对自然杀伤细胞具有免疫调节作用的口服组合物

摘要

包含脂肪酸或其酯的组合作为活性成分的口服组合物，用于治疗具有增加数量和/或细胞毒性的NK细胞的低生育力女性在体外受精后的反复自然流产或反复植入失败的方法中。以特定的量将所述口服组合物给予特定的时间段。

权利要求

1.包含脂肪酸或其酯的组合作为活性成分的口服组合物，用于治疗人类女性受试者的反复自然流产或反复植入失败的方法中，所述人类女性受试者在总的外周血细胞中具有

12％或更多的外周血NK细胞和/或其中所述人类女性受试者的外周血NK细胞的细胞毒性比没有生育失败并且已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康人类女性的对照群体的平均细胞毒性高至少10％，其中将所述组合物口服给予15至70天并且其中每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.03g/kg体重至1g/kg体重，按照脂肪酸计算。

2.根据权利要求1的口服组合物，其中每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.10g/kg体重至0.70g/kg体重，按照脂肪酸计算。

3.根据权利要求2的口服组合物，其中每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.20g/kg体重至0.50g/kg体重，按照脂肪酸计算。

4.根据权利要求1至3任一项的口服组合物，其中将所述组合物给予30至60天。

5.根据权利要求1至4任一项的口服组合物，其中将所述组合物给予40至50天。

6.根据权利要求1至5任一项的口服组合物，其中所述脂肪酸选自长链、中链、短链脂肪酸及其混合物。

7.根据权利要求6的口服组合物，其中所述长链脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、花生酸、油酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、棕榈油酸、肉豆蔻油酸、十六碳烯酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸及其混合物。

8.根据权利要求6的口服组合物，其中中链脂肪酸选自月桂酸、癸酸、辛酸及其混合物。

9.根据权利要求1至8任一项的口服组合物，其中所述组合物包含至少一种饱和的、至少一种单不饱和的和至少一种多不饱和的长链脂肪酸或其酯。

10.根据权利要求1至9任一项的口服组合物，其中按照脂肪酸计算，组合物中至少50％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。

11.根据权利要求10的口服组合物，其中按照脂肪酸计算，组合物中至少65％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。

12.根据权利要求11的口服组合物，其中按照脂肪酸计算，组合物中至少97％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。

13.根据权利要求1至12任一项的口服组合物，其中所述脂肪酸酯选自甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、鞘脂、糖脂及其混合物。

14.根据权利要求13的口服组合物，其中所述脂肪酸酯选自甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯及其混合物。

15.根据权利要求1至15任一项的口服组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种维生素、金属离子、氨基酸或其混合物。

说明书

对自然杀伤细胞具有免疫调节作用的口服组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及用于一种治疗方法中的口服组合物，所述方法用于治疗具有提高的数量和/或细胞毒性的NK细胞的低生育力(sub-fertile)人类女性受试者在体外受精(IVF)后的反复自然流产(RSA)或反复植入失败(RIF)。

背景技术

[0002] 自然杀伤(NK)细胞是一个特定的大颗粒淋巴细胞(LGL)组，其在先天性免疫应答中起着主要作用，但在影响获得性免疫应答和免疫调节中也是重要的(Herberman RB.Role of human natural killer cell responses in health and disease.Clin Diagn LabImmunol1994；1:125-33)。它们形成主要在脾脏中发现的淋巴组织的1-2％。在外周血中，NK细胞构成所有淋巴细胞的5-15％和LGL的70-95％(Stites DP，Terr AI，Parslow TG.Basic and clinical immunology.第8版，Appleton and Lange，Norwalk，Conn，1994)。

[0003] NK细胞在其表面上表达一系列标志物，其中最有特征性的是分子CD16和CD56(Caligiuri M.Human natural killer cells.Blood.2008；112:461-9)。基于CD16和CD56的相对表达，将NK细胞细分成不同的亚群。两个主要的子集是CD56dim CD16bright(低表达的CD56，高表达的CD16)和CD56bright CD16dim/-(高表达的CD56，低或无表达的CD16)。代表全部外周血NK细胞中的至少90％的CD56dim CD16bright细胞具有细胞毒性功能。激活时，它们从其颗粒中释放穿孔素和granzyes，同时它们应答由内皮和先天性免疫细胞引起的炎症过程中释放的趋化因子移动至炎症部位(Moretta A，Marcenaro E，Parolini S，Ferlazzo G，Moretta L.NK cells at the interface between innate and adaptive immunity.Cell Death Differ 2008；15:226-33)。CD56bright CD16dim/-细胞构成次级淋巴组织中的大部分NK细胞，它们在激活前只有微弱的细胞毒性，但在细胞因子作用时，它们立即产生大量的INF-γ并且可以具有免疫调节特性(Poli A，Michel T,Theresine M，Andres E，Hentges F，Zimmer J，CD56bright natural killer(NK)cells:an important NK cell subset.Immunology 2009年4月；126(4):458-65)。可能在局部分化后，这些细胞构成子宫内膜白细胞的主要细胞群(CD56eGL:子宫内膜粒细胞)(Hiby SE1，King A，Sharkey AM，Loke YM，Human uterine NK cells have a similar repertoire of killer inhibitory and activatory receptors to those found in blood,as demonstrated by RT-PCR and sequencing，Mol Immunol.1997年4月；34(5):419-30)。

[0004] NK-样细胞(CD56brightCD16dim/-)是从妊娠的第一阶段到妊娠头三个月的主要蜕膜细胞群。存在证据表明雌激素和孕酮为子宫内膜准备预想的妊娠时，它们的增殖和分化与月经周期的分泌期同步。在这个阶段期间，作为从血液或其他组织的NK细胞流入或子宫内膜基质细胞重新编程和分化成NK细胞的结果，子宫基质白细胞大幅增加(从5％增至25％)(Gellersen B，Brosens IA，Brosens JJ.Decidualization of the human endometrium:mechanisms,functions,and clinical perspectives.Semin Reprod Med 2007；25:445-
53.Santoni A，Carlino C，Gismondi A，Uterine NK cell development,migration and function.Reprod Biomed Online 2008；16:202-10)。如果怀孕了，NK-样细胞快速增加并且遍及绒毛外滋养层附近发现的蜕膜广泛分布(King A.Uterine leukocytes and decidualization.Hum Reprod Update 2000；6:28-36)。由于其存在增加以及与侵袭中的滋养层直接接触，已经认为它们对于正常怀孕的确定是重要的。存在证据表明，与胚泡植入和蜕膜化一致，子宫NK细胞被激活，它们产生IFN-γ、穿孔素和其他分子，包括血管生成因子，使得它们可以控制滋养层通过其细胞毒性活性侵袭，并且还促使血管不稳定性和蜕膜动脉的重塑，以提高胎儿-胎盘个体的血液供应(Ashkar  AA，Di  Santo JP，Croy BA.Interferon gamma contributes to  initiation  of uterine vascular modification,decidual integrity,and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.J Exp Med 2000；192:259-70)。此外，蜕膜NK细胞可能涉及细胞因子介导的产生Th2-型细胞因子和生长因子的母体免疫应答的免疫调节，其导致胎盘增大以及局部免疫抑制和免疫调节(Clark D，Arck PC，Jallili R等，Psycho-Neuro-Cytokine/Endocrine pathways in immunoregulation during pregnancy.Am J Reprod Immunol 1996；35:330-7Chaouat G，Tranchot Diallo J，Volumenie JL等，Immune suppression and Th1/Th2balance in pregnancy revisited:A(very)personal tribute to Tom Wegmann.Am J Reprod Immunol 1997；37:427-34)。

[0005] 蜕膜NK细胞似乎是称为同种免疫流产情况中涉及的主要细胞群，在同种免疫流产中，胚胎被认为是外源的并且被母体“排斥”(Labarrere CA.Allogeneic recognition and rejection reactions in the placenta.Am J Reprod Immunol 1989；21：94-9Stern JJ，Coulam CB:Current status of immunologic recurrent pregnancy loss.Curr Opin Obstet Gynecol 1993；5:252-9)。在Th1型细胞因子的影响下，刺激它们变成表达CD16(CD56dimCD16bright)的传统NK细胞，其可以通过释放细胞溶解物质直接地或通过产生炎性因子间接地损伤滋养层(King A，Wheeler R，Carter NP等，The response of human decidual leukocytes to IL-2.Cell Immunol 1992；141:409-42)。

[0006] 临床研究已经证明了倾向于流产的女性在子宫中具有增加数量的常规CD3-CD56+CD16+型的NK细胞(Vassiliadou N，Bulmer JN:Immunohistochemical evidence for increased numbers of‘classic’CD57+natural killer cells in the endometrium of women suffering spontaneous early pregnancy loss.Hum Reprod 1996；11:1569-74Kwak JY，Beer AE，Kim SH等，Immunopathology of the implantation site utilizing monoclonal antibodies to natural killer cells in women with recurrent pregnancy losses.Am J Reprod Immunol1999；41:91-8)，以及提高的血液NK子集和NK细胞活性，全部与染色体正常胚胎的流产相关(Coulam CB，Goodman C，Roussev RG等，Systemic CD56+cells can predict pregnancy outcome.Am J Reprod Immunol 1995；
33:40-6Aoki K，Kajiura S，Matsumoto Y等，Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage.Lancet 1995；345:1340-2)。

[0007] 由于以上的数据，将提高数量和/或细胞毒性的外周血NK细胞(CD56bright dim -CD16 /)用于诊断同种免疫流产诊断的实践中以及用作选择女性用于免疫治疗的标志物(Coulam CB，Goodman C，Roussev RG等，Systemic CD56+cells can predict pregnancy outcome.Am J Reprod Immunol 1995；33:40-6Aoki K，Kajiura S，Matsumoto Y等.Preconceptual natural  killer  cell activity as a  predictor  of 
miscarriage.Lancet 1995；345:1340-2)。

[0008] 传统上，降低有害的NK细胞激活并防止流产和/或RIF的主要治疗是使用父本或第三方淋巴细胞主动免疫女性(Gafter U，Sredni B，Segal J，Kalechman Y.Suppressed cell-mediated immunity and monocyte and natural killer cell activity following allogeneic immunization of women with spontaneous recurrent abortion.J Clin Immunol 1997；17:408-19)，以及静脉内给予免疫球蛋白G(IVIg)形式的被动免疫(Ruiz JE，Kwak JY，Baum L等，Intravenous immunoglobulin inhibits natural killer cell activity in vivo in women with recurrent spontaneous abortion.Am J Reprod Immunol 1996；35:370-5)。一些已知的静脉内免疫球蛋白的副作用或不良事件是：无菌性脑膜炎、肾衰竭、血栓栓塞、haematolytic反应、过敏反应、肺病、肠炎、皮肤病和传染病(Stiehm，2013)。在最近几年中提出的抑制NK细胞功能性细胞毒性的可替换治疗是静脉内给予包含纯化的大豆油、纯化的卵磷脂、无水甘油和注射用水的脂肪乳浊液(例如，)，其通常用作患有营养失调或其他需要非肠道营养的疾病的患者的能量和必需脂肪酸的来源(Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin,Intralipid and soluble human leukocyte antigen-G，Am J Reprod Immunol 2007；57:262-9，Meng L，Lin J，Chen L，Wang Z，Liu M，Liu Y，Chen X，Zhu L)。使用 的治疗降低了外周血NK细胞的细胞毒性，但没有减少外周
血NK细胞的数量。此外， 的静脉内输注可能引起严重的副作用，如膀胱疼
痛，血尿或尿液浑浊，寒战，排尿困难、排尿有灼烧感、排尿疼痛，发烧，频繁的尿意，腰背或侧背疼痛，嗓子疼和呕吐。最近的研究已经表明静脉内给予 可以引起肝肿
大、黄疸、胆汁郁积、脾肿大、血小板减少、白血球减少和脂肪过载综合征(临床试验中<1％)(FDA，2007)。

[0009] 外周血NK细胞增加的数量和提高的细胞毒性都可以引起反复自然流产(Am J Reprod Immunol.2007年11月；58(5):447-59。升高的血液CD3(+)CD56(+)NKT细胞的数量应答静脉内免疫球蛋白治疗的下降与成功的怀孕相关(van den Heuvel MJ1，Peralta CG，Hatta K，Han VK，Clark DA；An Increased NK-cell percentage 5days after the pregnancy termination could be a marker of immune aetiology of miscarriage,as the probability of an aborter with NK>12％to have an immune-mediated abortion is almost 90％.Am J Reprod Immunol.2008年4月；59(4):306-15.Doi:10.1111/j.1600-0897.2007.00547.x.Epub 2008年2月21日)。

[0010] 已经表明了在流产时测量外周血NK细胞是有价值的，并且应归因于升高的NK细胞数量的重要作用(Paparistidis N1，Papadopoulou C，Chioti A，Papaioannou D，Tsekoura C，Keramitsoglou T，Kontopoulou-Antonopoulou V，Agapitos E，Balafoutas C，Varla-Leftherioti M)。

[0011] 各种研究已经表明外周血NK细胞数量和活性的降低导致活出生率的显著提高，以非常高的水平升高(Am J Reprod Immunol.2006年3月；55(3):232-9)。高剂量的静脉内免疫球蛋白逆转了患有反复自然流产的女性中的高水平的外周血NK细胞(Perricone R1，Di Muzio G，Perricone C，Giacomelli R，De Nardo D，Fontana L，De Carolis C.Am J Reprod  Immunol.2010年3月1日；63(3):263-5.doi:10.1111/j.1600-0897.2009.00790.x.Epub 2010年1月8日；CD3-CD56+CD16+natural killer cells and improvement of pregnancy outcome in IVF/ICSI failure after additional IVIG-treatment.Heilmann L1，Schorsch M，Hahn T.Am J Reprod Immunol.2007年4月；57(4):
262-9；Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin,intralipid and soluble human leukocyte antigen-G.Roussev RG1，Ng SC，Coulam CB.(Am J Reprod Immunol.2007年11月；58(5):447-59；Decline in number of elevated blood CD3(+)CD56(+)NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy.Van den Heuvel MJ1，Peralta CG，Hatta K，Han VK，Clark DA)。

[0012] 以上提及的治疗具有许多缺陷和缺点。例如，它们需要患者重复住院以及持久的医生监管。此外，由于患者住院，他们可能暴露于医院获得性感染。此外，这些方法与干预治疗的风险和副作用相关(包括致命性的风险和副作用，如由人类衍生产品引起的败血症、由脂肪乳浊液输注引起的过度凝血)。此外，这些治疗与严重的副作用相关。

[0013] 本发明解决了这些问题，并且与现有技术相比，提供了各种优点。

发明内容

[0014] 本发明提供了包含脂肪酸或其酯的组合的口服组合物，用于在体外受精(IVF)情况中经历反复自然流产(RSA)或反复植入失败(RIF)并且具有提高的数量和/或细胞毒性的外周血NK细胞的女性使用。

[0015] 本发明的组合物包含脂肪酸或其酯的组合作为活性成分，并且以特定的含量并在特定的时间段中给予。

[0016] 因此，本发明的目的在于防止相当大数量的面对相关问题的夫妇群的免疫介导的低生育力，这除了家庭状况以外，剥夺了他们生孩子的机会，可能还具有不可忽视的社会、心理和经济影响。

[0017] 发明详述

[0018] 现在令人惊讶地发现了以特定含量并在特定时间段内给予的包含脂肪酸或其酯的混合物的口服组合物降低了正经历反复自然流产(RSA)或反复植入失败(RIF)并具有提高数量的外周血NK细胞和/或提高的外周血NK细胞细胞毒性的女性的外周血NK细胞的数量和细胞毒性。

[0019] 因此，本发明提供了包含脂肪酸或其酯的组合作为活性成分的口服组合物，用于治疗在总外周血细胞中具有12％或更多的外周血NK细胞的人类女性受试者和/或其中人类女性受试者的外周血NK细胞的细胞毒性比没有生育失败和已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康人类女性的对照群的平均细胞毒性高至少10％的反复自然流产或反复植入失败的治疗方法中，其中将组合物口服给予15至70天并且其中每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.03g/kg体重至1g/kg体重，按照脂肪酸计算。

[0020] 本发明还提供了用于治疗在总外周血细胞中具有12％或更多的外周血NK细胞的人类女性受试者和/或其中人类女性受试者的外周血NK细胞的细胞毒性比没有生育失败和已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康人类女性的对照群的平均细胞毒性高至少10％的反复自然流产或反复植入失败的治疗方法，所述方法包括向人类女性受试者施用包含脂肪酸或其酯的组合作为活性成分的口服组合物，其中将组合物口服给予15至70天并且其中每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.03g/kg体重至1g/kg体重，按照脂肪酸计算。

[0021] 为了评价NK细胞细胞毒性，使用了几种方法。尽管51Cr释放是用于测定细胞毒性的经典方法，但可替换的方法是可利用的并且几种其他方法在研发阶段中。在不希望或不允许使用放射性同位素的实验室中，或使用不容易吸收51Cr标记的肿瘤靶细胞时，可以使用利用酶和比色或测定荧光的染料的测试系统。目前，最常用的测定NK细胞活性的方法是流式细胞术，这是可以根据试剂的使用进行改变的方法，然而结果仍然相同(Determination of natural killer cell function by flow cytometry.Kimberly I.Kane等，Clinical and diagnostic laboratory immunology，1996年5月，p.295-300；
Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings，R.Valiathan等，2011The Authors.Scandinavian Journal of Immunology)。

[0022] 本领域技术人员认识到由于许多可能的对NK细胞的免疫和内分泌影响，NK细胞毒性通常在个体内是多变的。因此，重复测试健康个体时，预期NK活性会有微小变化。不同的对照群可能提供不同的平均NK细胞毒性值。为了具有统计学上正确的结果，对照样品越多越好。然而，本发明适用于外周血NK细胞的细胞毒性比没有生育失败(如流产或不成功的IVF)并且已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康人类女性的对照群的平均细胞毒性高至少10％的人类女性受试者。

[0023] 根据本发明，将术语“反复自然流产(RSA)”定义为两次或更多次的怀孕的第20妊娠周前的自然流产。

[0024] 根据本发明，将术语“反复植入失败(RIF)”定义为两次重复的不成功的体外受精(IVF)周期，或胞质内精子注射(ICSI)或冷冻胚胎替代周期后不存在植入。

[0025] 根据本发明，将提高的外周血NK细胞的细胞毒性定义为比没有生育失败(如流产或不成功的IVF)并且已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康女性的对照群的平均细胞毒性高至少10％的任何杀伤活性。

[0026] 术语“反复自然流产或反复植入失败的治疗”表示与已经暴露的尚未治疗的风险相比，治疗的受试者的流产风险的降低，以及怀孕结果的改善。

[0027] 根据本发明，术语“脂肪酸”表示具有饱和或不饱和链(通常包含4至28个碳原子)的脂肪族一元羧酸。

[0028] 根据本发明，术语“长链脂肪酸”表示具有13个更多个碳原子的脂肪族链的脂肪酸。

[0029] 根据本发明，术语“中链脂肪酸”表示具有6至12个碳原子的脂肪族链的脂肪酸。

[0030] 根据本发明，术语“短链脂肪酸”表示具有少于6个碳原子的脂肪族链的脂肪酸。

[0031] 本发明的组合物包含脂肪酸或其酯的组合。脂肪酸包括短链、中链或长链，饱和或不饱和的脂肪酸。优选，本发明的组合物包含长链脂肪酸或长链和中链脂肪酸。

[0032] 饱和长链脂肪酸的实例包括棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸和花生酸。

[0033] 单不饱和的长链脂肪酸的实例包括油酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、棕榈酸、肉豆蔻油酸(myristoleic)和十六碳烯酸(sapienic acid)。

[0034] 多不饱和的长链脂肪酸的实例包括亚油酸、α-亚麻酸和γ-亚麻酸。

[0035] 中链脂肪酸的实例包括月桂酸、癸酸和辛酸。

[0036] 短链脂肪酸的实例包括丁酸、2-甲基丙酸、戊酸和3-甲基丁酸。

[0037] 本发明的组合物的脂肪酸酯是脂肪酸与脂肪族醇(如C1-C6醇)的酯、甘油酯，即，甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯，磷脂，如磷脂酸或磷酸甘油酯、鞘脂、糖脂、蜡及其混合物。优选，所述脂肪酸酯是甘油酯、磷脂、鞘脂或糖脂及其混合物。更优选，脂肪酸酯是甘油酯。

[0038] 根据本发明，术语“按照脂肪酸计算”表示组合物包含脂肪酸酯时，必须将它们的量转换成相应脂肪酸的那些，以确定待给予的口服组合物的量。

[0039] 优选，本发明的组合物包含至少一种饱和、至少一种单不饱和和至少一种多不饱和的长链脂肪酸或其酯。

[0040] 优选，本发明的组合物中按照脂肪酸计算的至少50％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。更优选，本发明的组合物中按照脂肪酸计算的至少65％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。再更优选，本发明的组合物中按照脂肪酸计算的至少97％重量的活性成分是长链脂肪酸或其酯。

[0041] 本发明的组合物的脂肪酸作为胞内和胞间介质，对其中涉及NK细胞的免疫和炎性应答具有各种作用。脂肪酸通过几种机制涉及免疫系统的调节，包括(i)膜流动性；(ii)脂质过氧化物的产生；(iii)类花生酸(eicosanoid)合成；和(iv)对基因调节的影响。可能脂肪酸免疫调节不仅通过单独的因素发生，而且还通过这些因素的集体作用

[0042] 本发明的组合物可以包含其他活性成分，如维生素、金属离子或氨基酸。存在这些活性成分时，它们的总量优选低于活性成分总量的6％。维生素的实例包括维生素B1、B2、B3、B6、D、肌-肌醇、肌醇和叶酸。金属离子可以包括例如硒、镁、铜、锌或锰。氨基酸可以包括天然产生的氨基酸，如L-精氨酸或L-谷氨酸。维生素、金属离子或氨基酸不直接引起NK细胞的数量和/或细胞毒性活性的降低，但通过支持物理屏障、细胞免疫力和抗体产生有助于身体的免疫防御。尽管如此，认为类固醇激素1,25-二羟基维生素D3(1,25-(OH)2-D3)具有免疫抑制作用。

[0043] 本发明的组合物中维生素的存在对其中发现有NK细胞的环境呈现出免疫调节和内衡作用。目的是为了形成有利的环境并促进整个生育过程的改善，通过保持免疫系统平衡调节母体应答。然而，提高的维生素水平可能加强免疫系统并提高NK细胞的作用。出于这个原因，维生素存在于本发明的组合物中时，它们的总量优选低于活性成分总量的4％。

[0044] 本发明的组合物可以具有适用于口服的任何形式。这样的形式是本领域技术人员公知的，并且它们包括液体形式，如口服液、口服悬浮液或口服乳液、口服凝胶或固体形式，如片剂、胶囊或小袋。本发明的组合物可以作为营养补充剂来给予。

[0045] 除了活性成分，本发明的组合物可以包含一种或多种本领域公知的药物学上可接受的赋形剂，如粘合剂、稀释剂、崩解剂、悬浮剂、润滑剂、溶剂、乳化剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂等。

[0046] 可以通过本领域技术人员公知的方法来生产组合物。

[0047] 将本发明的组合物给予15至70天。优选，将组合物给予30至60天。更优选，将组合物给予40至50天。

[0048] 本发明的组合物可以每天给予一次或每天超过一次，例如，每天两次。无论如何，根据本发明，每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.03g/kg体重至1g/kg体重，按照脂肪酸计算。优选，每天给予的脂肪酸或其酯的总量为约0.10g/kg体重至0.70g/kg体重，按照脂肪酸计算。更优选，每天给予的脂肪酸或其酯的总量为0.20g/kg体重至0.50g/kg体重，按照脂肪酸计算。

[0049] 本发明的组合物特别是降低了外周血NK细胞的数量和细胞毒性，而没有整体抑制免疫系统。

[0050] 使用本发明，在停止治疗后，总的外周血细胞中的NK细胞细胞毒性和NK细胞百分比都保持低水平12-14周，在具有增加数量的外周血NK细胞和/或提高的外周血NK细胞活性的低生育力女性中获得了RSA或RIF的延长保护和预防。这代表了优于静脉内给予的很大进步，在 中，停止治疗6-9周后作用结束(Acacio B，Ng SC，Coulam CB.，Am J Reprod Immunol.2008年9月；60(3):258-63.doi:10.1111/j.1600-0897.2008.00621.x.Duration of intralipid’s suppressive effect on NK cell’s functional activity Roussev RG)。此外，使用 的治疗降低了外
周血NK细胞的细胞毒性，但已知没有降低外周血NK细胞的数量。相反，本发明降低了外周血NK细胞的数量和细胞毒性。此外， 的静脉内输注可能引起严重的副作用，
如膀胱疼痛，血尿或尿液浑浊，寒战，排尿困难、排尿有灼烧感、排尿疼痛，发烧，频繁的尿意，腰背或侧背疼痛，嗓子疼和呕吐，而本发明没有显示出这些副作用。

[0051] 与其中使用静脉内或皮下(淋巴细胞免疫)输注的现有技术的治疗相反，使用本发明，口服组合物及其组分通过消化道消化并且遵循正常的食物食用和吸收过程。这样，与现有技术的治疗相比，RSA或RIF的治疗变得更容易和更安全。此外，使用本发明，不需要住院或持续的医生监管，并且保护女性免于暴露于医院获得性感染。此外，本发明与干预治疗的风险和副作用无关。此外，与现有技术的治疗相比，使用本发明，外周血NK细胞的数量和细胞毒性的降低在停止治疗后持续较长时间，并且获得了延长的保护。

具体实施方式

[0052] 实施例1-4说明了本发明的组合物在外周血NK细胞及其活性(细胞毒性)的降低中的作用。将组合物给予于正经历RSA或RIF并且具有增加数量的外周血NK细胞和提高的外周血NK细胞活性的生育年龄(25-46岁)的健康女性。在开始治疗前的第零天、根据情况在第45天和第70天，测试了来自所有女性的血样。所有人在停止治疗后的12周进行了常规检查。

[0053] 使用之前描述的技术，通过流式细胞术进行了外周血样品的总淋巴细胞中的NK细胞百分比和NK细胞活性的测定(Determination of natural killer cell function by flow cytometry.Kimberly I.Kane等，Clinical and diagnostic laboratory immunology，1996年5月，p.295-300；Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings，R.Valiathan等.2011The Authors.Scandinavian Journal of Immunology)。这种方法获得了被PBL中存在的自然细胞毒性细胞杀伤的靶细胞的百分比。使用两种荧光染料来区分效应细胞和靶细胞以及活的和死的靶细胞。一种是绿色荧光染料，3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO)，其用于标记K562的质膜，用作靶群的人红白血病(erythroleukaemic)肿瘤细胞系。第二种染料碘化丙啶(PI)，膜不可透过的红色荧光染料，其在靶细胞膜被NK样细胞破坏时，在测定过程中加入。未受效应子影响的完整靶细胞是单阳性的(并且只呈现出绿色荧光)，而被效应子杀伤的带有被破坏的膜的靶是双阳性的(并且呈现出绿色以及红色荧光)。将效应子和靶细胞加入试管中，以形成不同的效应子与靶(E:T)的比例，1:50，1:25和1:12.5。在一些实施例中，以50:1的E:T比例呈现结果(Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin,intralipid and solube human leukocyte antigen-G.Roussev RG1，Ng SC，Coulam CB.Am J Reprod Immunol.2007年4月；57(4):262-9)。

[0054] 对照样品是没有生育失败(如流产或不成功的IVF)并且已经生育至少一个孩子的生育年龄的健康女性。基于健康对照群，在50:1比例下，平均NK细胞毒性为19％。

[0055] 通过上述测定，NK细胞细胞毒性和数量从第0天到第70天的变化是可测量的。在本发明组合物的给予过程中，基线表示NK细胞活性和数量的平均百分比在45天后显著降低，并随后在70天后降至接近于其基线水平。在口服组合物给予后的重复测量显示出NK细胞的数量以及细胞毒性的显著降低。

[0056] 在以下的实施例中，使用了以下缩写：

[0057] LCFA-长链脂肪酸

[0058] SFA-饱和脂肪酸

[0059] MUFA-单不饱和脂肪酸

[0060] PUFA-多不饱和脂肪酸

[0061] MCFA-中链脂肪酸

[0062] 实施例1

[0063] 将一组15名女性每天用口服组合物1治疗一次，所述组合物以口服溶液的形式，包含表1a中所示的活性成分。组合物的脂肪酸是甘油酯的形式。给予的组合物的量使得每天给予的脂肪酸的总量为0.25g/kg体重。在开始治疗之前和开始治疗后45天收集血样并测试。

[0064] 表1a

[0065]

[0066] 外周血NK细胞的数量和活性的结果显示于表1b中。

[0067] 表1b：(45天)

[0068]

[0069] 在治疗前的第0天，总的外周血细胞中的外周血NK细胞的平均百分比为20.25，并且在治疗开始后的第45天，为13.59。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.0001)。

[0070] 在治疗前的第0天，50:1比例下的外周血NK细胞的平均活性为46.26，并且在治疗开始后的第45天，为18.54。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.0001)。

[0071] 上述组的五名女性继续治疗，总共持续了70天。在第70天测试她们的外周血NK细胞数量和活性。结果显示于表1c中。

[0072] 表1c：(70天)

[0073]

[0074] 在治疗前的第0天，总的外周血细胞中的外周血NK细胞的平均百分比为18.42，并且在开始治疗后的第70天为11.45。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.0001)。

[0075] 在治疗前的第0天，50:1比例下的外周血NK细胞的平均活性为46.54，并且在治疗开始后的第45天，为13.60。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.0001)。

[0076] 所有用这种组合物治疗的女性目前都怀孕了。

[0077] 实施例2

[0078] 在第0天，以及在每天给予一次口服组合物2后第70天，测试了一组6名女性的NK细胞数量和活性。组合物是包含表2a中所示活性成分的口服溶液的形式。组合物的脂肪酸是甘油酯的形式。给予的组合物的量使得每天给予的脂肪酸的总量为0.25g/kg体重。

[0079] 表2a

[0080]

[0081] 外周血NK细胞的数量和活性的结果显示于表2b中。

[0082] 表2b：

[0083]

[0084] 在治疗前的第0天，总的外周血细胞中的外周血NK细胞的平均百分比为18.45，并且在开始治疗后的第70天为12.80。这种差异在统计学上是显著的(p值0.001)。

[0085] 在治疗前的第0天，50:1比例下的外周血NK细胞的平均活性为43.32，并且在治疗开始后的第70天，为19。这种差异在统计学上是显著的(p值0.001)。

[0086] 实施例3

[0087] 在这组中，在给予前以及在每天给予一次口服组合物3后的第45天，收集并测试了6名患者的血样。组合物是包含表3a中所示的活性成分的口服溶液的形式。组合物的脂肪酸是甘油酯的形式。给予的组合物的量使得每天给予的脂肪酸的总量为0.25g/kg体重。

[0088] 表3a

[0089]

[0090] 外周血NK细胞的数量和活性的结果显示于表3b中。

[0091] 表3b：

[0092]

[0093] 在治疗前的第0天，总的外周血细胞中的外周血NK细胞的平均百分比为17.84，并且在开始治疗后的第45天为12.40。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.001)。

[0094] 在治疗前的第0天，50:1比例下的外周血NK细胞的平均活性为36，并且在治疗开始后的第45天，为16.6。这种差异在统计学上是显著的(p值0.001)。

[0095] 用这种组合物治疗的六名女性中有三名已经分娩并且有2名怀孕了。

[0096] 实施例4

[0097] 在这组中，在给予前以及在每天给予一次口服组合物4后的第45天，收集并测试了8名患者的血样。组合物是包含表4a中所示的活性成分的口服溶液的形式。组合物的脂肪酸是甘油酯的形式。给予的组合物的量使得每天给予的脂肪酸的总量为0.25g/kg体重。

[0098] 表4a

[0099]

[0100] 外周血NK细胞的数量和活性的结果显示于表4b中。

[0101] 表4b

[0102]

[0103] 在治疗前的第0天，总的外周血细胞中的外周血NK细胞的平均百分比为18.97，并且在开始治疗后的第45天为14.55。这种差异在统计学上是显著的(p值<0.017)。

[0104] 用这种口服组合物治疗的八名女性中的五名已经分娩健康的孩子，2名在第25周后目前怀孕了，而1名已经流产。