深海管状蠕虫AprA基因及其表达方法

摘要

深海管状蠕虫AprA基因及其表达方法，涉及深海管状蠕虫AprA基因。深海管状蠕虫AprA基因的编码深海管状蠕虫自分泌增殖抑制蛋白的核苷酸序列。深海管状蠕虫AprA基因的蛋白序列为阅读框编码的蛋白56kDa。深海管状蠕虫AprA基因的分子类型为DNA，序列特征：长度为1491bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，其核酸序列记为SEQ ID No.1。所述重组表达的深海管状蠕虫AprA的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为476aa，类型为氨基酸，序列记为SEQ ID No.3。表达方法：构建深海管状蠕虫AprA基因的重组表达载体；测定深海管状蠕虫AprA基因的重组表达与蛋白活性。

权利要求

1.一种分离的深海管状蠕虫AprA基因，其特征在于其编码深海管状蠕虫自分泌增殖抑制蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述一种分离的深海管状蠕虫AprA基因，其特征在于去除信号肽的序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种分离的深海管状蠕虫AprA蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.如权利要求1所述一种分离的深海管状蠕虫AprA基因的表达方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建深海管状蠕虫AprA基因的重组表达载体；

2)测定深海管状蠕虫AprA基因的重组表达与蛋白活性。

说明书

深海管状蠕虫AprA基因及其表达方法

技术领域

[0001] 本发明涉及深海管状蠕虫AprA基因，尤其是涉及来自深海冷泉的深海管状蠕虫AprA(Lamellibrachia luymesi Autocrine proliferation repressor protein A)基因及其表达方法。

背景技术

[0002] 本发明所涉及的管状蠕虫Lamellibrachia luymesi采自深海冷泉。深海冷泉是比较典型的极端环境，属于化能生态系统，与一般的依赖光合作用获取能量的生态系统不同，其环境严酷，富含甲烷和重金属等有毒有害物质[1]。冷泉生物系统是指示海底冷泉非常直接的标志，甲烷氧化菌和硫酸盐还原菌参与到冷泉流体中的甲烷与硫酸根离子的缺氧甲烷氧化反应中，为化能自养生物提供了碳源和能量，成为冷泉生态系统的初级生产者。在其基础上又发育着菌席和深海双壳类(贻贝类和蛤类)及蠕虫(管状群蠕虫和冰蠕虫)多毛类动物以及海星、海胆、海虾等一级消费者，其中管状蠕虫只出现在冷泉流速较低的环境。

[0003] 很多组织或器官具备能生长到特定大小的固有性质[2]，人们便认为在一些组织在特定阶段有很多分泌因子有抑制细胞增殖的功能，这些分泌因子的鉴定以及它们行使功能的方式可以有助于设计作用于抑制细胞增殖途径的药物，而且为模仿癌症肿瘤休眠方式提供了可能。起初人们发现许多分泌因子的功能在于调节特定组织的大小，但是很多未被鉴定，由于这些因子拥有抑制分泌细胞增殖或生长的能力，所以被称为抑素(chalones)[3]。自分泌增殖抑制蛋白Autocrine proliferation repressor protein A(AprA)就是一种抑素，抑素(chalones)是细胞产生的一类分泌因子，可以在不影响细胞生存的情况下抑制细胞的增殖[4]，且很多证据表明，抑素可能通过G蛋白介导的信号转导途径行使功能[5]。关于AprA研究较多的是Dictyostelium，其分泌的AprA为60kDa，是约150kDa AprA factor复合物的一部分，该复合物能负向调节Dictyostelium分泌细胞的增殖，AprA能减缓增殖但不能停止增殖，并且能够减少多核细胞的数量并增加孢子的产生[6]，缺乏AprA的细胞表现出反常的快速增殖，添加重组的AprA可以缓解AprA-null突变株快速增殖的现象[7]。AprA的抑制增殖作用和化学排斥的激活需要G蛋白的协助，表明AprA可能是GPCR的一个配体[8]。

发明内容

[0004] 本发明的第一个目的是提供深海管状蠕虫AprA基因的核苷酸序列。

[0005] 本发明的第二个目的是提供深海管状蠕虫AprA基因的蛋白序列。

[0006] 本发明的第三个目的是提供深海管状蠕虫AprA基因的表达方法。

[0007] 所述深海管状蠕虫AprA(Autocrine proliferation repressor protein A)基因的编码深海管状蠕虫自分泌增殖抑制蛋白的核苷酸序列，记为AprA。

[0008] 所述深海管状蠕虫AprA基因的蛋白序列为阅读框编码的蛋白56kDa，该蛋白能抑制细胞的生长。

[0009] 所述深海管状蠕虫AprA基因的分子类型为DNA，序列特征：长度为1491bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，其核酸序列记为SEQ ID No.1，如下所示：

[0010]

[0011] 所述深海管状蠕虫AprA基因的核苷酸序列采用以下方法获得：运用转录组结果进行比对拼接得知完整开放阅读框(ORF)长度为1491bp，经序列分析得知AprA ORF中1～60bp为信号肽序列，委托某公司合成得到AprAORF不包含信号肽部分记为SEQ ID No.2，然后通过原核重组表达AprA基因，测定AprA蛋白的活性，且合成的序列首尾携带酶切位点EcoRI和NheI，所述SEQ ID No.2如下：

[0012]

[0013] 所述重组表达的深海管状蠕虫AprA的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为476aa，类型为氨基酸，序列记为SEQ ID No.3，如下所示：

[0014]

[0015] 所述深海管状蠕虫AprA，其蛋白具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID No.3氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

[0016] 所述深海管状蠕虫AprA基因的表达方法包括以下步骤：

[0017] 1)构建深海管状蠕虫AprA基因的重组表达载体；

[0018] 2)测定深海管状蠕虫AprA基因的重组表达与蛋白活性。

[0019] 本发明通过分析合成深海管状蠕虫AprA基因，通过构建原核重组表达质粒，在大肠杆菌中进行重组蛋白表达并验证其抑制生长的活性，为深海生物AprA基因的进一步应用奠定了基础。

附图说明

[0020] 图1为管状蠕虫AprA基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱。在图1中，M:蛋白Marker；line1：重组载体pET-His-AprA在菌株BL21(DE3)PLysS的未诱导表达；line2：重组载体pET-His-AprA在菌株BL21(DE3)PLysS中的诱导表达。

[0021] 图2为BL21(DE3)PLysS生长曲线图。在图2中，对照组转化质粒为pET-His，实验组转化质粒为pET-His-AprA。

具体实施方式

[0022] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。

[0023] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，其具体步骤是：

[0024] 1.深海管状蠕虫Lamellibrachia luymesi AprA基因的合成和序列分析[0025] 由于序列分析得知完整的Lamellibrachia luymesi AprA阅读框长1491bp，可编码496aa，但是其中1～60bp为信号肽序列，于是可委托某公司直接合成两端携带酶切位点的AprA ORF不含信号肽的部分，酶切位点为EcoRI和NheI，合成的AprA基因与pET-His分别进行双酶切，二者酶切产物纯化后连接过夜并转化Top10，菌落PCR后挑取2～3个阳性菌落摇菌培养提取质粒并测序。

[0026] 双酶切体系：

[0027]

[0028]

[0029] 酶切产物纯化(胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit)：

[0030] 1)全部酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切得含目的条带胶块放入EP管；

[0031] 2)分别加入3倍体积(0.1mg＝100μL)Buffer QG；

[0032] 3)50℃水浴10min使胶溶解；

[0033] 4)加入一倍体积异丙醇混匀；

[0034] 5)把液体移入离心柱13000g离心1min，舍去液体；

[0035] 6)加入500μL Beffer QG，13000g离1min，舍去液体；

[0036] 7)加入750μL Beffer PE，13000g离1min，舍去液体；

[0037] 8)13000g空离2min，彻底去掉液体；

[0038] 9)离心柱置于收集管中室温静置2～3min，向离心柱中央滴加30μL H2O溶解2min后离心2mi。

[0039] 载体连接：

[0040]

[0041] 14℃连接过夜。

[0042] 连接产物转化感受态：

[0043] 1)取上述连接产物加入存有感受态Top10的EP管中混匀，冰浴25min；

[0044] 2)42℃热激90s，迅速冰浴2min；

[0045] 3)加入500μL LB培养基，37℃下振荡培养45min；

[0046] 4)吸取100μL培养液均匀涂布于氨苄抗性(pET-His所携带抗性基因)平板，37℃倒置培养过夜。

[0047] 菌落PCR挑选阳性克隆：

[0048] 1)使用灭菌牙签从平板上挑取单菌落转移至提前注入H2O的编号PCR管中并在新的氨苄抗性平板上划线；

[0049] 2)菌落PCR。

[0050] 20μL体系：

[0051]

[0052] 抽提质粒(质粒提取试剂盒 Spin Miniprep Kit)：

[0053] 1)离心菌液收集菌体(8000rpm/min,3min)；

[0054] 2)加入4℃250μLBuffer P1重悬菌体；

[0055] 3)加入250μL Buffer P2，轻轻翻转4～6次使菌体裂解；

[0056] 4)加入350μL Buffer N3，轻轻翻转使混匀，稍微静置使蛋白析出；

[0057] 5)13000g离心10min使蛋白充分沉淀；

[0058] 6)吸取澄清液体转移至微型离心管，13000g离心1min，舍弃液体；

[0059] 7)加入500μL Buffer PB冲洗，13000g离心1min，舍弃液体；

[0060] 8)加入750μL Buffer PE冲洗，13000g离心1min，舍弃液体；

[0061] 9)13000g离心2min彻底把液体离去，稍微静置；

[0062] 10)把柱子置于干净收集管中，于中央加入30μL H2O溶解2min后13000g离心2min。

[0063] 2.深海管状蠕虫Lamellibrachia luymesi AprA蛋白的表达与功能验证[0064] 将以上步骤得到的测序正确质粒pET-His-AprA转化BL21(DE3)PLysS，选取阳性菌落进行诱导表达，同时做一个不加诱导剂的平行做对照，利用SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白AprA的表达(参见图1)。

[0065] AprA是一种具有自分泌效应的抑制细胞增殖的蛋白，最初从双歧杆菌细胞中发现，且AprA会在不影响双歧杆菌生存的情况下抑制双歧杆菌增殖，并且AprA只能减缓但不能阻止细胞增殖。为了证实Lamellibrachia luymesi AprA是否也有抑制细胞增殖的功能，pET-His转化的BL21(DE3)PLysS作为实验对照同pET-His-AprA转化的BL21(DE3)PLysS分别进行摇菌培养并加入诱导剂，以接菌为0时开始每隔1h测定菌液的OD450直到6h(参见图2)。

[0066] 诱导表达：

[0067] 1)挑取阳性菌落于液体培养基中37震荡培养37℃过夜；

[0068] 2)按照1︰40的比例扩大培养；

[0069] 3)分光光度计测定菌液OD450＝0.6时加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM；

[0070] 4)继续培养4～5h后，取1ml菌液离心得菌体沉淀，加入适量蛋白上样缓冲液100℃水浴煮样进行SDS-PAGE电泳。

[0071] SDS-PAGE电泳：

[0072] 1)制胶：分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％；

[0073] 2)样品准备：诱导表达所得样品，14,000×g离心5min，取5～10μL上样；

[0074] 3)电泳：先用100V电压电泳，待溴酚蓝进入分离胶后(约30min)，将电压增至160V，当溴酚蓝刚跑出凝胶时停止电泳；

[0075] 蛋白胶染色：

[0076] 1)SDS-PAGE电泳所得蛋白胶浸泡于约10ml考马斯亮蓝中低速震荡染色1h；

[0077] 2)将蛋白胶取出浸泡于清水中速震荡脱色，需多次换水。

[0078] AprA蛋白活性探究：

[0079] 1)分别挑取pET-His-AprA及pET-His转化的BL21(DE3)PLysS阳性菌落于液体培养基中37℃震荡培养过夜；

[0080] 2)按照1︰40的比例扩大培养；

[0081] 3)从扩大培养开始为0h，每隔1h用分光光度计测定菌液OD450，直到6h；

[0082] 4)所得数据绘制生长曲线图。

[0083] 本发明通过转录组分析比对得知AprA基因的核苷酸序列，对序列进行简单分析，预测管状蠕虫AprA基因所编码的蛋白序列。运用pET-His载体构建适用于原核表达的重组质粒，在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS中进行重组蛋白表达，外源重组蛋白有泄漏表达且抑制了菌株的生长。