一种马凡综合征检测panel及其应用

摘要

本发明提供了一种马凡综合征检测panel及其应用，涉及医疗卫生领域，本发明提供的panel可一次性对多个与马凡综合征表征相关的124个基因进行检测，显著提高马凡综合征的突变位点的阳性检出率，能够用于马凡综合征的早期诊断，并及时治疗，降低患病率及病死率，解决了现有技术中存在的基因检测覆盖不全面、漏诊率高的技术问题，本发明提供的panel检测成本低，普适性广。

权利要求

1.一种马凡综合征检测panel，所述panel由检测马凡综合征表型相关基因的杂交探针组成，基因为 FBN1和TGFBR1、TGFBR2、COL3A1、MYH11、ACTA2、SLC2A10、NOTCH1、FBN2，MYLK、PLOD1、SMAD3、TGFB2、SMAD4、COL1A1、COL5A1、COL5A2、FLNA、MMP2，CBS、ADAMTS10、LTBP2、ADAMTS17、SUOX、ADAMTSL4、AASS、ABAT、STAR、AGPAT2、AGTR1、AMER1、APC2、ASPH、B2M、B3GALT6、B4GALT7、BMP6、BSCL2、C12ORF57、CACNA1D、TAP1、CAV1、CBX2、CERS3、CHRDL1、CHRNG、TAP2、CHST14、CNTN1、COL11A1、COL18A1、COL1A2、TAPBP、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、CTSC、CYP26B1、DCHS1、DCN、TGFB3、DHH、DMRT1、DSC2、DSE、EFEMP2、ELN、FBLN5、FGFR2、FGFR3、FOS、HMX1、HPGD、HSD17B10、KANSL1、LAMB2、TGFBR3、LMX1B、LRP1、MAMLD1、MAP3K1、MAT2A、TXNRD2、MC2R、MED12、MEF2A、MFAP5、MOCS1、UPF3B、MOCS2、MRAP、MTM1、NFIX、VSX2、NNT、NPR2、NR0B1、NR5A1、NSD1、WNK1、PAX6、PDE4D、PIEZO2、POF1B、POR、ZDHHC9、PORCN、PPARG、PRDM5、PRKG1、RET、SATB2、ZNF469、SCARF2、SETD2、SHANK3、SKI、SLC6A8、SLCO2A1、、SMS、SOX9、SRY基因。

2.一种将权利要求1所述的panel用于制备检测马凡综合征试剂的应用。

3.一种检测马凡综合征基因芯片、装置或者试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的马凡综合征检测panel。

说明书

一种马凡综合征检测panel及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医疗卫生领域，尤其涉及一种马凡综合征检测panel及其应用。技术背景

[0002] 马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)(OMIM 154700)是最常见的常染色体显性遗传性疾病之一，十八世纪一位法国儿科医师首次描述了其以骨骼、眼及心血管三大系统的
缺陷为主要特征。因累及骨骼可使手指细长，呈蜘蛛指(趾)样，故又称为蜘蛛指(趾)综合征
(arachnodactyly)，患病率为1/3000～1/5000，其中25％以上是散发病例。主动脉夹层突然
破裂是MFS患者最主要的死因。即使经过手术和药物治疗的马凡综合征患者，其日常生活中
所面临的诸多问题仍亟待解决。

[0003] MFS早期诊断和治疗是降低患病率及病死率的有效途径。目前，MFS的诊断多以临床标准为主，分子水平的检测意义重大。尤其对于临床表型尚未完全显现的儿童，无征状的
家族直系成员或产前诊断，分子生物学诊断是提供早期诊断证据最好最准确的途径。

[0004] 但是对于一些没有明确诊断的患者，往往只表现为一两个系统的疾病，临床表现尚不能满足目前的 MFS诊断标准，然而这些疑似马凡综合征的患者也需基因检测来帮助其
进一步诊断，以便及早进行治疗。

[0005] 目前关于MFS基因检测手段主要是采用的是第一代基因检测技术单独针对FBN1基因的sanger测序或者针对心脏相关征状的少数基因组合的sanger测序。例如Jordan 
P.Leerner-Ellis等公开的The spectrum of FBN1,TGFβR1,TGFβR2and ACTA2variants in 
594individuals with suspected Marfan Syndrome,Loeys–Dietz Syndrome or 
Thoracic Aortic Aneurysms and Dissections中，利用FBN1,TGFβR1,TGFβR2，ACTA2进行
检测，马凡综合征的检出率仅为18.86％，再例如Jun Guo等公开的Wide mutation 
spectrum and frequent variant Ala27Thr of FBN1identi ed in a large cohort of 
Chinese patients with sporadic TAAD中，单一的对FBN1基因进行检测，马凡综合征的检
出率仅为15.75％，而Yang,Hang等公开的Genetic testing of the FBN1gene in Chinese 
patients with Marfan/Marfan-like syndrome中，单一的对FBN1基因进行检测，马凡综合
征的检出率虽然高达72％，但是其样本量仅为39，可见，其诊断结果的准确率依然很低，不
利于临床的诊断。

[0006] 而且目前对马凡综合征的检测还存在：①通量小：一代测序筛查基因突变的策略是针对基因的每个外显子进行设计引物测序，读长一般只有800bp，如果外显子较大，还需
要设计拼接。一代测序工艺的复杂决定其一次只能针对一个或者几个基因进行监测，通量
较小；②基因覆盖不全面，漏诊：目前的监测手段是针对一个或者几个疾病相关基因进行检
测，而马凡综合征以及疑似疾病，涉及三大系统多个方面的病征，可能涉及到的基因数百
个；③成本相对高：FBN1基因外显子数目多，一代测序用于突变位点的筛查，检测全部65个
外显子测序，成本相对较高，市场价约5千元左右。随着监测基因数目的增加，价格也会相应
更高。

发明内容

[0007] 为解决现有技术中存在的马凡综合征诊断检出率低，漏检率高的技术问题，本发明提供了一种能够一次性检测马凡综合征表征相关基因，诊断的准确率达96％以上，通量
大，检测成本低，实现了马凡综合征预先诊断，避免了漏诊或诊断失误的情况发生，为临床
表型尚未完全显现的儿童，无征状的家族直系成员或产前诊断，提供了最准确的早期诊断
途径。

[0008] 为实现本发明的技术目的，本发明提供一种马凡综合征检测panel，用于检测包括下述基因的基因集：AASS、ABAT、ACTA2、ADAMTS10、ADAMTS17、ADAMTSL4、STAR、AGPAT2、GTR1、 
AMER1、APC2、ASPH、B2M、SUOX、B3GALT6、B4GALT7、BMP6、BSCL2、C12ORF57、 CACNA1D、TAP1、
CAV1、CBS、CBX2、CERS3、CHRDL1、CHRNG、TAP2、CHST14、CNTN1、 COL11A1、COL18A1、COL1A1、
COL1A2、TAPBP、COL2A1、COL3A1、COL4A3、COL4A4、 COL4A5、COL4A6、TGFB2、COL5A1、COL5A2、
CTSC、CYP26B1、DCHS1、DCN、TGFB3、 DHH、DMRT1、DSC2、DSE、EFEMP2、ELN、TGFBR1、FBLN5、
FBN1、FBN2、FGFR2、FGFR3、 FLNA、TGFBR2、FOS、HMX1、HPGD、HSD17B10、KANSL1、LAMB2、
TGFBR3、LMX1B、 LRP1、LTBP2、MAMLD1、MAP3K1、MAT2A、TXNRD2、MC2R、MED12、MEF2A、MFAP5、 
MMP2、MOCS1、UPF3B。

[0009] 其中，所述panel能够识别基因集中的2421个位点。

[0010] 为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供一种将上述马凡综合征检测panel用于制备检测马凡综合征试剂的应用。

[0011] 为实现本发明的技术目的，本发明再一方面提供一种检测马凡综合征基因芯片、装置或者试剂盒，其具有上述马凡综合征检测panel。

[0012] 有益效果

[0013] 通过本发明提供的马凡综合征检测panel具有如下优点：

[0014] 1、利用本发明提供的panel可一次性对124个与马凡综合征表征相关的基因进行检测，北医三院生殖中心通过对98例马凡综合征及疑似患者基因筛查，发现致病突变阳性
率达96％，远远高于现有筛查水平，解决了现有技术中存在的基因覆盖不全面、漏诊率高的
技术问题。

[0015] 2、应用本发明提供的马凡综合征检测panel一次筛查124个候选基因的突变情况，通量高、速度快，解决了现有技术中通量较小，检测复杂，耗时费力的技术问题。

[0016] 3、应用本发明提供的马凡综合征检测panel对样本可以一次筛查124个候选基因的突变情况，因此成本低，目前市价仅为2000元左右，而采用一代测序用于突变位点的筛
查，检测全部65个外显子测序，不仅过程繁琐，而且成本较高，目前市场价约5千元左右/次，
而且，随着监测基因数目的增加，价格也会相应增加，可见，本发明提供的panel检查成本
低，普适性广。

具体实施方式

[0017] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本领域技术人员应当理解，下面所
具体描述的内容是说明性而非限制性，不应以此限制本发明的保护范围。

[0018] 基因检测panel是高通量量基因检测和基因测序发展起来后用的一个词语，它是指在检测中将若干基因对应的探针设计到同一张捕获芯片上以捕获目标DNA并用于后续的
基因测序。在检测中不只是检测一个位点、一个基因，而是同时检测多个位点、多个基因、多
个位点，这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合，需要一个检测panel。

[0019] 在本文中，术语“基因检测panel”、“检测panel”或者“panel”表示相同的意义可以互换使用，尤其是指作为多基因探测手段的RNA探针集合或杂交探针组合。

[0020] 本申请中检测panel尤其是指针对少量数目的基因或者是基因组区域进行检测的一种探针捕获方案。相比全基因组检测而言，本申请的基因panel可只对少量目标区域捕获
从而进行检测，涉及马凡综合征表型相关基因，尤其从①视觉系统：晶体异位；②骨骼四肢
系统：蜘蛛指、趾，四肢细长，高挑身材；③心血管系统：主动脉夹层等表型相关的基因。本申
请的基因panel由检测马凡综合征表型相关基因的杂交探针组成，其常见的固相载体可以
采用基因芯片的硅片或玻片。当然，也可以是液相的探针反应池，可将各种反应物以及探针
在反应池中完成反应，在此不做具体限定。

[0021] 本申请的马凡综合征检测panel的制备方法主要包括以下步骤：

[0022] 1.马凡综合征表征相关基因的筛选。收集与①视觉系统：晶体异位；②骨骼四肢系统：蜘蛛指、趾，四肢细长，高挑身材；③心血管系统：主动脉夹层等表型方面相关的基因，收
集途径包括马凡综合征患者样本测序获得的相关基因、收集数据库中披露的相关基因、以
及文献中披露的相关基因；对三个方面收集的肝癌信息及其相关基因进行合并、去冗余，并
通过HGNCapproved Official Symbol确定标准基因名称，形成基因集；

[0023] 2.检测目标区域选择。以步骤1中获得的基因集为基础，选择a保留在千人基因组、ESP6500si、 ExAC_ALL和ExAC_EAS人群数据库频率≤0.02或不出现的SNPs及InDels位点；b
保留外显子区域的非同义突变(有文献报道的同义突变保留)；c HGMD数据库文献报道情
况；d质控：位点突变次数＞5，突变频率＞0.3；

[0024] 3.panel探针设计。根据人类基因组，形成可进行捕获探针设计的探针设计区域的数据库；根据所形成的bed文件中各目标区域的位置信息，在所述数据库中寻找各目标区域
相应的探针设计区域；根据探针设计区域和探针设计参数生成探针；

[0025] 优选对所生成探针的设计覆盖度进行加权，设计覆盖度加权数以人类全基因组测序数据预测的各探针设计区域的深度为依据，具体地，将各探针设计区域的测序数据预测
的深度进行量化标记，对高于或低于平均深度的探针设计区域的探针进行加权，以使最终
设计出的探针能均匀捕获各目标区域；例如，对低于平均深度的探针设计区域，增加其权，
使得探针能够对低深度的区域也有较好的捕获能力和效果，以此达到各目标区域均匀捕获
的效果；

[0026] 4.探针评估：对于重要位点和全部目标区域，将其与选择的探针设计区域比对，计算各探针的覆盖重要位点的覆盖度和对全部目标区域的覆盖度；

[0027] 计算公式为，覆盖度＝比对上的读长数/目标测序读长数，

[0028] 选择重要位点覆盖度≥99％，全部目标区域覆盖度≥90％的探针用于panel合成；

[0029] 如果探针覆盖度不能满足以上要求，则在探针设计区域附近重新选择合适探针；

[0030] 5.panel合成：在所设计的探针两端添加固定的扩增序列，合成DNA单链，PCR扩增。

[0031] 其中，步骤1中所述的数据库为：a正常人群数据库：千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS 人群数据库、DGV、dbSNP等；b疾病数据库：OMIM、HGMD(专业版)、Clivar、
Decipher、Cosmic等；c蛋白功能预测数据库：SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++、
REVEL等。

[0032] 实施例1

[0033] 1、基因组DNA的提取

[0034] 经患儿监护人同意后，抽取患儿及其父母外周血各约2mL(EDTA抗凝)，用QIAamp全血DNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)按其说明书提取基因组DNA。

[0035] 2、DNA全基因组文库制备

[0036] 取质检合格的基因组DNA 3μg，其中质检标准采用北京迈基诺基因科技股份有限公司构建文库的标准进行，采用Covaris S2超声仪(Covaris公司，美国)进行超声片段化，
将提取的DNA进行打断至100- 700bp。利用Nanodrop 2000样本定量检测仪(Thermo Fisher
科技有限公司，美国)和Agilenl2100生物分析仪(安捷伦科技公司，美国)进行质控，制备全
基因组文库，具体步骤如下：

[0037] 2.1DNA样本处理

[0038] 采用Covaris S2超声仪(Covaris公司，美国)将提取的DNA进行打断至100-700bp。

[0039] 2.2末端修复加“A”及产物纯化

[0040] 配置反应体系：

[0041]

[0042] 充分混匀后、离心后置于已经设置好的PCR仪中，并按如下步骤运行程序：

[0043]

[0044] 将PCR产物用磁珠纯化，磁珠和样本的比例为1.5:1。

[0045] 2.3文库扩增PCR及产物纯化

[0046] 冰上配置反应体系：

[0047]

[0048] 其中，扩增引物根据基因序列，利用引物设计软件均可获得，在此不作赘述。

[0049] 反应体系中的成分充分混匀、离心后置于已经设置好的PCR仪中，并按如下步骤运行程序：

[0050]

[0051]

[0052] 然后将获得的PCR产物用磁珠纯化，获得纯化产物，其中，磁珠与样本比例为1.5:1。

[0053] 将纯化产物进行文库质检后，得到全基因组文库DNA，质检标准采用北京迈基诺基因科技股份有限公司构建文库的标准进行。

[0054] 3、目标基因捕获及高通量测序

[0055] 利用经过生物素标记的探针与质检合格的全基因组文库DNA在一定条件下进行杂交，用链霉亲和素修饰的磁珠共价结合生物素标记的探针，从而抓取目的基因，最后用磁力
架吸附携带目的基因的磁珠，洗脱纯化，富集目的基因，捕获与马凡综合征相关的124个基
因的编码外显子区域。利用Illumina Nextseq 500 第二代测序仪对捕获到的区域进行双
端测序，读长为150bp。

[0056] 其中，探针所捕捉的124个基因对应的名称、相应的登录号(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)如表1所示：

[0057] 表1基因序列及相应的登录号

[0058]

[0059]

[0060] 其中，所示探针是根据表1所示的基因，利用引物序列设计软件设计均可，在此不做赘述。

[0061] 4、数据筛选与生物信息学分析

[0062] 目标区域测序后，去除测序数据中的接头和低质量数据。运用BWA软件比对到参考基因组上(hg19 版本)，对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计分析。用GATK软件
对各个样本的比对数据进行多态性位点的检测，对单核苷酸多态性(single nucleotide 
polymorphisms，SNPs)和小片段插入缺失突变 (InDels)等数据进行统计和分析。

[0063] 4.1基因注释信息

[0064] (1)CytoBand；gene；Repeat Region

[0065] (2)Gene_region(exonic；splicing；intronic；intergenic,5’UTR,3’UTR)

[0066] (3)Effect(synonymous,nonsynonymous,splicing,stopgain,nonframeshift)

[0067] (4)OD2:NM_022162:exon8:c.G2722C:p.G908R

[0068] 4.2筛选大致原则

[0069] a保留在千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL以及ExAC_EAS人群数据库频率≤0.02或不出现的SNPs 及InDels位点；

[0070] b保留外显子区域的非同义突变(有文献报道的同义突变保留)；

[0071] c HGMD数据库文献报道情况

[0072] d质控：位点突变次数＞5，突变频率＞0.3

[0073] 4.3参考数据库

[0074] a正常人群数据库：千人基因组、ESP6500si、ExAC_ALL、ExAC_EAS人群数据库、DGV、dbSNP等；

[0075] b疾病数据库：OMIM、HGMD(专业版)、Clivar、Decipher、Cosmic等；

[0076] c蛋白功能预测数据库：SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++、REVEL等。

[0077] 4.4致病性分析

[0078] 根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)联合分子病理学学会(AMP)2015年5月发表在《Genetics in Medicine》上的基因变异的解读标准及指导原则对数据进行分析。

[0079] 《标准》中指出使用高通量测序检测孟德尔遗传病致病基因的时候，将序列中的变异分为五类：“致病的”、“可能致病的”、“致病性不明确的”、“可能良性的”、“良性的”；然后
针对每一个序列变异，将已有的研究证据整合，将此变异进行分类。

[0080] 其中，每个变异、致病的研究证据及证据分级如表2-4所示：

[0081] 表2基于证据Evidence of pathgenicity的变异等级

[0082]

[0083] 表3基于证据Evidence of Benign的变异等级

[0084]

[0085]

[0086] 表4致病等级

[0087]

[0088] 5、Sanger测序验证

[0089] 根据需要测序的DNA片段合成引物，用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法进行扩增，用ABI3730xl测序仪(美国Applied Biosystems公司)以Sanger
测序法进行测序，测序结果使用“Mutation Surveyor”软件与参考序列进行比对分析。

[0090] 需要说明的是，采用本发明提供的马凡综合征检测panel进行基因检测可以采用常规的全外显子捕获方法进行，例如，在本发明的一个实施例中，使用北京迈基诺基因科技
股份有限公司提供的全外显子捕获方法。

[0091] 应用实施例1

[0092] 本实施例按照以上方法对79名先证者进行DNA提取、打断、末端修复、第一次PCR，基因panel的特异性捕获，第二次PCR扩增获得待测序DNA样本，DNA样本质量满足上机需求
后进行测序。

[0093] 检测结果显示，在79名先证者中，总共76名先证者的基因PANEL检测结果为携带有基因突变,检测阳性率为96.20％。其中64(81.01％)名先证者结果为P(致病)或者LP(可能
致病)，12(15.19％)名先证者携带有不确定意义的基因突变(VUS)，只有3名(3.80％)先证
者未检测到基因PANEL内的可疑基因突变，统计结果详见表5。

[0094] 表5先证者基因检测统计结果

[0095]

[0096] 其中，所有先证者的基因检测结果如表6所示：

[0097] 表6先证者基因检测结果详情

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103] 注：NA(Not Available)为缺少父母亲本样本，变异来源不知；De novo为新发突变。

[0104] 根据表5可知，70名先证者检测出携带FBN1基因突变，其中有14名患者除FBN1基因外，还检测到其他相关基因突变；6名先证者检测到不携带FBN1基因突变，但是携带其他基
因突变；3名先证者未检测出PANEL所包含的124个相关基因的外显子区域有可疑突变。

[0105] 以上实施例对于本发明的基因panel检测方案进行了验证，需要说明的是，本申请的涵盖124个马凡综合征相关基因的基因panel可以用于待测样本的马凡综合征的风险评
估、诊断、治疗、预后需求。可以理解，根据不同的检测或研究设计需求，也可以采用本申请
的制备方法获得更多类型或特别用途的基因panel，甚至不仅限于马凡综合征检测的基因
panel，在此不做具体限定。在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发
明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。