对拟南芥幼苗进行预处理，再进行45℃热激处理。结果参见图1，从图1中可知：采用蓝光预处理的拟南芥在45℃热激下依然生长良好，而采用红光和远红光处理的拟南芥在热激处理下生长较差，证明采用蓝光干预可以使植物具有获得性耐热性。

[0040] 又为证明在蓝光诱导的拟南芥获得性耐热性反应中光受体起了什么作用，本发明对不同的光受体缺失突变体（phyA‑211是远红光受体缺失突变体，该突变体不能感知远红光；phyB‑9为红光受体缺失突变体，不能感知红光；cry1‑304为高强度蓝光受体缺失突变体，不能感受高强度的蓝光，cry2‑1为低强度蓝光受体缺失突变体，不能感知低强度的蓝光）和拟南芥野生型Col‑0进行了白光预处理，再进行45℃热激处理，结果参见图2，图2发现，与其他植株相比，蓝光突变体cry1‑304的存活率大大降低。说明拟南芥该获得性耐热性是由蓝光受体CRY1参与的，该受体蛋白由CRY1基因编码，由此确定CRY1基因为耐热基因。

[0041] 实施例2：

[0042] 一种实施例1中的CRY1基因在提高植物耐热性能方面的应用，其应用方法为：

[0043] 分别将在22℃、黑暗的光照培养箱中生长了4天的单子叶植物小麦，双子叶植物油菜（这两种植物中均含有CRY1基因）的幼苗做了三组处理：

[0044] 第一组继续22℃黑暗处理；

[0045] 第二组给予22℃，1小时的白光处理；

[0046] 第三组给予34℃，黑暗处理。

[0047] 将经过三种处理的幼苗进行50℃致死热胁迫处理2小时，最后置于正常生长条件下生长7天。

[0048] 考察经过高温处理后的植物成活情况。考察结果参见图3。

[0049] 图3A为单子叶植物小麦经过高温处理后的植物成活情况。图3B为双子叶植物油菜经过高温处理后的植物成活情况。从图3中可知，不管是单子叶植物小麦还是双子叶植物油菜，经过第二组光照预处理和第三组34℃高温预处理，植物幼苗的存活率均高于第一组无预处理的植物幼苗，证明含有CRY1基因的植物在经过光照刺激下，可以显著提高植物的耐热性。

[0050] 实施例3：

[0051] 一种实施例1中的CRY1基因在提高微生物耐热性能方面的应用，其应用方法为：

[0052] HSE‑YFP是一个热激反应报告系统，HSE是热激原件，热激反应主效因子HSF1和HSE结合，HSE会启动YFP荧光荧光蛋白的表达，在荧光显微镜下可观察到荧光，可根据荧光蛋白荧光的强弱来判断热激反应的活性程度。

[0053] 将HSE‑YFP报告系统分别转入野生型菌株w303a、转pNH604‑mKate菌株、转pNH604‑CRY1‑mKate菌株和转pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS的酵母菌菌株中（mKate基因编码的蛋白为荧光蛋白，作为CRY1蛋白的标签，可使CRY1基因在细胞内部被观察到），并分别用流式细胞仪测量了各个菌株的荧光强度。

[0054] 检测结果参见图4，从图4中可知：pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS荧光强度明显强于其他菌株，说明拟南芥CRY1基因可以组成型激发酵母中的热激反应，而且只有CRY1在细胞核中才有此反应。

[0055] 实施例4：

[0056] 一种实施例1中的CRY1基因在提高动物耐热性能方面的应用，其应用方法为：

[0057] 将pNH604‑CRY1‑YFP‑NLS和HSE‑mKate报告系统转入人纤维母细胞，荧光显微镜下观察。热激反应报告系统HSE‑mKate荧光强度增强，说明此时热激反应程度强。如果CRY1在细胞核中呈弥散状的非活性状态时，则反之。

[0058] 观察结果参见图5，从图5中可知：到当CRY1在细胞核呈液滴状态时，热激反应报告系统HSE‑mKate荧光强度增强，证明在CRY1基因可激活人纤维母细胞中的热激反应。

[0059] 实施例5：

[0060] 一种耐热酵母菌，其制备方法包括以下步骤：

[0061] （1）感受态酵母菌制备：

[0062] 1.1、将酵母菌W303a划线到YPD平板上，30℃培养2 4d。~

[0063] 1.2、用灭菌的牙签挑取一个菌落至4mL YPD液体培养基中，30℃，250rpm过夜培养。

[0064] 1.3、取125mL灭菌的锥形瓶，加入25mL YPD液体培养基，30℃，250rpm培养4 6h（此~时OD值0.4 0.6）。
~

[0065] 1.4、在无菌工作台中将培养好的菌液倒入50mL离心管中，4℃，2000g离心5min。

[0066] 1.5、弃上清，沉淀用1mL 1xLi/TE重悬浮，转移至1.5mL 毫升无菌离心管中，4℃，2000g离心5min。

[0067] 1.6、弃上清，沉淀用200μL 1xLi/TE重悬，得到感受态酵母w303a。

[0068] （2）pNH604‑CRY1‑NLS质粒制备：

[0069] 2.1、设计引物对：

[0070] F（SEQ ID NO.2）：GGCTACCTCGAGATGTCTGGTTCTGTATCTGG，

[0071] R（SEQ ID NO.3）：GGCTACGGATCCCCCGGTTTGTGA AAGCCGTC。

[0072] 2.2、以拟南芥cDNA为模板，通过上述引物对，扩增CRY1基因，琼脂糖凝胶电泳和胶回收，得到目的片段长度2067bp的PCR产物。

[0073] 2.3、用XhoⅠ和BamHⅠ同时双酶切载体pNH604‑mKate‑NLS（由申请人实验室保存）和PCR产物。

[0074] 2.4、将酶切后的PCR产物和酶切后载体通过T4连接酶连接，进行大肠杆菌转化，挑选阳性克隆，提质粒测序，测序正确得到pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS质粒。

[0075] （3）耐热酵母菌制备：取100ng pNH604‑CRY1‑ mKate‑NLS质粒DNA和5μl变性后的鲑鱼精DNA至50μl步骤（1）制备的感受态酵母w303a中，再加入250μl PEG/LiAC转化液，用移液器吹打混匀，30℃水浴30min。然后加入20μl DMSO，40℃水浴15min，涂至含SD‑Trp培养基上，28℃倒置培养2 3天，长出来的菌株挑至YPD液体培养基中培养，得到含有pNH604‑CRY1‑~NLS基因的耐热酵母菌。

[0076] 对比例1：

[0077] WT：野生型酵母菌w303a（由申请人实验室保存）。

[0078] 对比例2：

[0079] 转pNH604‑mKate基因酵母菌株：将pNH604‑mKate质粒DNA转入感受态酵母菌中，其余步骤与实施例5一致。

[0080] 对比例3：

[0081] 转pNH604‑CRY1‑mKate基因菌株：将pNH604‑CRY1‑mKate质粒DNA转入感受态酵母菌中，其余步骤与实施例5一致。

[0082] 实验例1：

[0083] 分别将30℃，YPD液体培养基中保存的实施例5、对比例1至3的酵母菌株转移到Eppendorf Thermomixer中，1400 rpm振摇，50℃分别培养2、5、10、15、20和25分钟，然后将培养后的酵母菌滴在YPD固体培养基上，30℃培养1天后的观察实验情况。

[0084] 图6为各酵母菌的培养结果。从图6中可知：转pNH604‑CRY1‑mKate‑NLS的酵母菌株在50℃热激处理后存活能力最强，证明实施例5的酵母菌具有较强的耐热能力，可应用于高温酿造工艺。

[0085] 实验例2：

[0086] 酵母菌耐热实验，其实验过程为：

[0087] （1）将5μL HSP104‑YFP质粒（Hsp104是一种 “解聚酶”（disaggregase），可以溶解异常聚合的蛋白质并帮助它们获得正确的构像，当带有荧光标签时，会形成滴状聚集）和5μL pNH604‑CRY1‑NLS质粒混合，转入酵母感受态w303a中；转化过程同实施例5，得到转HSP104‑YFP/ pNH604‑CRY1‑NLS菌株。

[0088] （2）将HSP104‑YFP质粒转入酵母感受态w303a中，转化过程同实施例5，得到转HSP104‑YFP菌株。

[0089] （3）分别将平板上生长的步骤（1）和步骤（2）的两种菌株挑至YPD液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600=0.1，取出 500μL菌液至1.5mL的EP管中，在39℃以200rpm进行摇床培养。分别在摇床培养的第0、1、3、5、7、10min取50μL样品，加入50 mg/ml的环己酰亚胺使荧光蛋白稳定。在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况。

[0090] 观察结果参见图7，从图7中可知：随着热激时间的增加，转HSP104‑YFP/ pNH604‑CRY1‑NLS菌株细胞内的点状聚集的荧光数目较少，说明CRY1蛋白的积累可以降低酵母细胞中错误折叠蛋白的积累，增强蛋白质内稳态。

[0091] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。