马齿苋酰胺E用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途

摘要

本发明公开了马齿苋酰胺E或其前药用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途。

权利要求

1.马齿苋酰胺E用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途，所述马齿苋酰胺E具有如式(I)所示的结构：所述药物形成治疗缺血性心脏病的药物制剂；所述药物制剂包含所述马齿苋酰胺E，还包含药学上可接受的辅料；所述药物制剂以所述马齿苋酰胺E作为唯一活性成分；单位药物制剂中马齿苋酰胺E的含量为65～260mg。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物形成用于提高左室射血分数与短轴缩短率、降低血清中CK-MB、升高血清中SOD与GSH-Px的药物制剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物形成用于减轻心肌组织的炎症程度及纤维化程度的药物制剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物形成用于抑制心肌细胞凋亡的药物制剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物形成用于降低细胞内的钙离子浓度的药物制剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，单位药物制剂中马齿苋酰胺E的含量为65～150mg。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，单位药物制剂中马齿苋酰胺E的含量为70～130mg。

说明书

马齿苋酰胺E用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及马齿苋酰胺E的用途，尤其是马齿苋酰胺E或其前药用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途。

背景技术

[0002] 多刺绿绒蒿Meconopsis horridula Hook.f.et Thoms.是罂粟科绿绒蒿属植物，藏名为乌巴拉色尔布，全草或地上部分可入药。马齿苋酰胺E(Oleracein E,OE)是从多刺绿绒蒿中提取得到的四氢异喹啉类生物碱，具有体外抗氧化、神经保护、抗菌和抗病毒等作用。

[0003] CN101234121B公开了马齿苋酰胺类生物碱在制备抗氧化剂和神经元保护剂中的应用。所述马齿苋酰胺类生物碱优选是指马齿苋酰胺A(oleracein A)、马齿苋酰胺B(oleracein B)或马齿苋酰胺E(oleracein E)的单体。

[0004] CN103948596A公开了马齿苋酰胺E在制备抗老年痴呆药物中的应用，涉及马齿苋酰胺E延长老年痴呆寿命、增强老年痴呆代谢能力、缓解老年痴呆氧化应激、保护老年痴呆神经细胞和提高老年痴呆记忆能力五方面的应用。

[0005] 到目前为止，尚未见有人报道马齿苋酰胺E在制备治疗缺血性心脏病的药物方面的应用。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种马齿苋酰胺E或其前药的新的医药用途。本发明采用如下技术方案实现上述目的。

[0007] 马齿苋酰胺E或其前药用于制备治疗缺血性心脏病的药物的用途，所述马齿苋酰胺E具有如式(I)所示的结构：

[0008]

[0009] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成治疗缺血性心脏病的药物制剂；所述药物制剂包含所述马齿苋酰胺E或其前药，还包含药学上可接受的辅料。

[0010] 根据本发明的用途，优选地，所述药物制剂以所述马齿苋酰胺E或其前药作为唯一活性成分。

[0011] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成用于提高左室射血分数与短轴缩短率、降低血清中CK-MB、升高血清中SOD与GSH-Px的药物制剂。

[0012] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成用于减轻心肌组织的炎症程度及纤维化程度的药物制剂。

[0013] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成用于抑制心肌细胞凋亡的药物制剂。

[0014] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成用于降低细胞内的钙离子浓度的药物制剂。

[0015] 根据本发明的用途，优选地，所述药物形成治疗缺血性心脏病的药物制剂；单位药物制剂中马齿苋酰胺E或其前药的含量为65～260mg。

[0016] 根据本发明的用途，优选地，单位药物制剂中马齿苋酰胺E或其前药的含量为65～150mg。

[0017] 根据本发明的用途，优选地，单位药物制剂中马齿苋酰胺E或其前药的含量为70～130mg。

[0018] 本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以用于制备具有治疗缺血性心脏病作用的药物。本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以提高左室射血分数与短轴缩短率、降低血清中CK-MB、升高血清中SOD与GSH-Px。本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以减轻心肌组织的炎症程度及纤纤维化程度。本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以抑制心肌细胞凋亡。本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以降低细胞内的钙离子浓度。

附图说明

[0019] 图1为实施例1中各组小鼠血清中CK-MB的变化情况图。

[0020] 图2为实施例1中各组小鼠血清中SOD的变化情况图。

[0021] 图3为实施例1中各组小鼠血清中GSH-Px的变化情况图。

[0022] 图4A为实施例1中假手术组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0023] 图4B为实施例1中模型组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0024] 图4C为实施例1中金纳多银杏叶提取物组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0025] 图4D为实施例1中OE高剂量组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0026] 图4E为实施例1中OE中剂量组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0027] 图4F为实施例1中OE低剂量组小鼠的心肌组织切片HE染色结果图。

[0028] 图5A为实施例6中空白对照组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

[0029] 图5B为实施例6中模型组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

[0030] 图5C为实施例6中OE高剂量组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

[0031] 图5D为实施例6中OE中剂量组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

[0032] 图5E为实施例6中OE低剂量组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

[0033] 图5F为实施例6中阳性药槲皮素组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果图。

具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

[0035] 本发明的马齿苋酰胺E的结构如下所示：

[0036]

[0037] 本发明中，所述马齿苋酰胺E的分子式为C12H13NO3，分子量为219.237。马齿苋酰胺E为已知化合物，可以采用从植物的花、果、叶、茎、根中提取分离得到，例如可根据文献《藏药红花绿绒蒿的化学成分》(吴海峰等，天然产物研究与开发，2011年)公开的方法制备得到，也可根据文献《抗氧化剂马齿苋酰胺E及其衍生物的合成》(刘册家，山东大学硕士学位论文，2010年)公开的方法制备得到。

[0038] 本发明中，马齿苋酰胺E的前药是指在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出马齿苋酰胺E而发挥药效的化合物。

[0039] 本发明中，马齿苋酰胺E或其前药具有治疗缺血性心脏病作用，可以用于制备具有治疗缺血性心脏病作用的药物。根据本发明的一些实施方式，本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以提高左室射血分数与短轴缩短率、降低血清中CK-MB、升高血清中SOD与GSH-Px。根据本发明的又一些实施方式，本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以减轻心肌组织的炎症程度及纤纤维化程度。根据本发明的又一些实施方式，本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以抑制心肌细胞凋亡。根据本发明的再一些实施方式，本发明的马齿苋酰胺E或其前药可以降低细胞内的钙离子浓度。

[0040] 本发明中，所述治疗缺血性心脏病的药物可以马齿苋酰胺E和/或其前药作为唯一活性成分；也可以包含其他具有治疗缺血性心脏病作用的活性成分，或者包含本身不具有治疗缺血性心脏病作用、但能够辅助马齿苋酰胺E和/或其前药发挥治疗缺血性心脏病作用的活性成分。

[0041] 本发明中，所述治疗缺血性心脏病的药物可以为原料药，也可以为药物制剂。

[0042] 本发明中，所述药物形成具有治疗缺血性心脏病作用的药物制剂。单位药物制剂中，所述马齿苋酰胺E或其前药的含量为65～260mg，优选为65～150mg，更优选为70～130mg。单位药物制剂是指一个制备和应用单位的制剂，例如一片片剂、一袋颗粒剂、一个胶囊、一瓶口服液等。单位药物制剂中马齿苋酰胺E或其前药的含量在上述范围时，便于服用，也便于发挥治疗缺血性心脏病功效。

[0043] 本发明中，所述药物制剂的剂型不限，可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂等。所述药物制剂还可以包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料的种类不做限制。辅料可以为填充剂、矫味剂、润滑剂等。填充剂又称稀释剂，例如小麦淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、乳糖等。矫味剂的实例包括但不限于蔗糖素、异麦芽酮糖、阿斯巴甜、安赛蜜等。润滑剂实例包括但不限于硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、月桂醇硫酸镁等。

[0044] 以下实施例采用的实验试剂、仪器、生物材料以及检测指标如下：

[0045] DMEM基础培养基、胎牛血清(fetal calf serum，简称FBS)、0.25％胰蛋白酶-EDTA、二甲亚砜均为常规市售产品。槲皮素购买自美国Sigma公司。

[0046] 谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)。

[0047] CCK8细胞增殖和毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8)购买自日本同仁化学研究所(Dojindo)。流式凋亡检测试剂盒购买自索莱宝公司。活性氧检测试剂盒购买自美国BD公司。

[0048] 大鼠H9c2心肌细胞：采用DMEM完全培养基(含有90％的DMEM基础培养基和10％的胎牛血清FBS)培养；细胞培养条件为：37℃，5％CO2，饱和湿度培养。

[0049] ICR小鼠：25～28g，7～8周龄，购买自北京斯贝福生物有限公司；在SPF级环境中饲养。

[0050] OD(optical density)是指光密度，又叫通光率，表示被检测物吸收掉的光密度，OD＝lg(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。

[0051] 实施例1-马齿苋酰胺E治疗缺血性心脏病的药效评价

[0052] 1.造模、分组及给药

[0053] 1.1造模

[0054] 取健康发育的雄性ICR小鼠100只，随机分为M组和N组，M组为84只小鼠，N组为16只小鼠。

[0055] M组小鼠均腹腔注射50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，将M组小鼠固定后，剔除前胸鼠毛，连接动物呼吸机(呼吸频率100次/min，吸呼比1:1，潮气量2mL/kg)，于小鼠左侧胸腔第3、4肋间逐层开胸并暴露心脏，左心耳下1～2mm处观察到小鼠左冠状动脉血管，并用规格为7-0的无菌带线缝合针在左冠状动脉血管处行结扎后，规格为5-0的无菌带线缝合针逐层缝合关胸。

[0056] N组小鼠均腹腔注射50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，将N组小鼠固定后，剔除前胸鼠毛，连接动物呼吸机(呼吸频率100次/min，吸呼比1:1，潮气量2mL/kg)，于小鼠左侧胸腔第3、4肋间逐层开胸并暴露心脏，左心耳下1～2mm处观察到小鼠左冠状动脉血管，并用规格为7-0的无菌带线缝合针在左冠状动脉血管处只穿线不结扎，规格为5-0的无菌带线缝合针逐层缝合关胸。

[0057] 上述各组小鼠在术后均给自由饮食饮水，常规饲养。

[0058] 1.2分组及给药

[0059] 造模24h后，选取N组中12只小鼠作为假手术组；选取M组60只小鼠并随机平均分成5组，分别为：模型组、金纳多银杏叶提取物组、OE低剂量组(马齿苋酰胺E低剂量组)、OE中剂量组(马齿苋酰胺E中剂量组)和OE高剂量组(马齿苋酰胺E高剂量组)；上述各组均连续灌胃给药7天。

[0060] 上述各组给药如下：

[0061] 假手术组：0.5％CMC-Na；

[0062] 模型组：0.5％CMC-Na；

[0063] 金纳多银杏叶提取物组：金纳多银杏叶提取物的剂量为120mg/kg；

[0064] OE低剂量组(马齿苋酰胺E低剂量组)：马齿苋酰胺E的剂量为10mg/kg；

[0065] OE中剂量组(马齿苋酰胺E中剂量组)：马齿苋酰胺E的剂量为20mg/kg；

[0066] OE高剂量组(马齿苋酰胺E高剂量组)：马齿苋酰胺E的剂量为40mg/kg。

[0067] 马齿苋酰胺E和金纳多银杏叶提取物均以0.5％CMC-Na溶解，灌胃体积以0.1mL/10g小鼠体重换算。

[0068] 2.检测项目及结果

[0069] 2.1心脏超声检测

[0070] 给药7天后，各组小鼠均用异氟烷麻醉，卧位固定，采用M型超声检测各组小鼠心脏的左室舒张末内径(LVEDd)，左室收缩末内径(LVEDs)，计算左室射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。根据ICR小鼠心脏的左室舒张末内径(LVEDd)和左室收缩末内径(LVEDs)，计算短轴缩短率(FS)。短轴缩短率(FS)的计算公式为：FS％＝[(LVEDd-LVEDs)/LVEDd]×100％。各组小鼠心脏超声检测结果参见表1。

[0071] 表1各组小鼠心脏超声检测结果

[0072]

[0073] 注释：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

[0074] 2.2血生化指标检测

[0075] 灌胃给药7天后，全自动生化分析仪检测血清中的肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。各组小鼠血生化检测结果参见图1～3。

[0076] 模型组小鼠的血清中CK-MB明显升高，这说明模型组小鼠的心肌细胞受损严重；与模型组相比较，OE低剂量组、OE中剂量组与OE高剂量组小鼠的血清中CK-MB均显著降低(P<0.001)。

[0077] 与模型组相比较，OE低剂量组、OE中剂量组与OE高剂量组小鼠的血清中SOD与GSH-Px这两种抗氧化酶均显著提高，尤其以OE高剂量组升高最为显著，且OE高剂量组与金纳多银杏叶提取物组作用相当。

[0078] 2.3心脏病理组织检测

[0079] 2.3.1组织石蜡包埋

[0080] (1)取材固定：取小鼠心脏，浸泡在4％多聚甲醛中72h以上；

[0081] (2)水洗：将心脏从4％多聚甲醛中取出，沿结扎线横切，将心脏分为两部分，流水冲洗，双蒸水浸洗；

[0082] (3)脱水、透明与浸蜡：将上述步骤(2)处理好的组织依次放入75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-二甲苯I 5～10min-二甲苯II 5～10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III加热至60℃1h；其中，Ⅰ、Ⅱ、III仅代表第几次处理，如蜡Ⅰ1h是指蜡第一次处理1h，蜡II 1h是指蜡第二次处理1h，蜡III加热至60℃1h是指蜡第三次加热至60℃处理1h。

[0083] (4)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内包埋，室温冷却；

[0084] (5)切片、贴片与拷片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上使组织展平，将其贴附到载玻片上，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

[0085] 2.3.2HE染色

[0086] (1)脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 20min-二甲苯II 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇II 10min-95％乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min；其中，Ⅰ、Ⅱ仅代表第几次处理，如无水乙醇Ⅰ10min是指无水乙醇第一次处理10min，无水乙醇Ⅱ10min是指无水乙醇第二次处理10min。

[0087] (2)染色：苏木精染液(染细胞核)8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。伊红染液(染细胞质)中染色1～3min；

[0088] (3)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-二甲苯I 5min-二甲苯II 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片，显微镜观察。其中，Ⅰ、Ⅱ仅代表第几次处理，如无水乙醇Ⅰ5min是指无水乙醇第一次处理5min，无水乙醇Ⅱ5min是指无水乙醇第二次处理5min。各组小鼠心肌组织切片HE染色结果参见图4A～4F。

[0089] 3.实验结论

[0090] 各组小鼠心脏超声检测结果表明，与模型组相比，金纳多银杏叶提取物组的左室射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)均显著提高，具有极显著性差异(P＜0.001)；OE高剂量组的左室射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)均显著提高，具有极显著性差异(P＜0.001)；OE中剂量组的左室射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)均显著提高，具有显著性差异(P＜0.05)；OE低剂量组的左室射血分数(EF)显著提高，具有显著性差异(P＜0.05)。

[0091] 各组小鼠血生化检测结果表明，与模型组相比，金纳多银杏叶提取物组的CK-MB显著升高，具有极显著性差异(P＜0.001)；OE低剂量组与OE高剂量组小鼠的血清中CK-MB均显著降低，具有极显著性差异(P＜0.01)；OE中剂量组小鼠的血清中CK-MB显著降低，具有显著性差异(P＜0.05)。

[0092] 各组小鼠血生化检测结果表明，与模型组相比较，金纳多银杏叶提取物组的SOD显著升高，具有极显著性差异(P＜0.01)；OE中剂量组与OE高剂量组小鼠的血清中SOD均显著升高，具有显著性差异(P＜0.05)。

[0093] 各组小鼠血生化检测结果表明，与模型组相比较，金纳多银杏叶提取物组的GSH-Px显著升高，具有极显著性差异(P＜0.001)；OE高剂量组小鼠的血清中GSH-Px显著升高，具有极显著性差异(P＜0.001)；OE中剂量组小鼠的血清中GSH-Px显著升高，具有显著性差异(P＜0.05)。

[0094] 各组小鼠心肌组织切片HE染色结果表明，与模型组相比，金纳多银杏叶提取物组的心肌组织的炎症程度及纤维化程度显著减轻；OE高剂量组的心肌组织的炎症程度及纤维化程度显著减轻；OE中剂量组的心肌组织的炎症程度及纤维化程度显著减轻；OE低剂量组的心肌组织的炎症程度及纤纤维化程度显著减轻。

[0095] 由上述实验可知，OE(马齿苋酰胺E)能显著提高左室射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)，显著降低肌酸激酶同工酶(CK-MB)，显著升高血清中SOD与GSH-Px这两种抗氧化酶，显著减轻心肌组织的炎症程度及纤维化程度，这表明马齿苋酰胺E具有治疗缺血性心脏病的作用，可用于制备治疗缺血性心脏病的药物。

[0096] 实施例2-CCK8细胞增殖试验

[0097] 1.实验方法与结果

[0098] 采用CCK8试剂(细胞计数试剂盒，Cell Counting Kit8)，测定不同浓度的OE(马齿苋酰胺E)对于H9c2心肌细胞增殖活性的影响。

[0099] 取对数期的H9c2细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/ml，加入96孔板，每孔100μl。将上述细胞培养24h，使其完全贴壁，将OE(马齿苋酰胺E)母液用完全培养基稀释成10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM，每个浓度设置6个副孔；设置空白对照组；在给药24h后，每孔加入含有10％CCK8的无血清培养基100μl，恒温培养箱中孵育2h后于450nm处测定OD值，并以公式计算各组的抑制率。OE对H9c2细胞增殖的影响参见表1。

[0100] 表1 OE对H9c2细胞增殖的影响

[0101] 分组 抑制率(％)空白对照组 100.00±5.22
OE(10μM) 69.84±4.624
OE(20μM) 98.50±4.198
OE(40μM) 110.8±3.05
OE(80μM) 106.6±1.798
OE(160μM) 97.69±5.474
OE(320μM) 101.8±2.626

[0102] 2.实验结论

[0103] 表1表明，OE在160μM以下对H9c2细胞无抑制增殖作用，但随着OE浓度的增加，当OE浓度达到320μM时，OE明显抑制H9c2细胞增殖。这表明，OE在160μM以下，OE对H9c2细胞无抑制增殖作用，OE用药相对安全。

[0104] 实施例3-CCK8测定细胞氧化应激试验

[0105] 1.实验方法与结果

[0106] 采用CCK8试剂(细胞计数试剂盒，Cell Counting Kit8)，测定不同浓度的OE(马齿苋酰胺E)对H2O2损伤的H9c2心肌细胞是否有保护作用。

[0107] 取对数期的H9c2细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，加入96孔板，每孔100μl。将上述细胞培养24h，使其完全贴壁，将OE(马齿苋酰胺E)母液用完全培养基稀释成5μM、10μM、20μM，每个浓度设置6个副孔；设置空白对照组，另外设置模型组、阳性药槲皮素组(槲皮素的浓度为10μM)；在给药24h后，弃去培养液，每孔加入100μl的50μM的H2O2刺激2h，每孔加入含有10％的CCK8的无血清培养基100μl，恒温培养箱中孵育2h后于450nm处测定OD值，并以公式计算各组的抑制率。各组对H2O2诱导的H9c2细胞增殖的影响参见表2。

[0108] 表2各组对H2O2诱导的H9c2细胞增殖的影响

[0109]分组 保护率(％)
空白对照组 100.0±1.988
模型组 47.15±1.508
阳性药槲皮素组(10μM) 72.53±2.284
OE(20μM) 78.23±2.908
OE(10μM) 74.04±1.833
OE(5μM) 62.98±4.048

[0110] 2.实验结论

[0111] 表2表明，与模型组相比较，OE在20μM、10μM、5μM时对于H2O2造成的损伤均具有很好的改善作用，并且存在剂量依赖性。OE在20μM时对于H2O2造成的损伤的改善作用与阳性药槲皮素组(10μM)对于H2O2造成的损伤的改善作用相当。

[0112] 实施例4-流式细胞仪检测细胞凋亡试验

[0113] 1.实验方法与结果

[0114] 取对数期的H9c2细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，加入6孔板，每孔2ml。细胞培养24h，使其完全贴壁，将OE(马齿苋酰胺E)母液用完全培养基稀释成5μM、10μM、20μM，每个浓度设置3个副孔；设置空白对照组，另外设置模型组、阳性药槲皮素组(槲皮素的浓度为10μM)；在给药6h后，弃去培养液，每孔加入的2ml 50μM的H2O2刺激1h，按照Annexin V-FITC/PI检测试剂盒方法操作。简言之，0.25％胰蛋白酶(不含EDTA)消化成单细胞悬液进行实验，使得收集的细胞总数为1×106个。用PBS洗细胞两次，350rpm离心5min，收集细胞。加入Annexin V binding buffer悬浮细胞，加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI混匀，避光，室温反应15min，流式细胞仪分析，得到细胞凋亡率。各组对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响参见表3。

[0115] 表3各组对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响

[0116] 分组 凋亡率(％)空白对照组 14.63±3.099
模型组 44.20±5.767
阳性药槲皮素组(10μM) 27.97±7.353
OE(20μM) 21.72±2.705
OE(10μM) 28.75±4.587
OE(5μM) 29.65±5.949

[0117] 2.实验结论

[0118] 表1表明，与模型组相比较，OE能抑制所述心肌细胞凋亡，且细胞凋亡率与剂量成反比，即随着给药浓度的上升，H9c2心肌细胞凋亡率逐渐降低。

[0119] 实施例5-流式细胞仪检测细胞活性氧试验

[0120] 1.实验方法与结果

[0121] 取对数期的H9c2细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，加入6板，每孔2ml。细胞培养24h，使其完全贴壁，将OE(马齿苋酰胺E)母液用完全培养基稀释成5μM、10μM、
20μM，每个浓度设置3个副孔；设置空白对照组，另外设置模型组、阳性药槲皮素组(槲皮素的浓度为10μM)；在给药6h后，弃去培养液，每孔加入的2ml 50μM的H2O2刺激1h。收集孔板内的所有细胞，离心后倒掉上清，加入1mL预冷PBS清洗两遍。按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃恒温培养箱培养20min。
每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞的DCFH-DA。流式细胞仪检测，得活性氧检测结果。各组对H2O2诱导的H9c2细胞内活性氧的影响参见表4。

[0122] 表4各组对H2O2诱导的H9c2细胞内活性氧的影响

[0123] 分组 ROS含量百分率(％)空白对照组 36.63
模型组 100.0
阳性药槲皮素组(10μM) 18.69
OE(20μM) 20.55
OE(10μM) 28.26
OE(5μM) 54.12

[0124] 2.实验结论

[0125] 表4表明，与模型组相比较，OE在20μM、10μM、5μM时明显降低H2O2诱导的H9c2细胞内活性氧(ROS)含量。OE在20μM时降低H2O2诱导的H9c2细胞内活性氧(ROS)含量的作用与阳性药槲皮素组(10μM)降低H2O2诱导的H9c2细胞内活性氧(ROS)含量的作用相当。

[0126] 实施例6-激光共聚焦检测钙离子实验

[0127] 1.实验方法与结果

[0128] 取对数期的H9c2细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，加入6板，每孔2ml。细胞培养24h，使其完全贴壁，将OE(马齿苋酰胺E)母液用完全培养基稀释成5μM、10μM、
20μM，每个浓度设置3个副孔；设置空白对照组，另外设置模型组、阳性药槲皮素组(槲皮素的浓度为10μM)；在给药6h后，弃去培养液，每孔加入的2ml 50μM的H2O2刺激1h；37℃的恒温培养箱中孵育2h后，取出六孔板，去除细胞培养液，每孔加入500μL PBS清洗细胞三次；
Fluo-4AM母液，用PBS稀释至0.5～5μM的工作液；每孔加入1mL稀释后的Fluo-4AM工作液；37℃孵育30min；激光共聚焦显微镜下观察。各组干预的H2O2刺激后H9c2细胞钙离子荧光强度(40×)结果参见图5A～5F。

[0129] 2.实验结论

[0130] 与模型组相比较，OE可以降低细胞内的钙离子浓度，且随着OE剂量增加，OE降低钙离子浓度的效力增大。OE在20μM时降低细胞内的钙离子浓度的作用与阳性药槲皮素组(10μM)降低细胞内的钙离子浓度的作用相当。

[0131] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。