一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台

摘要

本发明公开一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台，特点是基于大比表面积的螺旋碳纳米管和钴离子掺杂的具有金属有机框架结构的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs），分别引入CA125的捕获抗体和叶酸。首先，具有良好导电性的螺旋碳纳米管可以固载大量抗体，并且加速电子传导；其次，Co@TiO2 MOFs不仅可以承载大量叶酸，而且能够催化溶解氧还原过程产生活性氧化物种，引发钌联吡啶的阴极发光。因此，所制得的电致化学发光传感器，具有灵敏度高、检测限低等优点，用于卵巢癌细胞（A2780）的检测，在卵巢癌早期诊断和预后评估方面具有较为重要的价值。

权利要求

1.一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：

（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；

（2）首先，将80 μL 5 mg/mL 螺旋碳纳米管（HCNTs）溶液与80 μL 10 mM 对苯二胺（PPD）溶液混合，经搅拌反应过夜之后，在2.5 wt% 戊二醛的辅助作用下，将50 μL AbCA125溶液加入到上述复合物溶液中，并在室温下振荡反应30 min，经离心、洗涤去除残余物之后，最终制得AbCA125/HCNTs复合物，滴加5 μL上述所得AbCA125/HCNTs复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，自然晾干，制得AbCA125/HCNTs复合物修饰玻碳电极；

（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液中孵育30 min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；

（4）取5 μL不同浓度的A2780细胞溶液组装到步骤（3）获得的修饰电极界面并在37  °C下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极，并保存在4 °C冰箱中备用；

（5）取50 μL浓度为10 mM的3-巯基丙酸加入到150 μL 2.5 mg/mL钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）中，室温下连续振荡12 h，以完成Ti-S键的结合，达到羧酸化TiO2介晶纳米盘的目的；去除未反应的3-巯基丙酸之后，用摩尔浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液对TiO2介晶纳米盘表面的羧基进行活化；1 h之后，将50 μL叶酸（FA, 5 mg/mL）加入到上述溶液中，在37  °C条件下持续搅拌50 min以完成酰胺反应；最后，用1.0 wt.% BSA溶液封闭非特异性活性位点制得Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液，储存在4 °C冰箱中备用；

（6）取5 μL步骤（5）制得的Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液于步骤（4）制备的修饰电极界面，并在37 ºC下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得Co@TiO2 MOFs@FA/A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）由下述方法制备的：首先，将9 g对苯二甲酸，12 mL无水甲醇和108 mL无水N, N-二甲基甲酰胺（DMF）混合振荡10 min；然后将3 mL钛酸四丁酯加入到上述混合溶液中继续振荡15 min；随后，在上述溶液中加入32 mg六水合氯化钴，搅拌至溶解，将此混合溶液转移到200 mL反应釜中；在150 °C条件下反应48 h后，将所得悬浊液用甲醇洗涤并过滤；再经过离心、洗涤、干燥之后，将所得沉淀物在400 °C下煅烧5 h制得最终产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的螺旋碳纳米管（HCNTs）由下述方法制备的：首先用丙酮超声处理石英板30 min，用纯净水冲洗干净之后，再将石英板放入0.1 M的硝酸铁（Fe(NO3)·9H2O）溶液中浸泡数小时；室温干燥之后，将上述石英板放置在水平石英管式炉中间，在氩气气氛中进行800  °C处理90 min；最后，将乙醇注入炉内的石英板上，并将生长出的碳纳米管在室温下干燥即可。

4.权利要求1-3任一所述的方法制备的一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台。

5.权利要求4所述的一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台的免疫分析方法，其特征在于，用于卵巢癌细胞（A2780）的检测，检测步骤如下：（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以权利要求4所述的一种钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，在2 mL含有1.0×10-5 M Ru(bpy)32+和10 mM 三丙胺（TPrA）的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）采用电位范围0   –1.8V，扫描速率0.05 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍~

增管800 V对不同浓度的卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集–

1.3 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与卵巢癌细胞（A2780）溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

说明书

一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细

胞电致化学发光传感平台

技术领域

[0001] 本发明属于新型功能材料与免疫传感检测技术领域，具体涉及一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台的免疫分析方法及应用。

背景技术

[0002] 电致化学发光（ECL）是由电化学反应引起的化学发光，因其灵敏度高、反应可控性强、仪器设备简单等优点引起了广泛的关注。电致化学发光生物传感器结合了电致化学发光方法和生物传感技术的优点，已经广泛应用于细胞、蛋白质和小分子毒素等检测方面，在分析化学领域展现出良好的应用前景。本发明制备了一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台，实现了对卵巢癌细胞（A2780）的高灵敏检测。

[0003] TiO2纳米材料因其独特的光催化活性、无毒性，优异的化学和物理稳定性，使其成为光催化和光电化学传感器的理想材料，其性能一般受晶型、晶粒大小、晶面、结晶度、比表面积等的影响。TiO2介晶纳米盘是晶体亚单元有序排列而成，相比于传统的TiO2单晶，TiO2介观晶体具有更加高度的结晶形态及更加优良的光催化活性等性能。以金属有机框架为前驱体合成的钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘材料不仅具备金属有机框架的骨架结构，同时表现出独特的催化性能、高孔隙率和良好的导电性等优点，使其成为催化氧还原反应的理想材料，在光电化学传感领域具有广阔的应用前景。螺旋碳纳米管是一种新型的碳纳米材料，由于螺旋碳纳米管呈螺旋状结构，表面具有较多的活性位点，表现出良好的电子导电性、大的比表面积和高的空隙容量等化学特性，在构建高效的电致化学发光传感器中具有良好的应用前景。本发明基于大比表面积的螺旋碳纳米管和钴离子掺杂的具有金属有机框架结构的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs），分别引入CA125的捕获抗体和叶酸。首先，具有良好导电性的螺旋碳纳米管可以固载大量抗体，并且加速电子传导钌联吡啶的阴极发光。其次，以A2780细胞表面的叶酸受体和CA125作为靶点进行特异性识别。因此，所制得的电致化学发光传感器，具有灵敏度高、检测限低等优点，用于卵巢癌细胞（A2780）的检测，在卵巢癌早期诊断和预后评估方面具有较为重要的价值。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一是螺旋碳纳米管和钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘作为传感平台，钌联吡啶作为电致化学发光体，构建一种稳定性好，灵敏度高的催化增强电致化学发光免疫传感器。

[0005] 本发明的目的之二是将该电致化学发光免疫传感器应用于卵巢癌细胞（A2780）的高灵敏检测。

[0006] 为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：1. 一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台，其特点在于，包括以下步骤：
（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）首先，将80 μL 5 mg/mL HCNTs溶液与80 μL 10 mM 对苯二胺（PPD）混合，经搅拌反应过夜之后，在2.5 wt% 戊二醛的辅助作用下，将50 μL AbCA125溶液加入到上述复合物溶液中，并在室温下振荡反应30 min。经离心、洗涤去除残余物之后，最终制得AbCA125/HCNTs复合物；滴加5 μL上述所得AbCA125/HCNTs复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，自然晾干，制得AbCA125/HCNTs复合物修饰玻碳电极；
（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0 wt.%的BSA溶液中孵育30 min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；
（4）取5 μL不同浓度的A2780细胞溶液组装到步骤（3）获得的修饰电极界面并在37  °C下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极，并保存在4 °C冰箱中备用；
（5）取50 μL浓度为10 mM的3-巯基丙酸加入到150 μL 2.5 mg/mL钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）中，室温连续振荡12 h，以完成Ti-S键的结合，达到羧酸化TiO2介晶纳米盘的目的；去除未反应的3-巯基丙酸之后，用摩尔浓度比为4:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液对TiO2介晶纳米盘表面的羧基进行活化；1 h之后，将50 μL叶酸（FA, 5 mg/mL）加入到上述溶液中，在37  °C条件下持续搅拌50 min以完成酰胺反应；最后，用1.0 wt.% BSA封闭非特异性活性位点制得Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液，储存在4 °C冰箱中备用；
（6）取5 μL步骤（5）制得的Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液于步骤（4）制备的修饰电极界面，并在37 ºC下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得Co@TiO2 MOFs@FA/A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。

[0007] 2. 上述钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）由下述方法制备的：首先，将9 g对苯二甲酸，12 mL无水甲醇和108 mL无水N, N-二甲基甲酰胺（DMF）混合振荡10 min；然后将3 mL钛酸四丁酯加入到上述混合溶液中继续振荡15 min；随后，在上述溶液中加入32 mg六水合氯化钴，搅拌至溶解之后将上述混合溶液转移到200 mL反应釜中。在150 °C条件下反应48 h之后，将所得悬浊液用甲醇洗涤并过滤。再经过离心、洗涤、干燥之后，将所得沉淀物在400 °C下煅烧5 h可制得最终产物。

[0008] 3. 上述螺旋碳纳米管（HCNTs）由下述方法制备的：首先用丙酮超声处理石英板约30 min，用纯净水冲洗干净之后，再将石英板放入0.1 M的硝酸铁（Fe(NO3)·9H2O）溶液中浸泡数小时。室温干燥之后，将上述石英板放置在水平石英管式炉中间，在氩气气氛中进行
800 °C处理约90 min。最后，将乙醇注入炉内的石英板上，并将生长出的碳纳米管在室温下干燥即可。

[0009] 4. 上述AbCA125/HCNTs复合物溶液由下述方法制备的：首先，将80 μL 5 mg/mL HCNTs溶液与80 μL 10 mM 对苯二胺（PPD）混合，经搅拌反应过夜之后，在2.5 wt% 戊二醛的辅助作用下，将50 μL AbCA125溶液加入到上述复合物溶液中，并在室温下振荡反应30 min。经离心、洗涤、再分散，最终制得HCNTs/AbCA125复合物溶液。

[0010] 5. 上述Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液由下述方法制备的：取50 μL浓度为10 mM的3-巯基丙酸加入到150 μL 2.5 mg/mL钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）中，室温连续振荡12 h，以完成Ti-S键的结合，达到羧酸化TiO2介晶纳米盘的目的；去除未反应的
3-巯基丙酸之后，用摩尔浓度比为4:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液对TiO2介晶纳米盘表面的羧基进行活化；1 h之后，将50 μL叶酸（FA, 5 mg/mL）加入到上述溶液中，在37  °C条件下持续搅拌50 min以完成酰胺反应；最后，用1.0 wt.% BSA封闭非特异性活性位点制得Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用。

[0011] 6. 卵巢癌细胞（A2780）的检测步骤：（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述的一种钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，在2 mL含有1.0×10-5 M Ru(bpy)32+和10 mM TPrA的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0   –1.8V，扫描速率0.05 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍~
增管800 V对不同浓度的卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集–
1.3 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与卵巢癌细胞（A2780）溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液代替卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

[0012] 本发明的显著优点为：（1）电致化学发光生物传感器，同时结合电致化学发光方法和生物传感技术的优点，已广泛用于肿瘤细胞的灵敏、快速检测。

[0013] （2）具有较高比表面积和良好催化性能的钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）作为传感器的探针载体，不仅可以承载大量的生物分子，而且能够催化氧还原反应（ORR），产生大量活性氧化物种，从而触发钌联吡啶的阴极发光；螺旋碳纳米管（HCNTs）特殊的三维螺旋状状结构和良好的导电性既可以承载大量的捕获抗体（AbCA125），又可以促进电子传输，从而提高电致化学发光生物传感器的灵敏度。

[0014] （3）本发明利用抗原-抗体、叶酸与叶酸受体之间的特异性识别作用，提高了检测方法的特异性。

附图说明

[0015] 图1为电镜图对照，图中的A为螺旋碳纳米管（HCNTs）的扫描电镜图；B，C分别为钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）的扫描电镜图和透射电镜图。

[0016] 图2为生物传感器的电致化学发光响应信号与卵巢癌细胞（A2780）浓度对数的线性关系图。

具体实施方式

[0017] 本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

[0018] 实施例1一种基于钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台的制备方法：
（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）首先，将80 μL 5 mg/mL螺旋碳纳米管（HCNTs）溶液与80 μL 10 mM 对苯二胺（PPD）混合，经搅拌反应过夜之后，在2.5 wt% 戊二醛的辅助作用下，将50 μL捕获抗体（AbCA125）溶液加入到上述复合物溶液中，并在室温下振荡反应30 min。经离心、洗涤去除残余物之后，最终制得AbCA125/HCNTs复合物；滴加5 μL上述所得/ AbCA125/HCNTs复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，自然晾干，制得AbCA125/HCNTs复合物修饰玻碳电极；
（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0 wt.%的BSA溶液中孵育30 min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；
（4）取5 μL不同浓度的A2780细胞溶液组装到步骤（3）获得的修饰电极界面并在37  °C下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极，并保存在4 °C冰箱中备用；
（5）取50 μL浓度为10 mM的3-巯基丙酸加入到150 μL 2.5 mg/mL钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）中，室温连续振荡12 h，以完成Ti-S键的结合，达到羧酸化TiO2介晶纳米盘的目的；去除未反应的3-巯基丙酸之后，用摩尔浓度比为4:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液对TiO2介晶纳米盘表面的羧基进行活化；1 h之后，将50 μL叶酸（FA, 5 mg/mL）加入到上述溶液中，在37  °C条件下持续搅拌50 min以完成酰胺反应；最后，用1.0 wt.% BSA封闭非特异性活性位点制得Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液，储存在4 °C冰箱中备用；
（6）取5 μL步骤（5）制得的Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液于步骤（4）制备的修饰电极界面，并在37 ºC下孵育30 min，用去离子水冲洗电极表面，制得Co@TiO2 MOFs@FA/A2780/AbCA125/HCNTs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。

[0019] 实施例2上述实施例1所用的钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）的制备：首先，将9 g对苯二甲酸，12 mL无水甲醇和108 mL无水N, N-二甲基甲酰胺（DMF）混合振荡10 min；然后将3 mL钛酸四丁酯加入到上述混合溶液中继续振荡15 min；随后，在上述溶液中加入32 mg六水合氯化钴，搅拌至溶解之后将上述混合溶液转移到200 mL反应釜中。在150 °C条件下反应48 h之后，将所得悬浊液用甲醇洗涤并过滤。再经过离心、洗涤、干燥之后，将所得沉淀物在400 °C下煅烧5 h可制得最终产物。

[0020] 实施例3上述实施例1所用的螺旋碳纳米管（HCNTs）的制备：首先用丙酮超声处理石英板约30 min，用纯净水冲洗干净之后，再将石英板放入0.1 M的硝酸铁（Fe(NO3)·9H2O）溶液中浸泡数小时。室温干燥之后，将上述石英板放置在水平石英管式炉中间，在氩气气氛中进行800 °C处理约90 min。最后，将乙醇注入炉内的石英板上，并将生长出的碳纳米管在室温下干燥即可。

[0021] 实施例4上述实施例1所用的AbCA125/HCNTs复合物溶液的制备：首先，将80 μL 5 mg/mL HCNTs溶液与80 μL 10 mM 对苯二胺（PPD）混合，经搅拌反应过夜之后，在2.5 wt% 戊二醛的辅助作用下，将50 μL AbCA125溶液加入到上述复合物溶液中，并在室温下振荡反应30 min。经离心、洗涤、再分散，最终制得AbCA125/HCNTs复合物溶液。

[0022] 实施例5上述实施例1所用的Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液的制备：取50 μL浓度为10 mM的3-巯基丙酸加入到150 μL 2.5 mg/mL钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘（Co@TiO2 MOFs）水溶液中，室温连续振荡12 h，以完成Ti-S键的结合，达到羧酸化TiO2介晶纳米盘的目的；去除未反应的3-巯基丙酸之后，用摩尔浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液对TiO2介晶纳米盘表面的羧基进行活化；1 h之后，将50 μL叶酸（FA, 5 mg/mL）加入到上述溶液中，在37  °C条件下持续搅拌50 min以完成酰胺反应；最后，用1.0 wt.% BSA封闭非特异性活性位点制得Co@TiO2 MOFs@FA复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用。

[0023] 实施例6上述实施例1所用的钌联吡啶（Ru(bpy)32+）购买于上海化学科技有限公司；3-巯基丙酸（MPA）购买于北京Sigma-Alorich公司。叶酸（FA）购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；捕获抗体（AbCA125）来源于上海柯雷生物科技有限公司；A2780卵巢癌细胞株和其它细胞株（OS、MG63）均购自南京科佰生物科技有限公司。

[0024] 实施例7卵巢癌细胞（A2870）的检测步骤：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的一种钴离子掺杂的TiO2介晶纳米盘催化增强的卵巢癌细胞电致化学发光传感平台为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，在2 mL含有1.0×10-5 M Ru(bpy)32+和10 mM三丙胺（TPrA）的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0   –1.8V，扫描速率0.05 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍~
增管800 V对不同浓度的卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集–
1.3 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与卵巢癌细胞（A2780）溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液代替卵巢癌细胞（A2780）溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。