一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法

摘要

本发明公开了一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法，所述干细胞冻存液包括如下重量份的组分：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份和羟乙基淀粉2～6份。本发明干细胞冻存液可长时间冻存细胞，并能显著降低细胞的冷冻损伤，使复苏后的细胞具有较高的活率和贴壁性，提高了细胞的冻存效率。同时，本发明干细胞冻存液的成分明确，所用组分均为医用药典注射级辅料，不含血清，有效防止运用异种血清而引入污染和过敏原的风险，且DMSO含量较低，降低了DMSO对细胞的负面影响，安全性高，稳定性好，符合CFDA和FDA的要求，可直接用于人体输注，适用于临床研究和治疗。

权利要求

1.一种脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份、羟乙基淀粉2～6份和勃脉力A注射液70～95份。

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜3～7份、人血白蛋白3～7份、海藻糖1～2份、右旋糖酐40 0.2～1份、羟乙基淀粉2～6份和勃脉力A注射液70～95份。

3.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜5份、人血白蛋白7份、海藻糖2份、右旋糖酐40 0.2份、羟乙基淀粉4份和勃脉力A注射液81.8份。

4.如权利要求1～3任一项所述的脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用适量水分别溶解海藻糖、右旋糖酐40和羟乙基淀粉，得到无菌的海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液和羟乙基淀粉溶液；

(2)依次将海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液、羟乙基淀粉溶液、人血白蛋白加入离子缓冲溶剂中，混合均匀，然后滴加二甲基亚砜，过滤，冷藏，制得所述脐带间充质干细胞冻存液；

所述海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液和羟乙基淀粉溶液的浓度分别为≥10％；

所述冷藏的温度为2～8℃。

5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，采用如权利要求1～3任一项所述的脐带间充质干细胞冻存液冻存干细胞；所述干细胞的密度为1～20×106细胞/mL。

6.如权利要求5所述的脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，所述干细胞为P1～P9代干细胞。

说明书

一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法。

背景技术

[0002] 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，已广泛用于科学研究和临床治疗。干细胞在细胞疗法、再生医学、药物发现、毒理学和发育生物学等方面具有广阔的应用前景。目前，世界范围内已有干细胞药物产品上市，随着科技的发展，干细胞会更加有效和广泛的用于各种疾病的治疗，以弥补传统药物治疗对于某些疾病效果不佳的情况。

[0003] 干细胞的制备或临床应用过程中，其主要保存方式为储存于液氮中低温保存，待需要时再复苏用于继续培养或输注。细胞冷冻保存是生物研究中的重要环节之一，正常细胞在体外培养时随着代数的增加会出现衰老和功能丧失的情况，而细胞冻存对于防止细胞传代培养所导致的细胞退化、传代培养中的细菌污染、解决维持传代培养过程中的一系列问题具有重要作用。

[0004] 目前，在细胞冷冻保存领域中，为保护细胞免受冷冻损伤，人们广泛采用的是在冻存液中添加冷冻保护剂(CPA)。而二甲基亚砜(DMSO)是细胞冷冻保存中最常用的冷冻保护剂，但过高浓度的DMSO对细胞存在一定的毒性，会引起细胞内蛋白变性，因而，不适的DMSO浓度选择会对细胞的保存有着很大影响。此外，现有常规使用的细胞冻存液一般都添加有血清，一方面，血清可保护细胞，降低细胞的冷冻损伤，还可降低DMSO对细胞的损伤；另一方面，血清可提供多种生长因子和营养，维持细胞活率。但血清的加入会存在引入污染和过敏原的风险，无法满足干细胞治疗的临床使用需求。因此，亟需开发出一种安全、细胞冻存效率高、可用于临床的干细胞冻存液。

发明内容

[0005] 为解决上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种干细胞冻存液及其制备方法和冻存方法。本发明的干细胞冻存液，DMSO含量低，不含血清，能长时间冻存干细胞，使复苏后的干细胞具有较高的活率和贴壁性，可安全稳定地用于临床研究和治疗。

[0006] 为实现其目的，本发明采取的技术方案为：

[0007] 一种干细胞冻存液，其包括如下重量份的组分：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份和羟乙基淀粉2～6份。

[0008] 二甲基亚砜(DMSO)能渗透到细胞内，增加胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程，使细胞中部分水分在冻结前透出细胞，减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成，从而保护细胞，减少细胞冷冻损害，增加本发明干细胞冻存液对细胞的保护作用。人血白蛋白(HSA)能在细胞冻存和复苏过程中保护细胞膜，提高冻存复苏过程中细胞的活力。海藻糖(Trehalose)是一种天然的小分子二糖，其可与细胞膜发生相互作用，在冻存和复苏过程中稳定细胞膜蛋白的结构，且海藻糖可形成玻璃态基质，减少细胞外部形成的冰晶对细胞造成的伤害，提高了本发明干细胞冻存液在细胞冻融过程中的活力。右旋糖酐40(Dextran 40)可提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，减少冻存过程中的冰晶形成造成的细胞损伤。

[0009] 优选地，所述干细胞冻存液包括如下重量份的组分：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份、羟乙基淀粉2～6份和离子缓冲溶剂70～95份。本发明通过实验发现，该配方的干细胞冻存液能对细胞起到有效的冷冻保存作用，使用安全性高，能替代现有常规配方的含血清的冻存液。

[0010] 更优选地，所述干细胞冻存液包括如下重量份的组分：二甲基亚砜3～7份、人血白蛋白3～7份、海藻糖1～2份、右旋糖酐40 0.2～1份、羟乙基淀粉2～6份和离子缓冲溶剂70～95份。该配方为本发明通过实验进一步筛选出的优选配方，其对细胞具有较好的冻存效果，干细胞冻存复苏后具有较高的细胞活力，且直径较大，贴壁性和生产状态较好。

[0011] 最优选地，所述干细胞冻存液包括如下重量份的组分：二甲基亚砜5份、人血白蛋白7份、海藻糖2份、右旋糖酐40 0.2份、羟乙基淀粉4份和离子缓冲溶剂81.8份。该配方的干细胞冻存液对细胞的冻存效果最好，冻存效率最高。

[0012] 特别说明，本发明所采用的上述各组分均为医用药典注射级别。

[0013] 优选地，所述离子缓冲溶剂包括勃脉力A注射液、PBS缓冲液、生理盐水、林格氏液、Hanks液中的至少一种。优选地，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液。勃脉力A注射液(Plasma-Lyte A注射液)是一种多重电解质注射液(PH7.4)，也是用于静脉内施用的无菌无热源等渗溶液，能较好地维持细胞内外的渗透压。

[0014] 本发明采用的Plasma-Lyte A注射液可通过市售购买获得，也可自制。

[0015] 优选地，所述Plasma-Lyte A电解质注射液采用以下方法制备而成：

[0016] (1)用电子天平依次精确称量USP级氯化钠(NaCl)5.26g、USP级氯化钾(KCl)0.37g、USP级六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)0.3g、药典级葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)5.02g、药典级三水合醋酸钠(C2H3NaO2·3H2O)3.68g；

[0017] (2)将步骤(1)称取的辅料依次加入1L的烧杯中，向烧杯中加入900mL的超纯水，充分溶解，配置成水溶液；

[0018] (3)用pH计测定步骤(2)得到的水溶液的pH，并调节水溶液的pH至7.2～7.4，最后定容至1L；

[0019] (4)将步骤(3)得到的水溶液分装至若干500mL的蓝盖试剂瓶中，高温高压灭菌(121℃，30min)，常温保存待用。

[0020] 本发明还提供了所述干细胞冻存液的制备方法，其包括如下步骤：

[0021] (1)用适量水分别溶解海藻糖、右旋糖酐40和羟乙基淀粉，得到无菌的海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液和羟乙基淀粉溶液；

[0022] (2)依次将海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液、羟乙基淀粉溶液、人血白蛋白加入离子缓冲溶剂中，混合均匀，然后滴加二甲基亚砜，过滤，冷藏，制得所述干细胞冻存液。

[0023] 本发明上述制备方法的全过程应注意避光操作。步骤(1)中，用水溶解海藻糖、右旋糖酐40和羟乙基淀粉时，可用移液枪吹打，以促进组分的溶解。

[0024] 二甲基亚砜的浓度过高会引起蛋白变性，本发明一方面通过合理控制二甲基亚砜的用量来避免这一问题的发生，另一方面，本发明在制备所述干细胞冻存液时，将二甲基亚砜放到最后才滴加，如此，可进一步避免前述问题的发生。

[0025] 优选地，所述海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液和羟乙基淀粉溶液的浓度分别为≥10％。在制备干细胞冻存液时，先用水将海藻糖、右旋糖酐40和羟乙基淀粉溶解过滤，即可保证组分无菌，又便于后续配制冻存液。

[0026] 优选地，所述冷藏的温度为2～8℃。在该温度下，可使所述干细胞冻存液的各组分保持活性。

[0027] 本发明还提供了一种所述干细胞冻存液的应用，优选地，所述干细胞冻存液用于冻存脐带间充质干细胞。

[0028] 本发明还提供了一种干细胞冻存方法，具体是，采用本发明所述干细胞冻存液冻存干细胞。

[0029] 优选地，所述干细胞的密度为1～20×106细胞/mL。

[0030] 优选地，所述干细胞为P1～P9代干细胞。

[0031] 优选地，所述干细胞为脐带间充质干细胞。

[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明干细胞冻存液可长时间冻存细胞，并能显著降低细胞的冷冻损伤，使复苏后的细胞具有较高的活率和贴壁性，提高了细胞的冻存效率。同时，本发明干细胞冻存液的成分明确，所用组分均为医用药典注射级辅料，不含血清，有效防止运用异种血清而引入污染和过敏原的风险，且DMSO含量较低，降低了DMSO对细胞的负面影响，安全性高，稳定性好，符合CFDA和FDA的要求，可直接用于人体输注，适用于临床研究和治疗。

附图说明

[0033] 图1为使用对比例1、实施例1～3的冻存液冻存复苏后，干细胞的生长状态；

[0034] 图2为使用实施例4～7的冻存液冻存复苏后，干细胞的生长状态；

[0035] 图3为使用对比例2～3的冻存液冻存复苏后，干细胞的生长状态。

具体实施方式

[0036] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，本发明通过下列实施例进一步说明。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。实施例中，所用方法如无特别说明，均为常规方法。

[0037] 本发明提供了一种干细胞冻存液，其包括如下重量份的组分：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份和羟乙基淀粉2～6份。

[0038] 本发明的干细胞冻存液不含血清，DMSO含量低，细胞冻存效果好，可安全稳定地用于临床研究和治疗。

[0039] 在一个优选的实施方式中，所述干细胞冻存液主要由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜3～10份、人血白蛋白2～7份、海藻糖0.5～3份、右旋糖酐40 0.2～2份、羟乙基淀粉2～6份和离子缓冲溶剂70～95份。所述离子缓冲溶剂包括勃脉力A注射液、PBS缓冲液、生理盐水、林格氏液、Hanks液中的至少一种。优选地，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液。勃脉力A注射液可通过市售购买获得，也可自制。本发明通过实验发现，该配方的干细胞冻存液能对细胞起到有效的冷冻保存作用，使用安全性高，能替代现有常规配方的含血清的冻存液。

[0040] 在一个更优选的实施方式中，所述干细胞冻存液主要由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜3～7份、人血白蛋白3～7份、海藻糖1～2份、右旋糖酐40 0.2～1份、羟乙基淀粉
2～6份和离子缓冲溶剂70～95份。该配方为本发明通过实验进一步筛选出的优选配方，其对细胞具有较好的冻存效果，干细胞冻存复苏后具有较高的细胞活力，且直径较大，贴壁性和生产状态较好。

[0041] 在一个最优选的实施方式中，所述干细胞冻存液主要由如下重量份的组分组成：二甲基亚砜5份、人血白蛋白7份、海藻糖2份、右旋糖酐40 0.2份、羟乙基淀粉4份和离子缓冲溶剂81.8份。本发明通过实验发现，该配方的干细胞冻存液对细胞的冻存效果最好，冻存效率最高。

[0042] 本发明还提供了一种Plasma-Lyte A电解质注射液的制备方法，其包括如下步骤：

[0043] (1)用电子天平依次精确称量USP级氯化钠(NaCl)5.26g、USP级氯化钾(KCl)0.37g、USP级六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)0.3g、药典级葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)5.02g、药典级三水合醋酸钠(C2H3NaO2·3H2O)3.68g；

[0044] (2)将步骤(1)称取的辅料依次加入1L的烧杯中，向烧杯中加入900mL的超纯水，充分溶解，配置成水溶液；

[0045] (3)用pH计测定步骤(2)得到的水溶液的pH，并调节水溶液的pH至7.2～7.4，最后定容至1L；

[0046] (4)将步骤(3)得到的水溶液分装至若干500mL的蓝盖试剂瓶中，高温高压灭菌(121℃，30min)，常温保存待用。

[0047] 本发明还提供了一种所述干细胞冻存液的制备方法，其包括如下步骤：

[0048] (1)用适量超纯水分别溶解海藻糖、羟乙基淀粉和右旋糖酐40，溶解过程可借助移液枪吹打，得到浓度分别为10％的海藻糖溶液、羟乙基淀粉溶液和右旋糖酐40溶液；

[0049] (2)在离心管中加入勃脉力A注射液，然后依次加入海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液、羟乙基淀粉溶液、人血白蛋白，混合均匀，然后滴加DMSO，过滤，于2～8℃冰箱中冷藏，即完成制备。

[0050] 本发明还提供了一种干细胞冻存方法，包括：采用本发明所述干细胞冻存液冻存干细胞。

[0051] 在一个优选的实施方式中，所述干细胞的密度为1～20×106细胞/mL。

[0052] 在一个优选的实施方式中，所述干细胞为P1～P9代干细胞。

[0053] 在一个优选的实施方式中，所述干细胞为脐带间充质干细胞。

[0054] 为更清楚的理解本发明，下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0055] 实施例1

[0056] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1份、右旋糖酐40 0.2份、人血白蛋白3份、二甲基亚砜3份、羟乙基淀粉5份和勃脉力A注射液87.8份。

[0057] 实施例2

[0058] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1份、右旋糖酐40 0.5份、人血白蛋白5份、二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉6份和勃脉力A注射液82.5份。

[0059] 实施例3

[0060] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1份、右旋糖酐40 1份、人血白蛋白7份、二甲基亚砜7份、羟乙基淀粉2份和勃脉力A注射液82份。

[0061] 实施例4

[0062] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1.5份、右旋糖酐40 0.2份、人血白蛋白5份、二甲基亚砜7份、羟乙基淀粉5份和勃脉力A注射液81.3份。

[0063] 实施例5

[0064] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1.5份、右旋糖酐40 1份、人血白蛋白3份、二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉6份和勃脉力A注射液83.5份。

[0065] 实施例6

[0066] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖2份、右旋糖酐40 0.2份、人血白蛋白7份、二甲基亚砜5份、羟乙基淀粉4份和勃脉力A注射液81.8份。

[0067] 实施例7

[0068] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖2份、右旋糖酐40 0.5份、人血白蛋白3份、二甲基亚砜7份、羟乙基淀粉5份和勃脉力A注射液82.5份。

[0069] 所述实施例1～7的干细胞冻存液的制备方法，其包括如下步骤：

[0070] (1)用适量超纯水分别溶解海藻糖、羟乙基淀粉和右旋糖酐40，溶解过程可借助移液枪吹打，得到浓度分别为10％的海藻糖溶液、羟乙基淀粉溶液和右旋糖酐40溶液；

[0071] (2)在离心管中加入勃脉力A注射液，然后依次加入海藻糖溶液、右旋糖酐40溶液、羟乙基淀粉溶液、人血白蛋白，混合均匀，然后滴加DMSO，过滤，于4℃冰箱中冷藏待用，即完成制备。

[0072] 实施例中采用的勃脉力A注射液为自制，具体的制备方法本发明在上文描述中已具体给出，在此不再赘述。

[0073] 对比例1

[0074] 一种常规的细胞冻存液，其由以下质量百分含量的组分组成：胎牛血清90％和二甲基亚砜10％。

[0075] 对比例2

[0076] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖1.5份、右旋糖酐40 0.5份、人血白蛋白8份、二甲基亚砜2份、羟乙基淀粉8份和勃脉力A注射液80份。

[0077] 对比例3

[0078] 一种干细胞冻存液，其由如下重量份的组分组成：海藻糖4份、右旋糖酐40 3份、人血白蛋白1份、二甲基亚砜4份、羟乙基淀粉8份和勃脉力A注射液80份。

[0079] 对比例2～3的干细胞冻存液的制备方法参照上述实施例的制备方法。

[0080] 实验例

[0081] 一、脐带间充质干细胞的制备，步骤如下：

[0082] (1)分离培养脐带间充质干细胞：

[0083] 经家属同意后，收集刚出生婴儿临床舍弃的脐带，消毒后将脐带放入保存液的瓶子中，4℃保存待用。

[0084] 取出脐带，将脐带转移至装有生理盐水的培养皿中，去除脐带表面血渍、粘液及血管内的凝血，将脐带转移至第二个装有生理盐水的培养皿中。用剪刀将脐带剪成若干小段，在第三个培养皿中洗涤脐带小段。将脐带转移至第四个培养皿中，用镊子将静脉完全暴露并剔除，用两把眼科镊将动脉剔除。将华尔通式胶从羊膜上剥离，放入第五个培养皿中，并将组织剪碎成小块，用基础培养基重悬组织。

[0085] 离心，弃去上清，培养基重悬。分装于培养瓶中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。每3天换一次液，7～14天左右在显微镜下能观察到细胞爬出，当细胞生长至80％～90％汇合时，胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。

[0086] (2)脐带间充质干细胞的扩增培养和冻存：

[0087] 当上述原代细胞生长至80％～90％汇合时，吸弃培养液，用生理盐水洗涤培养瓶内壁一次，然后加入胰蛋白酶消化，待细胞开始皱缩，拍打培养瓶促使细胞脱离瓶壁，立即加入终止液混匀，并收集细胞悬液于离心管中，细胞悬液过200目细胞筛除去脐带组织块，过滤后的悬液离心，弃去上清，加入无血清培养基重悬，按照0.5～2×104细胞/cm2密度传代。细胞传代至P1代时，取100万细胞做流式检测，测定细胞表面标志物，鉴定脐带间充质干细胞。

[0088] 细胞传代至P7代时，细胞进行冻存操作。冻存前检测细胞数量、活力、直径等。细胞冻存密度为1×107细胞/mL，每只冻存管中加入1mL冻存液。

[0089] (3)脐带间充质干细胞的复苏及收集：

[0090] 将冻存的P7代细胞进行复苏，复苏后立即进行细胞计数，测定细胞数量、活力、直径等。按照0.5～2×104细胞/cm2密度接种于培养瓶中，将培养瓶放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基为无血清培养基。待培养一定时间后，弃去培养基，用PBS洗涤培养瓶内壁一次，然后加入胰蛋白酶消化，待细胞开始皱缩，拍打培养瓶促使细胞脱离瓶壁，立即加入终止液混匀，并收集细胞悬液于离心管中，离心弃去上清，加入PBS重悬，细胞计数测定细胞数量、活力、直径等。

[0091] 二、验证本发明实施例和对比例的冻存液对脐带间充质干细胞的冻存效果。

[0092] 配制上述实施例1～7和对比例1～3的冻存液。选取P7代脐带间充质干细胞，待细胞长满培养瓶底部80～90％时，吸弃培养液，加入PBS润洗一遍，然后加入适量胰蛋白酶，待细胞收缩变圆时，拍打培养瓶促使细胞脱离瓶壁并立即加入终止液，收集细胞，1300rpm离心4min，弃上清，加入PBS重悬后细胞计数仪进行计数，计数后离弃PBS，用配好的冻存液按照1×107细胞/mL密度冻存细胞，每管1mL，各组设置三个平行。

[0093] 将冻存管放入恢复至室温的程序降温盒中，程序降温盒放入-80℃冰箱中过夜，第二天转移至液氮罐中储存。十天后，取出液氮罐中的细胞进行复苏，冻存管放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中不断摇晃冻存管，待完全融化后，加入培养基稀释细胞悬液，用培养基把冻存管洗1～2次，1300rpm离心4min，弃上清，加入PBS重悬后细胞计数仪进行计数，最后将细胞按照0.5～2×104细胞/cm2密度接种于培养瓶中，将培养瓶放置于37℃，5％CO2培养箱中培养12小时，拍照观察细胞生长状态，并收集细胞，用细胞计数仪进行计数，测定细胞数量、活力及直径等。

[0094] 1、测定的细胞数量、活力、直径等结果见表1。

[0095] 表1

[0096]

[0097]

[0098] 由表1可看出，实施例1～7与对比例1相比，实施例2、4、5和6经过冻存复苏后，冻存液对细胞的冻存效率显著高于对比例1；实施例1、3和7经过冻存复苏后，冻存液对细胞的冻存效率与对比例1无显著差异。说明本发明配方的干细胞冻存液可达到甚至优于现有含异种血清的细胞冻存液的细胞冻存效果，可替代现有常规配方的含血清的冻存液，防止运用异种血清而引入污染和过敏原的风险。另外，实施例6的冻存液配方对脐带间充质干细胞的冻存效率最高，复苏培养12小时后与冻存前细胞数比值为118.93±4.35％，高于对比例1(104.27±2.64％)14.66％。这证明了实施例6的细胞冻存液配方对脐带间充质干细胞的冻存效果较好。而对比例2和对比例3经过冻存复苏后，冻存液对细胞的冻存效率显著低于对比例1。这证明了本发明干细胞冻存液中，各组分的比例不同，也会显著影响其对细胞的冻存效果。

[0099] 2、细胞的生长状态见图1～3所示，从图中可看出，实施例与对比例相比，实施例1～7经过冻存复苏后，脐带间充质干细胞的生长状态和对比例1无显著差异；对比例2和3经过冻存复苏后，脐带间充质干细胞的生长状态显著低于对比例1。

[0100] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。