用于治疗多囊肾病的修饰的低聚核苷酸

摘要

本文提供使用靶向miR-17的修饰的低聚核苷酸治疗包括常染色体显性多囊肾病的多囊肾病的方法。

权利要求

1.一种化合物，其包含由9个连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸，其中所述修饰的低聚核苷酸在5'至3'取向上具有以下核苷模式：NSNSNMNFNFNFNMNSNS

其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且所有键联都是硫代磷酸酯键联；并且其中所述修饰的低聚核苷酸的核碱基序列包含核碱基序列5'-CACUUU-3'，其中每个胞嘧啶独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸的所述核碱基序列包含核碱基序列5'-GCACUUU-3'，其中每个胞嘧啶独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸的所述核碱基序列为5'-AGCACUUUG-3'，其中每个胞嘧啶选择独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

4.如权利要求1、2或3中任一项所述的化合物，其中每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。

5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中所述化合物由所述修饰的低聚核苷酸或其药学上可接受的盐组成。

6.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是钠盐。

7.一种修饰的低聚核苷酸，其具有结构：

或其药学上可接受的盐。

8.如权利要求7所述的修饰的低聚核苷酸，其是所述结构的药学上可接受的盐。

9.如权利要求7所述的修饰的低聚核苷酸，其是所述结构的钠盐。

10.一种修饰的低聚核苷酸，其具有结构：

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1至6中任一项所述的化合物或如权利要求7至

10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸及药学上可接受的稀释剂。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂是水溶液。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述水溶液是盐水溶液。

14.一种药物组合物，其包含如权利要求1至6中任一项所述的化合物或如权利要求7至

10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸，其为冻干的组合物。

15.一种药物组合物，其基本上由盐水溶液中的如权利要求1至6中任一项所述的化合物或如权利要求7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸组成。

16.一种用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在细胞中的活性的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1至6中任一项所述的化合物或根据权利要求7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸接触。

17.一种用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在受试者中的活性的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求11至15中任一项所述的药物组合物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有与miR-17相关的疾病。

说明书

用于治疗多囊肾病的修饰的低聚核苷酸

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2016年12月5日提交的美国临时申请号62/430,139的优先权权益，该申请出于任何目的通过引用整体并入本文。

技术领域

[0003] 本文提供用于治疗多囊肾病的组合物和方法。

背景技术

[0004] 多囊肾病的特征在于在肾脏中积聚多个充满流体的囊肿。这些囊肿由称为囊肿上皮的单层上皮细胞排列。随着时间的推移，由于细胞增殖升高和由囊肿上皮细胞引起的流体活性分泌，囊肿的大小增加。增大的囊肿压迫周围正常组织，导致肾功能下降。该疾病最终进展为终末期肾病，需要透析或肾移植。在这个阶段，囊肿可能被含有萎缩性小管的纤维化区域包围。

[0005] 许多遗传性病症可以导致多囊肾病(PKD)。各种形式的PKD根据以下方式辨别：遗传，例如常染色体显性遗传或常染色体隐性遗传；器官的介入和肾脏外表型的表现；终末期肾病的发病年龄，例如出生时、儿童期或成年期；以及与疾病相关的潜在基因突变。参见，例如，Kurschat等，2014，Nature Reviews Nephrology,10:687-699。

发明内容

[0006] 实施方案1.一种包含由9个连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸在5'至3'取向上具有以下核苷模式：

[0007] NSNSNMNFNFNFNMNSNS

[0008] 其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且所有键联都是硫代磷酸酯键联；并且[0009] 其中所述修饰的低聚核苷酸的核碱基序列包含核碱基序列5'-CACUUU-3'，其中每个胞嘧啶独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。

[0010] 实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸的所述核碱基序列包含核碱基序列5'-GCACUUU-3'，其中每个胞嘧啶独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

[0011] 实施方案3.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸的所述核碱基序列为5'-AGCACUUUG-3'，其中每个胞嘧啶选择独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

[0012] 实施方案4.如实施方案1、2或3中任一项所述的化合物，其中每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。

[0013] 实施方案5.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述化合物由所述修饰的低聚核苷酸或其药学上可接受的盐组成。

[0014] 实施方案6.如实施方案1至5中任一项所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是钠盐。

[0015] 实施方案7.一种修饰的低聚核苷酸，其具有结构：

[0016] 或其药学上可接受的盐。

[0017] 实施方案8.如实施方案7所述的修饰的低聚核苷酸，其是所述结构的药学上可接受的盐。

[0018] 实施方案9.如实施方案7所述的修饰的低聚核苷酸，其是所述结构的钠盐。

[0019] 实施方案10.一种修饰的低聚核苷酸，其具有结构：

[0020]

[0021] 实施方案11.一种药物组合物，其包含如实施方案1至6中任一项所述的化合物或如实施方案7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸和药学上可接受的稀释剂。

[0022] 实施方案12.如实施方案11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂是水溶液。

[0023] 实施方案13.如实施方案12所述的药物组合物，其中所述水溶液是盐水溶液。

[0024] 实施方案14.一种药物组合物，其包含如实施方案1至6中任一项所述的化合物或如实施方案7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸，其为冻干组合物。

[0025] 实施方案15.一种药物组合物，其基本上由盐水溶液中的如实施方案1至6中任一项所述的化合物或如实施方案7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸组成。

[0026] 实施方案16.一种用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在细胞中的活性的方法，其包括使所述细胞与如实施方案1至6中任一项所述的化合物或如实施方案7至10中任一项所述的修饰的低聚核苷酸接触。

[0027] 实施方案17.一种用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在受试者中的活性的方法，其包括向所述受试者施用如实施方案11至15中任一项所述的药物组合物。

[0028] 实施方案18.如实施方案17所述的方法，其中所述受试者患有与miR-17相关的疾病。

附图说明

[0029] 图1A-1B.(A)RG4326在miR-17荧光素酶测定中的活性。(B)RG4326在miR-17家族成员荧光素酶测定中的活性。

[0030] 图2.用RG4326或对照RG5124治疗后IMCD3细胞中的PD标志分数。

[0031] 图3A-3B.miPSA显示(A)野生型小鼠的肾脏和(B)RG4326治疗的小鼠的肾脏中的miR-17靶标接合。

[0032] 图4A-4C.RG4326在PKD的Pkd2-KO模型中的功效。治疗对(A)肾重-体重比、(B)血尿素氮(BUN)水平和(C)囊性指数的影响。

[0033] 图5A-5C.RG4326在PKD的Pcy模型中的功效。治疗对(A)肾重-体重比、(B)血尿素氮(BUN)水平和(C)囊性指数的影响。

具体实施方式

[0034] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。除非提供具体的定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学中使用的命名法及工序和技术是本领域公知且常用的那些。在针对本文的术语存在多个定义的情况下，则以本节中的定义为准。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者的治疗。某些此类技术和工序可见于例如“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Sangvi和Cook编辑，美国化学学会，Washington D.C.,1994；和“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第18版，1990；并且所述文献出于任何目的以引用的方式并入。除非另外说明，否则在允许的情况下，在本文的整个公开中提到的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、GENBANK序列、网站及其他公开的材料以引用的方式整体并入。在提及URL或其他此类标识符或地址的情况下，应理解此类标识符可以变化，并且互联网上的具体信息可以变化，但是等效信息可以通过搜索互联网来找到。如此提及证明了此类信息的可用性和公众传播。

[0035] 在公开并描述本发明的组合物和方法之前，应理解本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不意图加以限制。应当注意，除非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种”和“所述”包括复数个/种指示物。

[0036] 定义

[0037] “多囊肾病”或“PKD”是以在肾脏中积聚多个充满流体的囊肿为特征的囊性肾病。在至少一个肾脏中形成多个囊肿，经常导致一个或多个受影响的肾脏扩大和肾功能的进展性丧失。

[0038] “多囊肾病的标志”意指用于评估多囊肾病的严重程度、肾功能和/或患有多囊肾病的受试者对治疗的反应的医学参数。多囊肾病标志的非限制性实例包括总肾体积、高血压、肾小球滤过率和肾痛。

[0039] “肾功能标志”意指用于评估受试者的肾功能的医学参数。肾功能标志的非限制性实例包括肾小球滤过率、血尿素氮水平和血清肌酐水平。

[0040] “常染色体显性多囊肾病”或“ADPKD”是由PKD1和/或PKD2基因中的一个或多个基因突变引起的多囊肾病。85％的ADPKD是由位于染色体16上的PKD1中的突变引起的，其中大部分剩余的ADPKD病例是由位于染色体4上的PKD2中的突变引起的。

[0041] “常染色体隐性多囊肾病”或“ARPKD”是由位于染色体6上的PKHD1基因中的一个或多个基因突变引起的多囊肾病。高达50％的患有ARPKD的新生儿死于宫内肾脏疾病的并发症，并且约三分之一的存活者在10年内发展为终末期肾病(ESRD)。

[0042] “肾痨”或“NPHP”意指常染色体隐性囊性肾病，其特征在于皮质髓质囊肿、管状基底膜破裂和肾小管间质性肾病。

[0043] “总肾体积”或“TKV”是总肾体积的量度。总肾体积可以通过磁共振成像(MRI)、计算机断层(CT)扫描或超声(US)成像确定，并且所述体积通过诸如椭圆体积方程(用于超声)或通过定量立体学或边界追踪(用于CT/MRI)的标准方法计算。

[0044] “身高调整的总肾体积”或“HtTKV”是每单位身高的总肾体积的量度。预计HtTKV值≥600ml/m的患者在8年内发展为3期慢性肾病。

[0045] “肾痛”意指临床上显著的肾痛，其需要请病假，药物治疗(麻醉或最后手段的止痛剂)，或侵入性干预。

[0046] “恶化的高血压”意指需要开始或增加高血压治疗的血压变化。

[0047] “纤维化”意指器官或组织中过量纤维结缔组织的形成或发展。在某些实施方案中，纤维化作为修复或反应过程发生。在某些实施方案中，纤维化响应于损坏或损伤而发生。术语“纤维化”应理解为在器官或组织中形成或发展过量的纤维结缔组织作为修复或反应过程，这与作为器官或组织的正常组成部分的纤维组织的形成相反。

[0048] “血尿”意指尿液中存在红细胞。

[0049] “白蛋白尿”意指尿液中存在过量白蛋白，并且包括但不限于正常白蛋白尿、高正常白蛋白尿、微量白蛋白尿和大量白蛋白尿。正常地，由足细胞、肾小球基底膜和内皮细胞组成的肾小球滤过渗透屏障防止血清蛋白质泄漏到尿液中。白蛋白尿可以反映肾小球滤过渗透屏障的损伤。白蛋白尿可以从24小时尿液样品、过夜尿液样品或点尿样品计算。

[0050] “高正常白蛋白尿”意指白蛋白尿升高，其特征在于(i)每24小时向尿液中排出15mg至<30mg白蛋白和/或(ii)男性白蛋白/肌酐比为1.25mg/mmol至<2.5mg/mmol(或10mg/g至<20mg/g)或女性白蛋白/肌酐比为1.75mg/mmol至<3.5mg/mmol(或15mg/g至<30mg/g)。

[0051] “微量白蛋白尿”意指白蛋白尿升高，其特征在于(i)每24小时向尿液中排出30mg至300mg白蛋白和/或(ii)男性白蛋白/肌酐比为2.5mg/mmol至<25mg/mmol(或20mg/g至<200mg/g)或女性白蛋白/肌酐比为3.5mg/mmol至<35mg/mmol(或30mg/g至<300mg/g)。

[0052] “大量白蛋白尿”意指白蛋白尿升高，其特征在于(i)每24小时向尿液中排出大于300mg白蛋白和/或(ii)男性白蛋白/肌酐比>25mg/mmol(或>200mg/g)或女性白蛋白/肌酐比>35mg/mmol(或>300mg/g)。

[0053] “白蛋白/肌酐比”意指尿白蛋白(mg/dL)/尿肌酐(g/dL)的比率，并且表示为mg/g。在某些实施方案中，白蛋白/肌酐比可以从点尿样品计算，并且可以用作24小时期间白蛋白排泄的估计值。

[0054] “肾小球滤过率”或“GFR”意指通过肾脏的过滤流体的流速，并且用作受试者中肾功能的指标。在某些实施方案中，受试者的GFR通过计算估计的肾小球滤过率来确定。在某些实施方案中，受试者的GFR使用菊粉方法在受试者中直接测量。

[0055] “估计的肾小球滤过率”或“eGFR”意指肾脏过滤肌酐的程度的测量，并且用于粗略估计肾小球滤过率。由于GFR的直接测量是复杂的，所以eGFR经常用于临床实践。正常结果可以在90-120mL/min/1.73m2的范围内。持续3个月或更久时间低于60mL/min/1.73m2的水平可以是慢性肾病的指标。低于15mL/min/1.73m2的水平可以是肾衰竭的指标。

[0056] “蛋白尿”意指尿液中存在过量的血清蛋白。蛋白尿的特征可以在于每24小时有>250mg蛋白质排泄到尿液中和/或尿蛋白质与肌酐比>0.20mg/mg。与蛋白尿相关的升高的血清蛋白包括但不限于白蛋白。

[0057] “血尿素氮水平”或“BUN水平”意指血液中以尿素形式的氮的量的量度。肝脏在尿素循环中产生作为蛋白质消化的废物的尿素，并且尿液通过肾脏从血液中除去。正常人类成人血液每100ml血液可以含有7mg至21mg尿素氮(7-21mg/dL)。血尿素氮水平的测量用作肾健康的指标。如果肾脏不能从血液中正常地除去尿素，则受试者的BUN水平上升。

[0058] “升高”意味着被认为是临床相关的医学参数增加。健康专业人员可以确定增加是否具有临床意义。

[0059] “终末期肾病(ESRD)”意指肾功能完全或几乎完全衰竭。

[0060] “生活质量”意指受试者的身体、心理和社会功能受疾病和/或疾病治疗损害的程度。患有多囊肾病的受试者的生活质量可能会降低。

[0061] “肾功能受损”意指相对于正常肾功能而言肾功能降低。

[0062] “减缓......的恶化”和“减缓恶化”意指降低医学病状朝向晚期状态转移的速率。

[0063] “延迟进行透析的时间”意指维持足够的肾功能，从而延迟对透析治疗的需求。

[0064] “延迟进行肾移植的时间”意指维持足够的肾功能，从而延迟对肾移植的需求。

[0065] “改善预期寿命”意指通过治疗受试者的疾病的一种或多种症状来延长受试者的生命。

[0066] “受试者”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。

[0067] “有需要的受试者意指被鉴定为需要疗法或治疗的受试者。

[0068] “疑似患有......的受试者”意指表现出疾病的一个或多个临床指标的受试者。

[0069] “与miR-17相关的疾病”意指由一种或多种miR-17家族成员的活性调节的疾病或病状。

[0070] “施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自施用进行施用。

[0071] “胃肠外施用”意指通过注射或输注施用。

[0072] 胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用和肌肉内施用。

[0073] “皮下施用”意指刚好在皮肤下方施用。

[0074] “静脉内施用”意指施用到静脉中。

[0075] “伴随施用”是指在相同时间以任何方式共同施用两种或更多种药剂，其中两种药剂的药理学作用均在患者中显现。

[0076] 伴随施用不要求以单一药物组合物、以相同剂型或通过相同的施用途径来施用两种药剂。两种药剂的作用本身不需要同时显现出来。所述作用仅需要重叠一段时间并且不需要共延。

[0077] “持续时间”意指活性或事件持续的一段时间。在某些实施方案中，治疗的持续时间是施用多剂量的药剂或药物组合物的一段时间。

[0078] “疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括但不限于向患有疾病的受试者施用一种或多种药剂。

[0079] “治疗”意指施加一种或多种用于减轻疾病的至少一种指标的特定工序。在某些实施方案中，所述特定工序是施用一种或多种药剂。在某些实施方案中，PKD的治疗包括但不限于降低总肾体积、改善肾功能、降低高血压和/或降低肾痛。

[0080] “减轻”意指减低病状或疾病的至少一个指标的严重程度。在某些实施方案中，减轻包括延迟或减缓病状或疾病的一个或多个指标的进展。指标的严重程度可以通过本领域的技术人员已知的主观或客观量度来确定。

[0081] “处于发展……的风险”意指受试者易于发展病状或疾病的状态。在某些实施方案中，处于发展病状或疾病的风险的受试者展现出所述病状或疾病的一种或多种症状，但是没有表现出被诊断患有所述病状或疾病的足够数量的症状。在某些实施方案中，处于发展病状或疾病的风险的受试者表现出所述病状或疾病的一种或多种症状，但达到被诊断患有所述病状或疾病所要求的较低程度。

[0082] “预防......的发作”意指在处于发展疾病或病状的风险的受试者中预防所述病状或疾病的发展。在某些实施方案中，处于发展疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有所述疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。

[0083] “延迟......的发作”意指延迟处于发展疾病或病状的风险的受试者中所述病状或疾病的发展。在某些实施方案中，处于发展疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有所述疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。

[0084] “剂量”意指在单次施用中提供的药剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂施用。例如，在某些实施方案中，在希望皮下施用的情况下，所希望的剂量要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施方案中，可以使用两次或更多次注射来达到所需剂量。在某些实施方案中，剂量可以两次或更多次注射施用以使个体体内的注射部位反应减到最小。在某些实施方案中，剂量作为缓慢输注施用。

[0085] “剂量单位”意指提供药剂的形式。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干的低聚核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有重构的低聚核苷酸的小瓶。

[0086] “治疗有效量”是指对动物提供治疗益处的药剂的量。

[0087] “药物组合物”意指包括药剂的适合向个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含无菌水溶液。

[0088] “药剂”意指当向受试者施用时提供治疗作用的物质。

[0089] “活性药物成分”意指药物组合物中提供所需作用的物质。

[0090] “药学上可接受的盐”意指本文提供的化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即保留化合物的所需生物活性并且当施用到受试者时不具有不希望的毒理学作用的盐。本文提供的化合物的非限制性示例性药学上可接受的盐包括钠盐形式和钾盐形式。除非另外具体地指示，否则如本文使用的术语“化合物”、“低聚核苷酸”和“修饰的低聚核苷酸”包括其药学上可接受的盐。

[0091] “盐水溶液”意指氯化钠在水中的溶液。

[0092] “改善的器官功能”意指器官功能趋向于正常限制的变化。在某些实施方案中，器官功能通过测量存在于受试者的血液或尿液中的分子来评估。例如，在某些实施方案中，改善的肾功能通过血尿素氮水平的降低、蛋白尿的降低、白蛋白尿的降低等来测量。

[0093] “可接受的安全性概况”意指处于临床上可接受的限制内的副作用的模式。

[0094] “副作用”意指除所需作用外的可归因于治疗的生理学反应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。此类副作用可以直接或间接地检测。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。

[0095] 如本文所用的术语“血液”涵盖全血和血液级分，诸如血清和血浆。

[0096] “抗miR”意指具有与微RNA互补的核碱基序列的低聚核苷酸。在某些实施方案中，抗miR是修饰的低聚核苷酸。

[0097] “抗miR-17”意指具有与一个或多个miR-17家族成员互补的核碱基序列的修饰的低聚核苷酸。在某些实施方案中，抗miR-17与一个或多个miR-17家族成员完全互补(即，100％互补)。在某些实施方案中，抗miR-17与一个或多个miR-17家族成员至少80％、至少
85％、至少90％或至少95％互补。

[0098] “miR-17”意指具有核碱基序列5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'(SEQ ID NO:1)的成熟miRNA。

[0099] “miR-20a”意指具有核碱基序列5'-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3'(SEQ ID NO:2)的成熟miRNA。

[0100] “miR-20b”意指具有核碱基序列5'-CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3'(SEQ ID NO:3)的成熟miRNA。

[0101] “miR-93”意指具有核碱基序列5'-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3'(SEQ ID NO:4)的成熟miRNA。

[0102] “miR-106a”意指具有核碱基序列5'-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'(SEQ ID NO:5)的成熟miRNA。

[0103] “miR-106b”意指具有核碱基序列5'-UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU-3'(SEQ ID NO:6)的成熟miRNA。

[0104] “miR-17种子序列”意指核碱基序列5'-AAAGUG-3'，其存在于每个miR-17家族成员中。

[0105] “miR-17家族成员”意指具有包含miR-17种子序列的核碱基序列的成熟miRNA，并且其选自miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a和miR-106b。

[0106] “miR-17家族”意指以下组的miRNA：miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a和miR-106b，各自具有包含miR-17种子序列的核碱基序列。

[0107] “靶核酸”意指低聚化合物被设计与其进行杂交的核酸。

[0108] “靶向”意指将与靶核酸杂交的核碱基序列的设计和选择的过程。

[0109] “对......靶向”意指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。

[0110] “调节”意指干扰功能、量或活性。在某些实施方案中，调节意指功能、量或活性增加。在某些实施方案中，调节意指功能、量或活性减小。

[0111] “表达”意指基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中起作用的结构所借助的任何功能和步骤。

[0112] “核碱基序列”意指典型地以5'至3'取向列出且无关于任何糖、键联和/或核碱基修饰的低聚化合物或核酸中的连续核碱基的顺序。

[0113] “连续核碱基”意指在核酸中彼此紧邻的核碱基。

[0114] “核碱基互补性”意指两个核碱基经由氢键结非共价配对的能力。

[0115] “互补”意指一个核酸能够与另一个核酸或低聚核苷酸杂交。在某些实施方案中，互补是指低聚核苷酸能够与靶核酸杂交。

[0116] “完全互补”意指低聚核苷酸的每个核碱基能够与靶核酸中的每个相应位置处的核碱基配对。在某些实施方案中，低聚核苷酸与微RNA完全互补(也称为100％互补)，即，所述低聚核苷酸的每个核碱基与所述微RNA中的相应位置处的核碱基互补。修饰的低聚核苷酸可以与微RNA完全互补，并且具有小于微RNA的长度的多个连接的核苷。例如，具有16个连接的核苷的低聚核苷酸与微RNA完全互补，其中低聚核苷酸的每个核碱基与微RNA中的相应位置处的核碱基互补。在某些实施方案中，每个核碱基与微RNA茎环序列的区内的核碱基具有互补性的低聚核苷酸与所述微RNA茎环序列完全互补。

[0117] “互补性百分比”意指低聚核苷酸中与靶核酸的等长部分互补的核碱基的百分比。互补性百分比通过将所述低聚核苷酸中与所述靶核酸中的相应位置处的核碱基互补的核碱基数除以所述低聚核苷酸中的核碱基总数来计算。

[0118] “同一性百分比”意指第一核酸中与第二核酸中的相应位置处的核碱基相同的核碱基数除以第一核酸中的核碱基总数。在某些实施方案中，第一核酸是微RNA并且第二核酸是微RNA。在某些实施方案中，第一核酸是低聚核苷酸并且第二核酸是低聚核苷酸。

[0119] “杂交”意指通过核碱基互补性发生的互补核酸的退火。

[0120] “错配”意指第一核酸中的核碱基不能够与第二核酸的相应位置处的核碱基发生沃森-克里克(Watson-Crick)配对。

[0121] 在核碱基序列的上下文中的“相同”意指无关于糖、键联和/或核碱基修饰且无关于存在的任何嘧啶的甲基状态，具有相同的核碱基序列。

[0122] “微RNA”意指长度介于18与25个核碱基之间的内源性非编码RNA，所述内源性非编码RNA是由酶Dicer裂解前体微RNA的产物。成熟的微RNA的实例可以在称为miRBase(microrna.sanger.ac.uk/)的微RNA数据库中找到。在某些实施方案中，微RNA缩写为“miR”。

[0123] “微RNA调控的转录物”意指由微RNA调控的转录物。

[0124] “种子匹配序列”意指与种子序列互补并且长度与所述种子序列相同的核碱基序列。

[0125] “低聚化合物”意指包含多个连接的单体亚单元的化合物。低聚化合物包括低聚核苷酸。

[0126] “低聚核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物，所述连接的核苷各自可以彼此独立地是修饰或未修饰的。

[0127] “天然存在的核苷间键联”意指核苷之间的3'至5'磷酸二酯键联。

[0128] “天然糖”意指在DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中见到的糖。

[0129] “核苷间键联”意指相邻核苷之间的共价键联。

[0130] “连接的核苷”意指通过共价键联连接的核苷。

[0131] “核碱基”意指能够与另一个核碱基非共价配对的杂环部分。

[0132] “核苷”意指连接至糖部分的核碱基。

[0133] “核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。

[0134] “包含由许多连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸的化合物”意指包括具有指定数目的连接的核苷的修饰的低聚核苷酸的化合物。因此，所述化合物可以包括额外的取代基或缀合物。除非另外指示，否则修饰的低聚核苷酸不与互补链杂交，并且所述化合物不包括超出修饰的低聚核苷酸的那些之外的任何额外的核苷。

[0135] “修饰的低聚核苷酸”意指相对于天然存在的末端、糖、核碱基和/或核苷间键联具有一个或多个修饰的单链低聚核苷酸。修饰的低聚核苷酸可以包含未修饰的核苷。

[0136] “修饰的核苷”意指与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。修饰的核苷可以具有修饰的糖和未修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有天然糖和修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核苷是双环核苷。在某些实施方案中，修饰的核苷是非双环核苷。

[0137] “修饰的核苷间键联”意指与天然存在的核苷间键联相比的任何变化。

[0138] “硫代磷酸酯核苷间键联”意指其中非桥联原子之一是硫原子的核苷之间的键联。

[0139] “修饰的糖部分”意指与天然糖相比的取代和/或任何变化。

[0140] “未修饰的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。

[0141] “5-甲基胞嘧啶”意指包含连接至5位的甲基基团的胞嘧啶。

[0142] “非甲基化的胞嘧啶”意指不具有连接至5位的甲基的胞嘧啶。

[0143] “修饰的核碱基”意指不是未修饰的核碱基的任何核碱基。

[0144] “糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或修饰的糖部分。

[0145] “修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。

[0146] “2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”意指在2'位具有O-甲基修饰的糖。

[0147] “2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”意指在2'位具有O-甲氧基乙基修饰的糖。

[0148] “2'-氟”或“2'-F”意指具有2'位的氟修饰的糖。

[0149] “双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述修饰的糖部分包含连接所述4至7元环的两个原子的桥联以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施方案中，所述4至7元环是糖环。在某些实施方案中，所述4至7元环是呋喃糖基。在某些此类实施方案中，所述桥联连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳。非限制性示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。

[0150] “锁核酸(LNA)糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥联的取代的糖部分。

[0151] “ENA糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥联的取代的糖部分。

[0152] “约束的乙基(cEt)糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。在某些实施方案中，CH(CH3)-O桥联被约束为S取向。在某些实施方案中，CH(CH3)-O被约束为R取向。

[0153] “S-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含S-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。

[0154] “R-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含R-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。

[0155] “2'-O-甲基核苷”意指具有2'-O-甲基糖修饰的2'-修饰的核苷。

[0156] “2'-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2'-O-甲氧基乙基糖修饰的2'-修饰核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可以包含修饰的或未修饰的核碱基。

[0157] “2'-氟核苷”意指具有2'-氟糖修饰的2'-修饰的核苷。2'-氟核苷可以包含修饰的或未修饰的核碱基。

[0158] “双环核苷”意指具有双环糖部分的2'-修饰的核苷。双环核苷可以具有修饰的或未修饰的核碱基。

[0159] “cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含修饰的或未修饰的核碱基。

[0160] “S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。

[0161] “R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。

[0162] “β-D-脱氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。

[0163] “β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。

[0164] “LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。

[0165] “ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。

[0166] 综述

[0167] 多囊肾病(PKD)是肾病的遗传形式，其中充满流体的囊肿在肾脏中发展，从而导致肾上腺功能不全，并且通常导致终末期肾病。某些PKD的特征还在于肾脏肿大。囊肿的过度增殖是PKD的标志性病理特征。在PKD的管理中，治疗的主要目标是管理诸如高血压和感染的症状，维持肾功能，且预防终末期肾病(ESRD)的发作，从而改善PKD受试者的预期寿命。

[0168] 微RNA的miR-17～92簇的miR-17家族成员在小鼠PKD模型中上调。小鼠PKD模型中miR-17～92簇的遗传缺失降低肾囊肿生长，改善肾功能并延长存活(Patel等，PNAS,2013；110(26):10765-10770)。在PKD实验模型中，已经显示用研究工具化合物抑制miR-17降低肾重-体重比并改善肾功能。另外，miR-17抑制还遏制源自人供体囊肿的原代培养物的增殖和囊肿生长。

[0169] 为了鉴定对PKD受试者施用足够有效、安全且方便的一种或多种miR-17家族成员的抑制剂，设计了大约200种包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列的修饰的低聚核苷酸，其具有不同的长度和化学组成。化合物的长度范围为9至20个连接的核苷，并且化合物的数量、类型和化学修饰的位置不同。作为药理学，不能简单地基于化合物的化学结构预测药代动力学行为和安全性，在一系列的设计消除具有不利性质的化合物的试验中，在体外和体内评价化合物的特征，包括效力、功效、药代动力学行为、安全性和代谢稳定性。如本文所述，首先在几种体外测定(例如，效力、毒理学、代谢稳定性)中测试近200种化合物中的每一种，以鉴定适合于在更复杂的体内测定(例如，药代动力学概况、功效、毒理学)中进一步测试的较小组的化合物。该筛选过程鉴定用于治疗PKD的候选药剂RG4326。如本文所示，糖部分的类型和位置的变化导致对所测试化合物的包括效力和组织分布的性质的显著影响。选择RG4326作为候选药剂，因为相对于具有相同长度和核碱基序列但具有不同糖修饰模式的其他化合物，该化合物表现出最合适的药效学、安全性和药代动力学概况。

[0170] 本发明的某些化合物

[0171] 本文提供包含由9个连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸在5'至3'取向上具有以下核苷模式：

[0172] NSNSNMNFNFNFNMNSNS

[0173] 其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且其中，修饰的低聚核苷酸的核碱基序列包含核碱基序列5'-CACUUU-3'，其中每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的核碱基序列为5'-AGCACUUUG-3'，其中每个胞嘧啶为非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。在一些实施方案中，每个键联独立地选自磷酸二酯键联和硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，所有键联都是硫代磷酸酯键联。

[0174] 本文提供结构为ASGSCMAFCFUFUMUSGS的化合物，其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。在一些实施方案中，每个键联独立地选自磷酸二酯键联和硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，所有键联都是硫代磷酸酯键联。

[0175] 本文提供结构为ASGSCMAFCFUFUMUSGS的化合物，其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每个键联独立地选自磷酸二酯键联和硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，所有键联都是硫代磷酸酯键联。

[0176] 本文提供包含由9个连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸的化合物，其中所述修饰的低聚核苷酸在5'至3'取向上具有以下核苷模式：

[0177] NSNSNMNFNFNFNMNSNS

[0178] 其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，且所有键联都是硫代磷酸酯键联；并且其中，修饰的低聚核苷酸的核碱基序列包含核碱基序列5'-CACUUU-3'，其中每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶；或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的核碱基序列为5'-AGCACUUUG-3'，其中每个胞嘧啶为非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。

[0179] 本文提供结构为ASGSCMAFCFUFUMUSGS的化合物，其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶，且所有键联都是硫代磷酸酯键联；或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。

[0180] 本文提供结构为ASGSCMAFCFUFUMUSGS的化合物，其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶，且所有键联都是硫代磷酸酯键联；或其药学上可接受的盐。

[0181] 本文提供一种名为RG4326的修饰的低聚核苷酸，其中所述修饰的低聚核苷酸的结构为：

[0182] 本文提供修饰的低聚核苷酸RG4326的药学上可接受的盐。因此，在一些实施方案中，修饰的低聚核苷酸具有以下结构：

[0183] 或其药学上可接受的盐。RG4326的非限制性示例性药学上可接受的盐具有以下结构：

[0184]

[0185] 在一些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的药学上可接受的盐包含比每分子的硫代磷酸酯和/或磷酸二酯键联少的阳离子抗衡离子(诸如，Na+)(即，一些硫代磷酸酯和/或磷酸二酯键联被质子化)。在一些实施方案中，RG4326的药学上可接受的盐包含少于8个阳离子抗衡离子(诸如，Na+)/分子RG4326。也就是说，在一些实施方案中，RG4326的药学上可接受的盐可以平均包含1、2、3、4、5、6或7个阳离子抗衡离子/分子RG4326，其余的硫代磷酸酯基团被质子化。

[0186] 本发明的某些用途

[0187] 本文提供用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在细胞中的活性的方法，其包括使细胞与本文提供的化合物接触，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。

[0188] 本文提供用于抑制miR-17家族的一个或多个成员在受试者中的活性的方法，其包括向所述受试者施用本文提供的药物组合物。在某些实施方案中，所述受试者患有与所述miR-17家族的一个或多个成员相关的疾病。

[0189] 本文提供治疗多囊肾病(PKD)的方法，其包括向有需要的受试者施用本文提供的化合物，其包含与所述miR-17种子序列互补的核碱基序列。在某些实施方案中，所述受试者患有多囊肾病。在某些实施方案中，所述多囊肾病选自常染色体显性多囊肾病(ADPKD)、常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)和肾痨(NPHP)。在某些实施方案中，所述多囊肾病选自常染色体显性多囊肾病(ADPKD)和常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。

[0190] 在某些实施方案中，所述受试者患有以多种非肾脏指标为特征，并且还以多囊肾病为特征的病症。此类病症包括例如朱伯特综合征(Joubert syndrome)和相关病症(JSRD)、梅克尔综合征(Meckel syndrome，MKS)或巴德-毕德综合征(Bardet-Biedl syndrome，BBS)。因此，本文提供用于治疗多囊肾病(PKD)的方法，其包括向受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列，其中所述受试者患有朱伯特综合征和相关病症(JSRD)、梅克尔综合征(MKS)或巴德-毕德综合征(BBS)。本文提供用于治疗多囊肾病(PKD)的方法，其包括施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列，其中所述受试者疑似患有朱伯特综合征和相关病症(JSRD)、梅克尔综合征(MKS)或巴德-毕德综合征(BBS)。

[0191] 在某些实施方案中，多囊肾病是常染色体显性多囊肾病(ADPKD)。ADPKD是由PKD1或PKD2基因中的突变引起的。ADPKD是一种进展性疾病，其中囊肿形成和肾脏扩大导致肾功能不全并且50％的患者在60岁时最终导致终末期肾病。ADPKD患者可能需要终身透析和/或肾移植。ADPKD是肾衰竭的最常见的遗传原因。囊肿的过度增殖是ADPKD的标志性病理特征。在PKD的管理中，治疗的主要目标是维持肾功能，且预防终末期肾病(ESRD)的发作，从而改善PKD受试者的预期寿命。ADPKD患者的总肾体积通常稳定地增加，与肾功能下降相关地增加。本文提供用于治疗ADPKD的方法，其包括向患有或疑似患有ADPKD的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。

[0192] 在某些实施方案中，多囊肾病是常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)。ARPKD是由PKHD1基因中的突变引起的，并且是儿童慢性肾病的原因。典型的ARPKD肾脏表型是肾脏肿大；然而，ARPKD对其他器官，尤其是肝脏具有显著影响。患有ARPKD的患者进展为终末期肾病，并且需要在15岁时就进行肾移植。本文提供用于治疗ARPKD的方法，其包括向患有或疑似患有ARPKD的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。

[0193] 在某些实施方案中，多囊肾病是肾痨(NPHP)。肾痨是一种常染色体隐性囊性肾病，其是儿童ESRD的常见原因。NPHP的特征在于肾脏体积正常或缩小，囊肿集中在皮质髓质连接处以及肾小管间质纤维化。已经在NPHP患者中鉴定出几种NPHP基因之一如NPHP1中的突变。本文提供用于治疗NPHP的方法，其包括向患有或疑似患有NPHP的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。

[0194] 在某些实施方案中，患有多囊肾病的受试者患有朱伯特综合征和相关病症(JSRD)。JSRD包括广泛标志性特征，包括脑、视网膜和骨骼异常。除了JSRD的标志性特征之外，患有JSRD的某些受试者患有多囊肾病。因此，本文提供用于治疗患有JSRD的受试者中的多囊肾病的方法，其包括向患有JSRD的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。在某些实施方案中，受试者疑似患有JSRD。

[0195] 在某些实施方案中，患有多囊肾病的受试者患有梅克尔综合征(MKS)。MKS是一种在包括中枢神经系统、骨骼系统、肝脏、肾脏和心脏的许多身体部位具有严重体征和症状的病症。MKS的共同特征是肾脏中存在许多充满液体的囊肿，以及肾脏肿大。因此，本文提供用于治疗MKS的方法，其包括向患有MKS的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。在某些实施方案中，受试者疑似患有MKS。

[0196] 在某些实施方案中，患有多囊肾病的受试者患有巴德-毕德综合征(BBS)。BBS是影响包括眼睛、心脏、肾脏、肝脏和消化系统的许多身体部位的病症。BBS的标志性特征是存在肾囊肿。因此，本文提供用于治疗患有BBS的受试者中的多囊肾病的方法，其包括向患有BBS的受试者施用本文提供的化合物，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。在某些实施方案中，受试者疑似患有BBS。

[0197] 在某些实施方案中，在施用包含修饰的低聚核苷酸的化合物之前，受试者已被诊断为患有PKD。PKD的诊断可以通过评价参数来实现，所述参数包括但不限于受试者的家族史、临床特征(包括但不限于高血压、白蛋白尿、血尿和GFR受损)、肾成像研究(包括但不限于MRI、超声和CT扫描)和/或组织学分析。

[0198] 在某些实施方案中，PKD的诊断包括筛选一种或多种PKD1或PKD2基因中的突变。在某些实施方案中，ARPKD的诊断包括筛选PKHP1基因中的突变。在某些实施方案中，NPHP的诊断包括筛选NPHP1、NPHP2、NPHP3、NPHP4、NPHP5、NPHP6、NPHP7、NPHP8或NPHP9基因中的一种或多种中的一种或多种突变。在某些实施方案中，JSRD的诊断包括筛选NPHP1、NPHP6、AHI1、MKS3或RPGRIP1L基因中的突变。在某些实施方案中，MKS的诊断包括筛选NPHP6、MKS3、RPGRIP1L、NPHP3、CC2D2A、BBS2、BBS4、BBS6或MKS1基因中的突变。在某些实施方案中，BBS的诊断包括筛选BBS2、BBS4、BBS6、MKS1、BBS1、BBS3、BBS5、BBS7、BBS7、BBS8、BBS9、BBS10、BBS11或BBS12基因中的突变。

[0199] 在某些实施方案中，受试者具有增加的总肾体积。在某些实施方案中，总肾体积是身高调整的总肾体积(HtTKV)。在某些实施方案中，受试者患有高血压。在某些实施方案中，受试者患有肾功能受损。在某些实施方案中，受试者需要改善的肾功能。在某些实施方案中，所述受试者被鉴定为患有肾功能受损。

[0200] 在某些实施方案中，一种或多种miR-17家族成员的水平在患有PKD的受试者的肾脏中增加。在某些实施方案中，在施用之前，确定受试者在肾脏中具有增加水平的一种或多种miR-17家族成员。可以从肾活组织检查材料测量miR-17家族成员的水平。在某些实施方案中，在施用之前，确定受试者在受试者的尿液或血液中具有增加水平的一种或多种miR-17家族成员。

[0201] 在本文提供的任何实施方案中，受试者可以经历某些测试以诊断受试者中的多囊肾病，例如，以确定多囊肾病的原因，评价受试者中多囊肾病的程度，和/或确定受试者对治疗的反应。这类测试可以评估多囊肾病的标志。这些测试中的某些测试，诸如肾小球滤过率和血尿素氮水平，也是肾功能的指标。多囊疾病的标志包括但不限于：测量受试者的总肾体积；测量受试者的高血压；评估受试者的肾痛；测量受试者的纤维化；测量受试者的血尿素氮水平；测量受试者的血清肌酐水平；测量受试者的肌酐清除率；测量受试者的白蛋白尿；测量受试者的白蛋白:肌酐比；测量受试者的肾小球滤过率；测量受试者的血尿；测量受试者尿液中的NGAL蛋白质；和/或测量受试者尿液中的KIM-1蛋白质。除非本文另外指示，否则血尿素氮水平、血清肌酐水平、肌酐清除率、白蛋白尿、白蛋白肌酐比、肾小球滤过率和血尿是指受试者的血液(诸如全血或血清)中的测量值。

[0202] 多囊肾病的标志通过实验室测试确定。个别标志的参考范围可能因实验室而变。变化可能是由于例如所用特定测定的差异。因此，群体内标志的正常分布的上限和下限，也分别称为正常上限(ULN)和正常下限(LLN)，可以因实验室而变。对于任何特定的标志，健康专业人员可以确定正常分布之外的哪些水平是临床相关的和/或指示疾病。例如，健康专业人员可以确定肾小球滤过率，其可以指示患有多囊肾病的受试者的肾功能下降速率。

[0203] 在某些实施方案中，本文提供的化合物的施用导致一种或多种临床有益的结果。在某些实施方案中，施用改善受试者的肾功能。在某些实施方案中，施用减缓受试者中肾功能的下降速率。在某些实施方案中，施用降低受试者的总肾体积。在某些实施方案中，施用减缓受试者中总肾体积的增加速率。在某些实施方案中，施用降低身高调整的总肾体积(HtTKV)。在某些实施方案中，施用减缓HtTKV的增加速率。

[0204] 在某些实施方案中，施用抑制受试者中的囊肿生长。在某些实施方案中，施用减缓受试者中囊肿生长的增加速率。在一些实施方案中，囊肿存在于受试者的肾脏中。在一些实施方案中，囊肿存在于肾脏以外的器官如肝脏中。

[0205] 在某些实施方案中，施用缓解受试者的肾痛。在某些实施方案中，施用减缓受试者中肾痛的增加。在某些实施方案中，施用延迟受试者中肾痛的发作。

[0206] 在某些实施方案中，施用降低受试者的高血压。在某些实施方案中，施用减缓受试者中高血压的恶化。在某些实施方案中，施用延迟受试者中高血压的发作。

[0207] 在某些实施方案中，施用降低受试者肾脏中的纤维化。在某些实施方案中，施用减缓受试者肾脏中纤维化的恶化。

[0208] 在某些实施方案中，施用延迟受试者中终末期肾病的发作。在某些实施方案中，施用延迟受试者进行透析的时间。在某些实施方案中，施用延迟受试者进行肾移植的时间。在某些实施方案中，施用改善受试者的预期寿命。

[0209] 在某些实施方案中，施用降低受试者的白蛋白尿。在某些实施方案中，施用减缓受试者中白蛋白尿的恶化。在某些实施方案中，施用延迟受试者中白蛋白尿的发作。在某些实施方案中，施用降低受试者的血尿。在某些实施方案中，施用减缓受试者中血尿的恶化。在某些实施方案中，施用延迟受试者中血尿的发作。在某些实施方案中，施用降低受试者的血尿素氮水平。在某些实施方案中，施用降低受试者的血清肌酐水平。在某些实施方案中，施用改善受试者的肌酐清除率。在某些实施方案中，施用降低受试者的白蛋白:肌酐比。

[0210] 在某些实施方案中，施用改善受试者的肾小球滤过率。在某些实施方案中，施用减缓受试者中肾小球滤过率的下降速率。在某些实施方案中，肾小球滤过率是估计的肾小球滤过率(eGFR)。在某些实施方案中，肾小球滤过率是测量的肾小球滤过率(mGFR)。

[0211] 在某些实施方案中，施用降低受试者尿液中的嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)蛋白质。在某些实施方案中，施用降低受试者尿液中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白质。

[0212] 在本文提供的任何实施方案中，可以对受试者进行某些测试以评价受试者中的疾病程度。这些测试包括但不限于测量受试者的总肾脏体积；测量受试者的高血压；测量受试者的肾痛；测量受试者肾脏中的纤维化；测量受试者的血尿素氮水平；测量受试者的血清肌酐水平；测量受试者血液中的肌酐清除率；测量受试者的白蛋白尿；测量受试者的白蛋白:肌酐比；测量受试者的肾小球滤过率，其中肾小球滤过率是估计的或测量的；测量受试者尿液中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)蛋白质；和/或测量受试者尿液中的肾损伤分子-1(KIM-1)蛋白质。

[0213] 在某些实施方案中，患有多囊肾病的受试者的生活质量降低。例如，患有多囊肾病的受试者可能经历肾痛，这可能降低受试者的生活质量。在某些实施方案中，施用改善受试者的生活质量。

[0214] 在本文提供的任何实施方案中，受试者是人受试者。在某些实施方案中，所述人受试者是成人。在某些实施方案中，成人至少21岁。在某些实施方案中，人受试者是儿科受试者，即受试者小于21岁。儿科群体可以由监管机构确定。在某些实施方案中，人受试者是青少年。在某些实施方案中，青少年至少12岁且小于21岁。在某些实施方案中，人受试者是儿童。在某些实施方案中，儿童至少两岁且小于12岁。在某些实施方案中，人受试者是婴儿。在某些实施方案中，婴儿至少一个月大且小于两岁。在某些实施方案中，受试者是新生儿。在某些实施方案中，新生儿小于一个月。

[0215] 本文所述的任何化合物可以用于疗法中。本文提供的任何化合物可以用于治疗多囊肾病。在某些实施方案中，多囊肾病是常染色体显性多囊肾病。在某些实施方案中，多囊肾病是常染色体隐性多囊肾病。在某些实施方案中，多囊肾病是肾痨。在某些实施方案中，所述受试者患有朱伯特综合征和相关病症(JSRD)、梅克尔综合征(MKS)或巴德-毕德综合征(BBS)。

[0216] 本文所述的任何修饰的低聚核苷酸可以用于疗法中。本文提供的任何修饰的低聚核苷酸可以用于治疗多囊肾病。

[0217] 本文提供的任何化合物可以用于制备药物。本文提供的任何化合物可以用于制备用于治疗多囊肾病的药物。

[0218] 本文提供的任何修饰的低聚核苷酸可以用于制备药物。本文提供的任何修饰的低聚核苷酸可以用于制备用于治疗多囊肾病的药物。

[0219] 本文提供的任何药物组合物可以用于治疗多囊肾病。

[0220] 某些额外疗法

[0221] 多囊肾病或本文列出的任何病状的治疗可以包含一种以上的疗法。因此，在某些实施方案中，本文提供用于治疗患有或疑似患有多囊肾病的受试者的方法，其包括除了施用本文提供的化合物之外施用至少一种疗法，所述化合物包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列。

[0222] 在某些实施方案中，所述至少一种额外的疗法包含药剂。

[0223] 在某些实施方案中，药剂是抗高血压剂。抗高血压剂用于控制受试者的血压。

[0224] 在某些实施方案中，药剂是加压素受体2拮抗剂。在某些实施方案中，加压素受体2拮抗剂是托伐普坦(tolvaptan)。

[0225] 在某些实施方案中，药剂包括血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在某些实施方案中，血管紧张素II受体阻滞剂是坎地沙坦(candesartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、氯沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或依普罗沙坦(eprosartan)。

[0226] 在某些实施方案中，药剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂。在某些实施方案中，ACE抑制剂是卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、贝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)或雷米普利(ramipril)。

[0227] 在某些实施方案中，药剂是利尿剂。在某些实施方案中，药剂是钙通道阻滞剂。

[0228] 在某些实施方案中，药剂是激酶抑制剂。在某些实施方案中，激酶抑制剂是博舒替尼(bosutinib)或KD019。

[0229] 在某些实施方案中，药剂是肾上腺素能受体拮抗剂。

[0230] 在某些实施方案中，药剂是醛固酮受体拮抗剂。在某些实施方案中，醛固酮受体拮抗剂是螺内酯。在某些实施方案中，螺内酯以每天10mg至35mg的剂量施用。在某些实施方案中，螺内酯以每天25mg的剂量施用。

[0231] 在某些实施方案中，药剂是雷帕霉素(rapamycin)(mTOR)抑制剂的哺乳动物靶标。在某些实施方案中，mTOR抑制剂是依维莫司(everolimus)、雷帕霉素或西罗莫司(sirolimus)。

[0232] 在某些实施方案中，药剂是激素类似物。在某些实施方案中，激素类似物是生长激素抑制素或促肾上腺皮质激素。

[0233] 在某些实施方案中，药剂是抗纤维化剂。在某些实施方案中，抗纤维化剂是与miR-21互补的修饰的低聚核苷酸。

[0234] 在某些实施方案中，额外的疗法是透析。在某些实施方案中，额外的疗法是肾移植。

[0235] 在某些实施方案中，药剂包括抗炎剂。在某些实施方案中，抗炎剂是甾体抗炎剂。在某些实施方案中，类固醇抗炎剂是皮质类固醇。在某些实施方案中，皮质类固醇是泼尼松(prednisone)。在某些实施方案中，抗炎剂是非甾体抗炎药。在某些实施方案中，非甾体抗炎剂是布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。

[0236] 在某些实施方案中，药剂是阻滞对纤维化信号的一种或多种反应的药剂。

[0237] 在某些实施方案中，额外的疗法可以是增强身体的免疫系统的药剂，包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补充剂(例如，抗氧化剂，包括维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10以及松果菊)，以及疫苗，例如包含组合多聚体形式的抗原和佐剂的疫苗制剂的免疫刺激性复合物(ISCOM)。

[0238] 在某些实施方案中，选择额外的疗法来治疗或减轻本发明的一种或多种药物组合物的副作用。此类副作用包括但不限于：注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常以及肌病。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。

[0239] 某些微RNA核碱基序列

[0240] miR-17家族包括miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a和miR-106b。miR-17家族的每个成员具有包含核碱基序列5'-AAAGUG-3'的核碱基序列或miR-17种子序列，其是SEQ ID NO:1的2至7位的核碱基序列。另外，miR-17家族的每个成员在种子区外共享一些核碱基序列同一性。因此，除了miR-17之外，包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列的修饰的低聚核苷酸可以靶向miR-17家族的其他微RNA。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的两个或更多个微RNA。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的三种或更多种微RNA。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的四种或更多种微RNA。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的五种或更多种微RNA。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的六种微RNA。例如，具有核碱基序列5'-AGCACUUUG-3'的修饰的低聚核苷酸靶向miR-17家族的所有成员。

[0241] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACUUU-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-GCACUUUG-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-AGCACUUU-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的核碱基序列是5'-AGCACUUUG-3'。

[0242] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACTTT-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACUTT-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACUUT-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACTUT-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACUTT-3'。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含核碱基序列5'-CACTTU-3'。

[0243] 在某些实施方案中，每个胞嘧啶独立地选自非甲基化的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，至少一种胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶。在某些实施方案中，至少一种胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。

[0244] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的连接的核苷的数量小于其靶微RNA的长度。具有多个连接的核苷的修饰的低聚核苷酸被认为是具有与靶微RNA序列的区完全互补(也称为100％互补)的核碱基序列的修饰的低聚核苷酸，所述修饰的低聚核苷酸的长度小于靶微RNA的长度，其中修饰的低聚核苷酸的每个核碱基与靶微RNA的相应位置处的核碱基互补。例如，由9个连接的核苷组成的修饰的低聚核苷酸与miR-17完全互补，其中每个核碱基与miR-17的相应位置互补。

[0245] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列相对于靶微RNA的核碱基序列具有一个错配。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列相对于靶微RNA的核碱基序列具有两个错配。在某些此类实施方案中，修饰的低聚核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列相对于靶微RNA的核碱基序列具有不超过两个错配。在某些此类实施方案中，错配的核碱基是连续的。在某些此类实施方案中，错配的核碱基不是连续的。

[0246] 尽管伴随本文件的序列表将每个核碱基序列鉴定为需要的“RNA”或“DNA”，但实际上，这些序列可以用本文指定的化学修饰的组合进行修饰。本领域技术人员将容易地理解，在序列表中，描述修饰的低聚核苷酸的诸如“RNA”或“DNA”的名称在某种程度上是任意的。例如，本文提供的包含含有2'-O-甲氧基乙基糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的修饰的低聚核苷酸可以描述为序列表中的DNA残基，即使核苷被修饰且不是天然DNA核苷。

[0247] 因此，序列表中提供的核酸序列旨在涵盖含有天然或修饰的RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为另外的实例而非限制，在序列表中具有核碱基序列“ATCGATCG”的修饰的低聚核苷酸涵盖具有此类核碱基序列的任何低聚核苷酸，无论是修饰的还是未修饰的，其包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些以me me及具有其他修饰的碱基如“AT CGAUCG”的低聚核苷酸，其中 C指示5-甲基胞嘧啶。

[0248] 某些修饰

[0249] 在某些实施方案中，本文提供的低聚核苷酸可以包含对核碱基、糖和/或核苷间键联的一处或多处修饰，并且因此是修饰的低聚核苷酸。修饰的核碱基、糖和/或核苷间键联可以由于合乎需要的性质如细胞摄取增强、对其他低聚核苷酸或核酸靶标的亲和力增强以及在核酸酶存在下的稳定性增加而优先于未修饰的形式被选择。

[0250] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含一种或多种修饰的核碱基。

[0251] 在某些实施方案中，修饰的核苷是糖修饰的核苷。在某些此类实施方案中，糖修饰的核苷还可以包含天然或修饰的杂环碱基部分和/或可以通过天然或修饰的核苷间键联连接到另一个核苷和/或可以包括独立于糖修饰的另外修饰。在某些实施方案中，糖修饰的核苷是2'-修饰的核苷，其中糖环在来自天然核糖或2'-脱氧-核糖的2'碳处修饰。

[0252] 在某些实施方案中，2'-修饰的核苷具有双环糖部分。在某些此类实施方案中，所述双环糖部分是α构型的D糖。在某些此类实施方案中，所述双环糖部分是β构型的D糖。在某些此类实施方案中，所述双环糖部分是α构型的L糖。在某些此类实施方案中，所述双环糖部分是β构型的L糖。

[0253] 包含此类双环糖部分的核苷被称为双环核苷或BNA。在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于如下所绘的(A)α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(C)亚乙氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA；(D)氨氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA；(E)氧氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亚甲氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(也称为约束的乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA；(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH(CH2-OMe)-O-2')BNA；和(K)丙烯碳环(4'-(CH2)3-2')BNA。

[0254]

[0255] 其中Bx是核碱基部分，并且R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。

[0256] 在某些实施方案中，2'-修饰的核苷包含选自F、OCF3、O-CH3(也称为“2'-OMe”)、OCH2CH2OCH3(也称为“2'-O-甲氧基乙基”或“2'-MOE”)、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-ON(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3的2'-取代基团。

[0257] 在某些实施方案中，2'-修饰的核苷包含选自F、O-CH3和OCH2CH2OCH3的2'-取代基团。

[0258] 在某些实施方案中，糖修饰的核苷是4'-硫代修饰的核苷。在某些实施方案中，糖修饰的核苷是4'-硫代-2'-修饰的核苷。4'-硫代修饰的核苷具有β-D-核糖核苷，其中4'-O被4'-S置换。4'-硫代-2'-修饰的核苷是其中2'-OH被2'-取代基团置换的4'-硫代修饰的核苷。合适的2'-取代基团包括2'-OCH3、2'-OCH2CH2OCH3和2'-F。

[0259] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含一处或多处核苷间修饰。在某些此类实施方案中，修饰的低聚核苷酸的每个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联包含磷原子。

[0260] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸的每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

[0261] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施方案中，修饰的核碱基选自5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。

[0262] 在某些实施方案中，修饰的核碱基包含多环杂环。在某些实施方案中，修饰的核碱基包含三环杂环。在某些实施方案中，修饰的核碱基包含吩噁嗪衍生物。在某些实施方案中，可以进一步修饰吩噁嗪以形成本领域已知的G-钳夹的核碱基。

[0263] 在某些实施方案中，修饰的低聚核苷酸被缀合至一个或多个增强所产生的反义低聚核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分。在某些此类实施方案中，所述部分是胆固醇部分。在某些实施方案中，所述部分是脂质部分。用于缀合的额外部分包括碳水化合物、肽、抗体或抗体片段、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。在某些实施方案中，所述碳水化合物部分是N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNac)。在某些实施方案中，缀合基团直接连接至低聚核苷酸。在某些实施方案中，缀合基团通过选自以下的连接部分而连接至修饰的低聚核苷酸：氨基、叠氮基、羟基、羧酸、巯基、不饱和部分(例如，双或三键)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基以及取代的或未取代的C2-C10炔基。在某些此类实施方案中，取代基团选自羟基、氨基、烷氧基、叠氮基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

[0264] 在某些此类实施方案中，所述化合物包含具有一个或多个稳定化基团的修饰的低聚核苷酸，所述一个或多个稳定化基团连接至修饰的低聚核苷酸的一个或两个末端以增强诸如核酸酶稳定性的性质。稳定化基团中包括帽结构。这些末端修饰保护修饰的低聚核苷酸免受核酸外切酶降解，并且可以帮助在细胞内递送和/或定位。所述帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或者可以存在于两个末端上。帽结构包括例如反向脱氧无碱基帽。

[0265] 某些药物组合物

[0266] 本文提供药物组合物，其包含本文提供的化合物或修饰的低聚核苷酸以及药学上可接受的稀释剂。在某些实施方案中，所述药学上可接受的稀释剂是水溶液。在某些实施方案中，所述水溶液是盐水溶液。如本文所用，药学上可接受的稀释剂应理解为无菌稀释剂。合适的施用途径包括但不限于静脉内和皮下施用。

[0267] 在某些实施方案中，药物组合物以剂量单位的形式施用。例如，在某些实施方案中，剂量单位是片剂、胶囊或推注注射剂的形式。

[0268] 在某些实施方案中，药剂是修饰的低聚核苷酸，其在合适的稀释剂中制备，在制备期间用酸或碱调整至pH 7.0-9.0，然后在无菌条件下冻干。冻干的修饰的低聚核苷酸随后用合适的稀释剂如水溶液，诸如水或生理学上相容的缓冲液如盐水溶液、汉克斯溶液(Hanks's solution)或林格氏溶液(Ringer's solution)重构。重构产物以皮下注射或静脉内输注形式施用。冻干的药物产品可以包装在2mL I型(经硫酸铵处理的)透明玻璃小瓶中，用溴丁基橡胶塞塞住并且用铝顶封件密封。

[0269] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以额外含有通常存在于药物组合物中的其他辅助组分，这些辅助组分具有本领域中确定的使用量。因此，举例来说，所述组合物可以含有额外的相容性药学活性材料，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂。

[0270] 在一些实施方案中，本文提供的药物组合物可以含有可以用于物理配制本发明组合物的各种剂型的额外物质，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂；此类额外的物质还包括但不限于赋形剂，诸如醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。在各种实施方案中，当添加此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的组分的生物活性。可以对制剂进行灭菌并且必要时与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芳族物质等进行混合，所述助剂不与制剂的一种或多种低聚核苷酸发生有害的相互作用。某些注射用药物组合物是油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油，诸如芝麻油；合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；以及脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，此类悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加药剂溶解性以允许制备高浓度溶液的药剂。

[0271] 脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在一种方法中，将核酸引入预形成的脂质体或由阳离子性脂质与中性脂质的混合物制成的脂质复合物中。在另一种方法中，在无中性脂质存在的情况下形成与单阳离子性脂质或聚阳离子性脂质的DNA复合物。在某些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂至特定细胞或组织的分布。在某些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂至脂肪组织的分布。在某些实施方案中，选择脂质部分以增加药剂至肌肉组织的分布。

[0272] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含多胺化合物或与核酸复合的脂质部分。在某些实施方案中，此类制剂包含一种或多种各自单独地具有由式(Z)所定义的结构的化合物或其药学上可接受的盐，

[0273]

[0274] 其中每个Xa和Xb在每次出现时独立地是C1-6亚烷基；n是0、1、2、3、4或5；每个R独立地是H，其中制剂中的至少约80％的式(Z)化合物分子中的至少n+2个R部分不是H；m是1、2、3或4；Y是O、NR2或S；R1是烷基、烯基或炔基；其各自任选地被一个或多个取代基取代；并且R2是H、烷基、烯基或炔基；其各自任选地被一个或多个取代基取代；条件是，如果n＝0，则至少n+3个R部分不是H。此类制剂描述于PCT公布WO/2008/042973中，所述公布为了公开脂质制剂而以引用的方式整体并入本文。某些额外制剂描述于Akinc等，Nature Biotechnology 26,561-569(2008年5月1日)中，所述文献为了公开脂质制剂而以引用的方式整体并入本文。

[0275] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物使用已知的技术制备，所述技术包括但不限于混合、溶解、制粒、制糖丸、粉碎、乳化、封装、包埋或压片工艺。

[0276] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物是固体(例如，粉剂、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施方案中，包含一种或多种低聚核苷酸的固体药物组合物使用本领域中已知的成分制备，所述成分包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。

[0277] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物制备为储库(depot)制剂。某些此类储库制剂典型地比非储库制剂作用更长。在某些实施方案中，此类制剂通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。在某些实施方案中，储库制剂使用合适的聚合材料或疏水性材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物如作为微溶性盐来制备。

[0278] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳液。某些递送系统适用于制备某些药物组合物，所述药物组合物包括包含疏水性化合物的那些。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂，诸如二甲亚砜。

[0279] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含一种或多种设计用来将一种或多种本发明的药剂递送至特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括涂覆有组织特异性抗体的脂质体。

[0280] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含持续释放系统。此类持续释放系统的一个非限制性实例是固体疏水性聚合物的半渗透基质。在某些实施方案中，持续释放系统可以取决于它们的化学性质在数小时、数天、数周或数月的时间内释放药剂。

[0281] 某些注射用药物组合物以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中。

[0282] 在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的修饰的低聚核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、缓解或减轻疾病的症状或延长正在治疗的受试者的存活。

[0283] 在某些实施方案中，将本文提供的一种或多种修饰的低聚核苷酸配制为前药。在某些实施方案中，当体内施用时，前药化学转化为低聚核苷酸的生物学、药学或治疗学上更具活性的形式。在某些实施方案中，前药是有用的，因为它们比相应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可以比相应的活性形式生物利用度更高(例如，通过口服施用)。在某些情况下，与相应的活性形式相比，前药可以具有改善的溶解度。在某些实施方案中，前药比相应的活性形式的水溶性低。在某些情况下，此类前药具有优异的跨越细胞膜传输的能力，其中水溶性不利于迁移性。在某些实施方案中，前药是酯。在某些此类实施方案中，所述酯在施用时被代谢水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物是相应的活性形式。在某些实施方案中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施方案中，所述肽在施用时裂解以形成相应的活性形式。

[0284] 在某些实施方案中，前药通过修饰药物活性化合物来产生，以使得所述活性化合物在体内施用时将再生。所述前药可以设计成改变药物的代谢稳定性或运输特征，掩蔽副作用或毒性，改善药物的香味或改变药物的其他特征或性质。凭借药效学过程和体内药物代谢的知识，本领域的技术人员一旦了解药学活性化合物，即可设计出化合物的前药(参见，例如，Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press,New York，第388-392页)。

[0285] 额外的施用途径包括但不限于口服、直肠、经粘膜、肠、肠内、局部、栓剂、通过吸入、鞘内、心内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、瘤内、肌肉内和髓内施用。在某些实施方案中，施用鞘内药物(pharmaceutical intrathecal)以实现局部暴露而非全身暴露。例如，可以将药物组合物直接注射在所需作用的区域中(例如，到肾脏中)。

[0286] 某些试剂盒

[0287] 本发明还提供试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种包含本文公开的修饰的低聚核苷酸的化合物。在一些实施方案中，所述试剂盒可以用于将化合物施用到受试者。

[0288] 在某些实施方案中，所述试剂盒包含准备施用的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物存在于小瓶内。多个小瓶，例如10个，可以存在于例如分配包装中。在一些实施方案中，制造小瓶以便可用注射器接近。所述试剂盒还可以含有关于使用所述化合物的说明书。

[0289] 在一些实施方案中，所述试剂盒包含存在于预填充注射器中的药物组合物(诸如，单剂量注射器，其具有例如具有针护罩的27号，1/2英寸针头)，而不是在小瓶中。多个预填充的注射器，例如10个，可以存在于例如分配包装中。所述试剂盒还可以含有用于施用包含本文公开的修饰的低聚核苷酸的化合物的说明书。

[0290] 在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文提供的修饰的低聚核苷酸作为冻干的药物产品以及药学上可接受的稀释剂。在准备施用到受试者时，将冻干的药物产品在药学上可接受的稀释剂中重构。

[0291] 在一些实施方案中，除了包含本文公开的修饰的低聚核苷酸的化合物之外，所述试剂盒还可以包含以下一种或多种：注射器、酒精棉签、棉球和/或纱布垫。

[0292] 某些实验模型

[0293] 在某些实施方案中，本发明提供在实验模型中使用和/或测试本发明的修饰的低聚核苷酸的方法。本领域技术人员能够选择和修改用于此类实验模型的方案以评价本发明的药剂。

[0294] 一般来说，修饰的低聚核苷酸首先在培养细胞中测试。合适的细胞类型包括与需要在体内向其递送修饰的低聚核苷酸的细胞类型有关的细胞类型。例如，用于研究本文所述的方法的合适细胞类型包括原代细胞或培养的细胞。

[0295] 在某些实施方案中，在培养的细胞中评估修饰的低聚核苷酸干扰一种或多种miR-17家族成员的活性的程度。在某些实施方案中，可以通过测量预测或验证的微RNA调节的转录物中的一种或多种的水平来评估微RNA活性的抑制。抑制微RNA活性可能导致miR-17家族成员调节的转录物和/或由miR-17家族成员调节的转录物编码的蛋白质增加(即，miR-17家族成员调节的转录物是脱阻抑的)。另外，在某些实施方案中，可以测量某些表型结果。

[0296] 本领域的技术人员可使用若干动物模型来研究人疾病模型中的一种或多种miR-17家族成员。多囊肾病的模型包括但不限于具有Pkd1和/或Pkd2中的突变和/或缺失的模型；和包含其他基因中的突变的模型。包含Pkd1和/或Pkd2中的突变和/或缺失的PKD的非限制性示例性模型包括亚等位基因模型，诸如包含Pkd1中的错义突变的模型和Pkd2的表达降低或不稳定的模型；诱导型条件敲除模型；以及有条件的敲除模型。包含除Pkd1和Pkd2以外的基因中的突变的非限制性示例性PKD模型包括具有Pkhd1、Nek8、Kif3a和/或Nphp3中的突变的模型。PKD模型综述于例如Shibazaki等，Human Mol.Genet.,2008；17(11):1505-1516；
Happe和Peters,Nat Rev Nephrol.,2014；10(10):587-601；以及Patel等，PNAS,2013；110(26):10765-10770中。

[0297] 某些定量分析

[0298] 在某些实施方案中，在体外或体内细胞或组织中定量微RNA水平。在某些实施方案中，通过微阵列分析来测量微RNA水平的变化。在某些实施方案中，微RNA水平的变化通过若干可商购的PCR测定中的一种如 微RNA测定(Applied Biosystems)来测量。

[0299] 可以通过mRNA的微阵列谱分析来评估用抗miR或微RNA模拟物对微RNA活性的调节。针对微RNA种子序列搜索通过抗miR或微RNA模拟物调节(增加或减少)的mRNA的序列，以比较作为微RNA的靶标的mRNA的调节与不作为微RNA的靶标的mRNA的调节。以此方式，可以评价抗miR与其靶微RNA或微RNA模拟物与其靶标的相互作用。在抗miR的情况下，筛选表达水平增加的mRNA的mRNA序列，所述mRNA序列包含与抗-miR互补的微RNA的种子匹配。

[0300] 用抗miR化合物调节微RNA活性可以通过测量信使RNA本身的水平或从其转录的蛋白质的水平通过测量微RNA的信使RNA靶标的水平来评估。微RNA的反义抑制通常导致微RNA的信使RNA和/或信使RNA靶标的蛋白质的水平增加，即，抗miR治疗导致一种或多种靶标信使RNA的脱阻抑。

[0301] 实施例

[0302] 提出以下实施例以便更全面地说明本发明的一些实施方案。然而，所述实施例决不应当解释为限制本发明的广泛范围。本领域的普通技术人员将易于在不背离本发明的精神的情况下，采用本发现的基本原理来设计各种化合物。

[0303] 实施例1：miR-17在PKD中的作用

[0304] 微RNA的miR-17～92簇的miR-17家族成员在小鼠PKD模型中上调。小鼠PKD模型中miR-17～92簇的遗传缺失降低肾囊肿生长，改善肾功能并延长存活(Patel等，PNAS,2013；110(26):10765-10770)。miR-17～92簇含有6种不同的微RNA，每种微RNA具有不同的序列：
miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19-b-1和miR-92a-1。

[0305] miR-17～92簇包括两种微RNA，miR-17和miR-20a，它们是微RNA的miR-17家族的成员。该家族的每个成员共享种子序列同一性，以及种子区外的不同程度的序列同一性。miR-17家族的其他成员是miR-20b、miR-93、miR-106a和miR-106b。miR-20b和miR-106a位于人X染色体上的miR-106a～363簇内，并且miR-93和miR-106b位于人染色体7上的miR-106b～25簇内。miR-17家族成员的序列示于表1中。

[0306] 表1：微RNA的miR-17家族

[0307]

[0308] 使用研究工具抗miR-17化合物的先前研究在两种不同的PKD模型：Pkd2-KO模型(也称为Pkhd1/cre；Pkd2F/F模型)和Pcy模型中鉴定miR-17在PKD中的作用。在小鼠PKD模型中测试与miR-17互补的研究工具修饰的低聚核苷酸。抗miR-17化合物是完全硫代磷酸化的低聚核苷酸，其长度为19个连接的核苷(5'-CTGCACTGTAAGCACTTTG-3'；SEQ ID NO:7)，具有DNA、2'-MOE和S-cEt糖部分。尽管该化合物相对于miR-17家族的其他成员具有错配，但在体外测定中的测试揭示其与miR-17家族的所有成员杂交并抑制这些成员。

[0309] Pkd2-KO小鼠自发发展为多囊肾病。用20mg/kg工具抗miR-17化合物或对照低聚核苷酸或用PBS治疗小鼠。结果表明，相对于对照治疗，Pkd2-KO小鼠的抗miR-17治疗使主要治疗终点肾重-体重比降低17％(p＝0.017)。抗miR-17治疗还显著降低Pkd2-KO小鼠中的BUN和肾损伤mRNA生物标志物Kim1和Ngal的表达。最后，抗miR-17治疗导致Pkd2-KO小鼠中血清肌酐水平降低和囊肿指数降低的趋势。用抗miR对照物未观察到这些结果，指示其特异性地归因于miR-17抑制。

[0310] 携带Nphp3中的突变的Pcy小鼠自发地发展为多囊肾病，其疾病进展比在Pkd2-KO小鼠中观察到的慢。用50mg/kg工具抗miR-17化合物或PBS每周一次治疗小鼠，持续总共26周。与仅施用PBS的Pcy小鼠中肾重与体重的平均比率相比，用抗miR-17治疗的Pcy小鼠中肾重与体重的平均比率低19％(p＝0.0003)。与仅施用PBS的Pcy小鼠相比，用抗miR-17治疗的Pcy小鼠显示囊肿指数平均降低28％(p＝0.008)。

[0311] 这些数据表明，在两种不同的PKD实验模型中，miR-17是治疗PKD的有效靶标。

[0312] 实施例2：化合物设计与筛选

[0313] 虽然研究工具化合物在PKD模型中显示出功效，但是在体内研究中观察到所述化合物具有轻微的促炎性。另外，研究工具化合物不足以有效发展为用于治疗PKD的药剂。

[0314] 因此，执行筛选以鉴定一种或多种miR-17家族成员的抑制剂，所述抑制剂足够有效，便于施用，并且对患有PKD的受试者施用是安全的。另一个标准是肾脏-肝脏递送比率足够高，以增强递送至靶器官的抗miR-17化合物的比例。

[0315] 设计出约200种包含与miR-17种子序列互补的核碱基序列的修饰的低聚核苷酸，其具有不同的长度和化学组成。化合物的长度范围为9至20个连接的核苷，并且化合物的数量、类型和化学修饰的位置不同。因为不能简单地基于化合物的核碱基化学结构预测效力和安全性，在一系列的设计消除具有不利性质的化合物的试验中，在体外和体内评价化合物的特征，包括效力、功效、药代动力学行为、粘度、安全性和代谢稳定性。在某些测定中，使用工具抗miR-17化合物作为比较文库化合物的基准。如下文所述，首先在几种体外测定(例如，效力、毒理学、代谢稳定性)中测试近200种化合物中的每一种，以鉴定适合于在更复杂的体内测定(例如，药代动力学概况、功效、毒理学)中进一步测试的较小组的化合物。设计筛选过程以基于来自所有测定的聚集数据鉴定候选药剂，重点在于效力、药代动力学概况(例如，递送至肾脏)和安全性特征。

[0316] 体外和体内效力和功效

[0317] 体外效力使用荧光素酶报道分子测定评价。miR-17的荧光素酶报道质粒，在荧光素酶基因的3'-UTR中具有一前一后的两个完全互补的miR-17结合位点。如果较长长度的化合物的最大抑制作用大于工具抗miR-17化合物的最大抑制，则选择较长长度的化合物。由于较短的化合物如9-聚体在用于较长化合物的相同测定条件下通常不具有最大活性，因此基于相对于适当对照化合物的最大抑制选择较短的化合物。以这种方式，在另外的测试中包括长度和化学组成都不同的化合物。

[0318] 体内效力使用微RNA多核糖体移位测定(miPSA)评价。该测定用于确定化合物在正常小鼠和PKD小鼠中直接与肾脏中的miR-17靶标接合的程度。miPSA依赖于以下原理：活性miRNA在翻译活性的高分子量(HMW)多核糖体中与其mRNA靶标结合，而受抑制的miRNA位于低MW(LMW)多核糖体中。用抗miR治疗引起微RNA从HMW多核糖体移位至LMW多核糖体。因此，miPSA通过互补的抗miR提供微RNA靶标接合的直接测量(Androsavich等，Nucleic Acids Research,2015,44:e13)。

[0319] 评价已通过多种筛选标准的所选化合物在PKD的实验模型如Pkd2-KO小鼠模型和Pcy小鼠模型中的功效。用抗miR-17化合物治疗小鼠，并且评价临床相关终点，包括肾重与体重的比率、血尿素氮水平、血清肌酐水平和肾囊肿指数。

[0320] 药代动力学性质

[0321] 通过在小鼠肝脏裂解物中孵育每种抗miR-17化合物来评价代谢稳定性。24小时后，计算剩余的完整化合物的百分比。孵育24小时后不稳定的化合物在体内可能不稳定。

[0322] 在野生型C57BL6小鼠和JCK小鼠(PKD的实验模型)中评估所选化合物的药代动力学性质和组织分布。将化合物以0.3mg/kg、3mg/kg或30mg/kg的剂量施用到野生型小鼠，或以3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg的剂量施用到JCK小鼠。七天后，处死小鼠。收集肾脏和肝脏组织。测量肝脏和肾脏中抗miR-17化合物的浓度。优选相对于肝脏而言在肾脏中累积至更高水平的化合物(即，具有更高的肾脏-肝脏比率)。

[0323] 在C57BL6小鼠中获得已通过多种筛选标准的所选化合物的完整药代动力学概况。在一项研究中，对小鼠以30mg/kg单次皮下注射抗miR-17化合物。在另一项研究中，在两个月的时间内对小鼠以39mg/kg三次皮下注射抗miR-17化合物。在每项研究中，在注射后1小时、4小时、8小时、1天、4天、7天、14天、28天和56天收集肝脏和肾脏样品。

[0324] 毒理学

[0325] 在体外测定中，使用生物化学荧光结合测定(FBA)和肝脏或肾脏切片测定评估毒性的可能性。通过将荧光染料与每种化合物一起孵育并立即测量荧光来执行FBA。高荧光化合物具有在体内产生毒性的可能性。通过孵育来自从大鼠中分离的核心肝脏样品的一片组织来执行肝脏或肾脏切片测定。孵育24小时后，从组织切片中提取RNA，并且测量18种促炎基因的表达水平。促炎基因表达的诱导指示体内促炎作用的可能性。

[0326] 通过对正常小鼠(Sv129小鼠)单次皮下注射300mg/kg抗miR-17化合物执行额外的体内毒理学评估。四天后，处死小鼠，收集血液用于血清化学分析，称重肝脏和脾脏，并且从肾脏和肝脏组织中分离RNA。测量促炎基因、具有三角形四肽重复序列(IFIT)的干扰素诱导的蛋白质的表达水平。由于IFIT表达中的诱导可能指示毒性，因此优选不诱导IFIT表达的化合物。

[0327] 在整个筛选过程中，某些抗miR-17化合物在多种测定中表现良好。虽然在每个测定中没有一种化合物是最佳表现者，但在多个筛选阶段后，某些化合物表现出特别有利的特征，诸如高效力和相对高的肾脏-肝脏比率。从在体外测定中测试的近200种化合物中，约20种符合体内进一步测试的标准。这20种化合物最终被缩减为5种化合物，并且最后缩减成一种化合物RG4326，其具有最佳的整体概况并且被选作候选药剂。在鉴定该化合物后，进行额外研究以评价效力、药代动力学概况和功效。

[0328] RG4326具有以下序列和化学修饰模式ASGSCMAFCFUFUMUSGS，其中后面有下标“M”的核苷是2'-O-甲基核苷，后面有下标“F”的核苷是2'-氟核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，每个胞嘧啶是非甲基化的胞嘧啶，且所有键联都是硫代磷酸酯键联。如以下实施例中所示，该化合物在体内表现出miR-17的强靶向接合、在小鼠PKD模型中的功效以及有利于向肾脏分布的药代动力学概况。另外，RG4326的粘度在约150mg/mL的浓度(在20℃的水中)测定为6cP，因此溶液中的RG4326适合通过皮下注射施用。

[0329] 实施例3：额外的短抗miR-17化合物

[0330] 在所选测定中测试额外的9核苷酸的化合物(RG4047)以与RG4326比较活性、安全性和药代动力学概况，在RG4047中，每个核苷是S-cEt核苷。

[0331] 使用的一种测定是荧光素酶测定。如上所述，短(例如，9个核苷酸)抗miR-17化合物虽然在体内研究中可能具有优势，但在体外转染测定中未必表现良好。因此，荧光素酶测定转染条件针对短抗miR-17化合物进行优化，从而可以测量化合物的抑制活性。

[0332] RG5124用作对照化合物。RG5124的长度为9个连接的核苷，并且RG5124具有与RG4326相同的糖修饰模式，但具有不与miR-17互补的核碱基序列。

[0333] miR-17的荧光素酶报道质粒在荧光素酶基因的3'-UTR中含有完全互补的miR-17结合位点。用微RNA模拟物及其同源荧光素酶报道基因转染HeLa细胞，然后用0.001nM、3nM、10nM、30nM、100nM和300nM剂量的抗miR-17转染。在24小时转染期结束时，测量荧光素酶活性。如表2-1所示，RG4047虽然不如RG4326有效，但其以剂量依赖性方式抑制miR-17活性。SD指示标准偏差。

[0334] 表2-1：荧光素酶报道基因测定

[0335]

[0336] 评价RG4047的体内效力、安全性和向肾脏和肝脏的分布。与较大的文库筛选一样，体外效力不能预测体内行为。RG4047在肾脏和肝脏中均产生轻微的促炎信号，与RG4326相比，在野生型小鼠和PKD小鼠体内是效力较低的miR-17抑制剂，并且具有低得多的肾脏-肝脏比率(见表2-2)。这些研究揭示RG4047的活性和性质相对于RG4326没有改善。

[0337] 为了进一步探究化学修饰的位置、类型和数量对9-聚体化合物的活性和肾脏-肝脏比率的影响，在野生型小鼠和JCK小鼠中评价额外的抗miR-17化合物。JCK模型是慢性进展性肾囊性疾病的小鼠模型，所述肾囊性疾病与引起9型人类肾痨的相同基因相关。该小鼠的肾囊肿在肾单位的多个区域发育。

[0338] miPSA用于评估在野生型小鼠和JCK小鼠中通过位移分数测量的每种化合物的效力。通过使用液-液提取(LLE)和/或固相提取(SPE)提取化合物，然后使用与飞行时间质谱联用的离子配对反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC-TOF)分析化合物的特性和浓度来测量抗miR-17化合物的组织积累。

[0339] 这些额外化合物以及RG4326和RG4047的结果示于表2-2中。

[0340] 对于miPSA分析，对野生型小鼠施用3mg/kg的单剂量，对于组织积累分析，对野生型小鼠施用30mg/kg的单剂量。对于miPSA和组织积累分析，对JCK小鼠施用30mg/kg的单剂量。在施用抗miR-17化合物后7天收集肾组织。如表2-2所示，修饰的核苷的类型和位置的变化对抗miR-17化合物的miR-17抑制活性和/或肾脏-肝脏比率表现出显著影响。例如，虽然RG4324表现出如通过miPSA所测量的效力，但肾脏:肝脏比低于对于其他化合物所观察到的效力。对于主要作用部位是肾脏的疾病，较高的肾脏-肝脏比率通常是优选的。相反，RG4327表现出高肾脏:肝脏比，但在PKD小鼠中的效力低。如上所述，RG4326对于PKD治疗表现出最适合的效力和药代动力学概况。

[0341] 表2-2：抗miR-17化合物活性和组织积累的比较

[0342]

[0343] 实施例4：RG4326在额外的体外测定中的活性

[0344] 进行额外的体外测定以进一步探究RG4326的效力。荧光素酶报道基因测定用于测试RG4326抑制miR-17家族成员miR-17、miR-20a、miR-93和miR-106b的能力。构建miR-20a、miR-93和miR-106b各自的荧光素酶报道质粒，在荧光素酶基因的3'-UTR中具有完全互补的微RNA结合位点。用微RNA模拟物及其同源荧光素酶报道基因转染HeLa细胞，然后用100nm的剂量的抗miR-17转染。如表3所示，miR-17、miR-20a、miR-93和miR-106b各自被RG4326抑制，表明抗miR-17化合物抑制miR-17家族的多个成员。由于RG4326与未测试的其他miR-17家族成员miR-20b和miR-106b 100％互补，所以预计也会抑制这些微RNA。表3中的数据也示于图1A中。

[0345] 表3：在体外抑制miR-17家族

[0346]

[0347] 为了测试RG4326抑制内源靶标的miR-17调节的能力，在来自正常和PKD小鼠肾脏的几种肾细胞类型中体外评估miR-17靶基因脱阻抑。用0.3nM、1.2nM、4.7nM、18.8nM、75nM和300nM的RG4326或对照低聚核苷酸RG5124处理小鼠肾集合管细胞(IMCD3)。额外的对照组包括未处理的细胞和模拟转染的细胞(仅用转染试剂处理的细胞)。在24小时转染期后，收集细胞并提取RNA。测量miR-17靶向的18个基因的mRNA水平，并且取平均值以提供药效学标志分数(PD标志分数)，其表示为相对于模拟转染的Log2倍数变化(Log2FC)。如表4所示，RG4326，但不是对照处理，以剂量依赖性方式脱阻抑miR-17靶标。数据也示于图2B中。

[0348] 表4：在IMCD3细胞中的miR-17PD标志分数

[0349]

[0350] 还在额外的肾细胞类型中评价了RG4326脱阻抑miR-17靶标的能力，所述肾细胞类型来源于正常小鼠和PKD小鼠的肾脏。用30nM的RG4326或对照低聚核苷酸RG5124处理细胞。在24小时转染期后，收集细胞并提取RNA。测量miR-17靶向的18个基因的mRNA水平，并且取平均值以提供药效学标志分数(PD标志分数)，其表示为相对于模拟转染的Log2倍数变化(Log2FC)。如表5中所示，RG4326而非对照低聚核苷酸在几种不同的健康和患病的肾来源的细胞类型中脱阻抑miR-17靶标。“P<0.05”指示如通过单向ANOVA计算的p值小于0.05。“NS”指示无统计学意义的变化。

[0351] 表5：肾细胞类型中miR-17靶标的脱阻抑

[0352]

[0353] 实施例5：RG4326的体内效力

[0354] 微RNA多核糖体移位测定(miPSA)用于鉴定在正常小鼠和PKD小鼠中的肾脏中直接接合miR-17的化合物。miPSA依赖于以下原理：活性miRNA在翻译活性的高分子量(HMW)多核糖体中与其mRNA靶标结合，而受抑制的miRNA位于低MW(LMW)多核糖体中。用抗miR治疗引起微RNA从HMW多核糖体移位至LMW多核糖体。因此，miPSA通过互补的抗miR提供微RNA靶标接合的直接测量(Androsavich等，Nucleic Acids Research，2015，44：e13)。

[0355] 对于该实验，所选的PKD模型是JCK模型，JCK模型是与导致9型人类肾痨的相同基因相关的缓慢进展的肾囊性疾病的小鼠模型。该小鼠的肾囊肿在肾单位的多个区中发育。

[0356] 用单次皮下剂量0.3mg/kg、3mg/kg和30mg/kg的RG4326或工具抗miR-17(实施例1中所述)治疗C57BL6小鼠。用单次皮下剂量3mg/kg、30mg/kg和100mg/kg的RG4326或工具抗miR-17治疗JCK小鼠。将PBS治疗用作额外的对照。

[0357] 在治疗后7天，处死小鼠，并且分离肾组织用于miPSA。表6中显示的计算的位移分数表明RG4326在正常肾脏和PKD肾脏中的强烈靶标接合。用RG4326治疗后的位移分数大于用工具抗miR-17化合物治疗后的位移分数。野生型小鼠和JCK小鼠的数据也分别示于图3A和图3B中。

[0358] 表6：RG4326体内靶标接合

[0359]

[0360] 实施例6：RG4326在PKD实验模型中的体内功效

[0361] 使用两种PKD实验模型来评价功效。Pkd2-KO小鼠自发地发展为多囊肾病，并且用作ADPKD的模型。参见Patel等，PNAS,2013；110(26):10765-10770。携带Nphp3中的突变的Pcy小鼠自发地发展为多囊肾病，其疾病进展比在Pkd2-KO小鼠中观察到的慢。将Pcy模型用作肾痨的模型。参见Happe和Peters，Nat.Rev.Nephrol.,2014；10:587-601。

[0362] Pkd2-KO模型

[0363] 在ADPKD的Pkd2-KO小鼠模型中测试RG4326。该模型也称为PKD2-KO模型。将野生型小鼠用作对照小鼠。将和与miR-17无关的miRNA互补的低聚核苷酸用作特异性的治疗对照(RG5124)。

[0364] 在10天龄、11天龄、12天龄和19天龄的每一天，对性别匹配的同窝小鼠皮下注射剂量为20mg/kg的RG4326(n＝12)，剂量为20mg/kg的RG5124(n＝12)，剂量为20mg/kg的工具抗miR-17(n＝12)，或PBS(n＝12)。在28天龄处死小鼠，并且测量肾重、体重、囊肿指数、血清肌酐水平和血尿素氮(BUN)水平。BUN水平是肾功能的标志。较高的BUN水平与较差的肾功能相关，因此BUN水平的降低是肾损伤和损坏降低以及功能改善的指标。通过具有邓奈特多重校正(Dunnett's multiple correction)的单向ANOVA计算统计学显著性。

[0365] 囊肿指数是相对于总肾区域而言的囊性区域的组织学测量。对于该分析，用冷PBS和4％(重量/体积)多聚甲醛灌注一个肾脏，然后收获。用4％多聚甲醛固定肾脏2小时，然后将其包埋在石蜡中进行切片。将肾脏的矢状切片用苏木精和曙红(H&E)染色。所有图像处理步骤都是自动化的，并且在免费提供且开源的软件中进行：R1脚本，其使用来自图像处理工具的EBImage Bioconductor包2和ImageMagick3套件中的函数。将Aperio SVS格式的肾脏H&E图像转换为TIFF图像，并且保留第一帧用于图像分析。首先，使用图像分割计算总肾截面积。类似地使用图像分割来找到包括肾囊肿在内的所有内部结构。应用滤波器以除去小于三个像素的平均半径的所有对象。囊性指数是与囊肿相关的图像面积除以总肾面积。对于每只个体动物的纵向肾切片和横向肾切片分别计算囊性指数。对每个治疗组，比较个体动物的组合囊性指数。

[0366] 结果示于表7中。用RG4326治疗的Pkd2-KO小鼠中肾重与体重的平均比率(KW/BW比)比施用PBS的Pkd2-KO小鼠中的平均KW/BW比低29％(p＝0.0099)。与施用PBS的Pkd2-KO小鼠相比，用RG4326治疗的Pkd2-KO小鼠显示囊肿指数平均降低12％，尽管所述差异在统计学上不显著。用PBS治疗的Pkd2-KO小鼠的平均BUN水平降低13％，尽管所述差异在统计学上不显著。用RG4326治疗的Pkd2-KO小鼠的平均血清肌酐水平比施用PBS的Pkd2-KO小鼠低18％，尽管所述差异在统计学上不显著。用对照低聚核苷酸未观察到这些结果，指示它们特异性地归因于miR-17抑制。虽然先前的研究表明在用工具抗-miR-17化合物治疗后Pkd2-KO中的KW/BW比、BUN和囊肿指数降低，但在该研究中未观察到统计学上显著的变化。用对照低聚核苷酸RG5124治疗没有降低肾重与体重的比率、囊肿指数或BUN。KW/BW比、BUN和囊性指数也分别示于图4A、图4B和图4C中。

[0367] 表7：RG4326在PKD的Pkd2-KO模型中的功效

[0368]

[0369] 这些结果表明，RG4326治疗在Pkd2-KO小鼠中对于与PKD治疗相关的生物学终点相对于体重的肾体积产生积极结果。关于该特定终点，RG4326比工具抗miR-17化合物更有效。RG4326治疗导致Pkd2-KO小鼠中BUN降低和囊肿指数降低的趋势。

[0370] Pcy模型

[0371] 在Pcy小鼠模型中测试RG4326。将野生型小鼠用作对照组。从4周龄开始，每周一次通过皮下注射剂量为25mg/kg的RG4326，剂量为25mg/kg的工具抗miR-17，剂量为25mg/kg的对照低聚核苷酸RG5124，或PBS治疗Pcy小鼠。每个治疗组含有15只雄性小鼠。在55天龄、56天龄和57天龄时施用三种治疗，并且之后在6周龄、7周龄、8周龄、9周龄、10周龄、11周龄、12周龄、13周龄和14周龄时施用治疗。还测试了托伐普坦，其是一种加压素V2受体拮抗剂(VRA)，用于治疗一些患有多囊肾病的患者。在15周龄时处死小鼠。记录体重。提取一个肾脏并称重，并且处理另一个肾脏用于组织学分析以计算囊肿指数，如在Pkhd1/cre；Pkd2F/F中的研究所述。测量血尿素氮(BUN)水平和血清肌酐水平。通过具有邓奈特多重校正的单向ANOVA计算统计学显著性。

[0372] 结果示于表8中。相对于PBS治疗的小鼠中的平均KW/BW比，在用25mg/kg RG4326治疗的组中，所治疗的Pcy小鼠的平均KW/BW比低19％(p＝0.0055)。另外，与施用PBS的Pcy小鼠相比，用RG4326治疗的Pcy小鼠的囊肿指数降低34％(p＝0.016)。相对于PBS治疗的Pcy小鼠中的BUN，用RG4326治疗使Pcy小鼠中的BUN降低16％(p＝0.0070)。用对照低聚核苷酸或工具抗miR-17化合物治疗未导致KW/BW比、BUN或囊肿指数的统计学显著降低。托伐普坦在本研究中无效。表8中的数据也示于图5中。

[0373] 表8：RG4326在Pcy模型中的功效

[0374]

[0375] 这些数据表明，在另一个PKD模型中，用RG4326治疗导致肾重、BUN和囊肿指数降低。

[0376] 实施例7：RG4326药代动力学评估

[0377] 由于其血清蛋白结合能力降低，这是驱动低聚核苷酸在身体内分布的性质，因此预计短低聚核苷酸未必具有使其适合用作药物的药代动力学性质。将RG4326在小鼠、猴或人肝匀浆中孵育。在孵育24小时后确定RG4326和代谢物的特性和浓度。使用液-液提取(LLE)和/或固相提取(SPE)提取RG4326和代谢物，然后使用与飞行时间质谱联用的离子配对反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC-TOF)分析特性和浓度。如表9中所示，尽管其长度短，但发现RG4326具有特别有利的药代动力学概况，在孵育24小时后超过95％的母体化合物RG4326保持完整。

[0378] 表9：在小鼠、猴和人肝脏裂解液中的体外代谢稳定性

[0379]

[0380] 通过向野生型小鼠施用单次皮下30mg/kg剂量的RG4326或工具抗miR-17化合物来评估药代动力学行为。在单次注射后1小时、4小时、8小时、1天、7天、14天、28天和56天，处死小鼠并且如上所述测量肾脏和肝脏组织中抗miR化合物的平均浓度(ug/g)。使用公式ug*h/g计算肾脏和肝脏组织的曲线下面积(AUC)，其中ug是组织中低聚核苷酸的量，h是以小时计的组织收集的时间点，并且g是组织的重量。确定肾脏AUC与肝脏AUC的比率。还处理肾组织以进行miPSA，以确定本研究中每种化合物的靶标接合。使用公式Log2FC*h计算PSA AUC，其中Log2FC是位移值，h是以小时计的组织收集的时间点。使用公式Log2FC+g/ug计算第7天肾脏的效力，其中Log2FC是如由miPSA确定的位移值，g是肾组织的重量，并且ug是第7天肾组织中抗miR的量。

[0381] 如表10中所示，RG4326的肾脏AUC与肝脏AUC的比率比工具抗miR-17化合物的肾脏AUC与肝脏AUC的比率大。引人注目的是，尽管RG4326的肾脏AUC低于工具抗miR-17化合物的肾脏AUC，但如由miPSA确定的效力显著更高。因此，RG4326在肾脏(PKD的主要靶组织)中在较低浓度下表现出更高的效力。

[0382] 表10：RG4326的药代动力学概况

[0383]

[0384] 在野生型(C57B16)小鼠和PKD(JCK)小鼠中进一步表征RG4326的药代动力学行为。每组5只小鼠在连续三天的每一天接受三次10mg/kg皮下注射。在第三次注射和最后一次注射后的第1天、第4天、第7天、第14天和第21天，处死小鼠并且收集血浆、肾脏和肝脏样品。为了测量RG4326，使用液-液提取(LLE)和/或固相提取(SPE)提取RG4326，然后使用与飞行时间质谱联用的离子配对反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC-TOF)分析特性和浓度。

[0385] 数据汇总在表11中。观察到RG4326在血浆和组织中都是稳定的，21天后剩余超过90％的母体化合物。抗miR在注射的数小时内迅速分布到组织，并且主要分布到肾脏。在野生型小鼠的肝脏和肾脏中的半衰期约为8天，在JCK小鼠的肝脏中的半衰期约为6天，并且在JCK小鼠的肾脏中的半衰期约为8天。在野生型小鼠中，肾脏AUC与肝脏AUC的比率为17。在PKD小鼠中，肾脏AUC与肝脏AUC的比率为13。这些数据表明RG4326的药代动力学概况在正常小鼠和PKD小鼠中是相当的。

[0386] 表11：RG4326在正常小鼠和PKD小鼠中的药代动力学概况

[0387]

[0388] 实施例8：RG4326安全评估

[0389] 在体外、离体和体内测定中评价肾脏和肝脏中毒性的可能性。

[0390] 使用生化荧光结合测定(FBA)评估毒性的可能性。通过将荧光染料与每种化合物一起孵育并立即测量荧光来执行FBA。结果表示为相对于对照处理的样品的倍数变化(线性FC)。高荧光化合物具有在体内产生毒性的可能性。

[0391] 用肝脏或肾脏组织切片执行离体测定。通过孵育来自从大鼠中分离的核心肝脏或肾脏样品的一片组织来执行肝脏或肾脏切片测定。孵育24小时后，从组织切片中提取RNA，并且测量包括IFIT的18种促炎基因的表达水平。执行相对于PBS治疗的倍数变化的log2转化(Log2-FC)。促炎基因表达的诱导指示体内促炎作用的可能性。

[0392] 在正常的Sv129小鼠中执行体内测定。施用单次皮下剂量为300mg/kg的RG4326。作为对照治疗，包括PBS和两种与miR-17无关的抗miR，一种已知是促炎性的(阳性对照)，而另一种是非促炎性的(阴性对照)。四天后处死小鼠。分离肾脏和肝脏组织用于RNA提取。测量已知在炎症反应期间诱导的基因IFIT的水平，并将其标准化为小鼠GAPDH。执行相对于PBS治疗的倍数变化的log2转化(Log2-FC)。

[0393] 表11：RG4326的安全性概况

[0394]

[0395] 这些数据表明，基于多种测定，RG4326显示出有利的安全性概况和最小的促炎责任风险。