一种顺式四苯乙烯大环双季铵盐及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种顺式四苯乙烯大环双季铵盐及其制备方法与应用，属于生化检测技术领域。制备方法由顺式二氯亚甲基四苯乙烯冠醚或者顺式二溴亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺，在70℃‑100℃条件下加热4h‑20h，顺式二氯亚甲基四苯乙烯冠醚或者顺式二溴亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺发生亲核取代反应，蒸发除掉溶剂后重结晶得到。由于其结构为顺式环状，因此当两个季铵盐基团通过静电作用在DNA链上聚集后，不仅四苯乙烯单元苯环旋转受到限制，其双键在激发态下的旋转也受到阻碍，因而在检测DNA时表现出特别高的灵敏度，当DNA为具有30个碱基的DNA时，DNA检测的浓度最小为32pmol/L。

权利要求

1.具有如式I所示结构通式的化合物：

其中：m为0或1；X为氯或溴原子。

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法由顺式二氯亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺进行反应，或者由顺式二溴亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺进行反应。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将式II所示结构通式的化合物溶解于有机溶剂后，再加入三乙胺，充分混合后，在70℃-100℃条件下加热4h-20h，使所述式II所示结构通式的化合物与三乙胺发生亲核取代反应；蒸发除掉溶剂后重结晶，即得到式I所示结构通式的化合物；所述式II为： 其中m为0或1，X为氯原子或溴原子。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，式II所示结构通式的化合物的质量与三乙胺的体积比为0.01g/mL-2g/mL；所述三乙胺和有机溶剂的体积比为(0.5-5):(5-30)。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重结晶为用二氯甲烷和乙酸乙酯进行重结晶。

7.一种DNA浓度检测的试剂，其特征在于，含有权利要求1所述化合物。

8.如权利要求1所述的化合物用于DNA浓度检测的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，当所述DNA为具有30个碱基的DNA时，所述DNA浓度最小为32pmol/L。

说明书

一种顺式四苯乙烯大环双季铵盐及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生化检测技术领域，更具体地，涉及一种顺式四苯乙烯大环双季铵盐及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] DNA携带生物遗传密码，规范了生命体的繁衍过程和结果，基因的缺失和缺陷会带来重大疾病和生命体异常，因此对DNA检测具有非常重要意义。DNA的荧光检测是一种快速、简便和灵敏的方法，但传统的DNA荧光检测需要对核苷酸链进行标记，非常费时费力。为了克服这一难题，通过荧光试剂与DNA非共价键相互作用的非标记DNA荧光检测分析方法近年来受到了重视。

[0003] 在非标记DNA荧光检测分析方法中，基于聚集诱导发光(AIE)的荧光分析方法引起了广泛关注，因为它克服了传统荧光试剂荧光诱导淬灭的问题，能用于DNA荧光点亮的检测。一个AIE分子在溶液状态下没有荧光，聚集或者变成固体后能够发射强荧光，其机理是因为在聚集状态下分子内运动受到了限制(RIM)，非辐射发射通道被阻隔，所以在聚集后能发射荧光。这种AIE特性已被广泛的用于化学与生物传感器，AIE分子带上正离子后，可通过静电作用聚集到带磷酸根负离子的DNA链上，产生荧光，用于DNA检测，但检测极限一般在μM级别，灵敏度还有待提高(Chem.Soc.Rev.2018,47,7452-7476；Chem.Rev.2015,115,11718–11940.)。

发明内容

[0004] 本发明解决了现有技术中DNA浓度检测灵敏度不高的技术问题。本发明中的顺式-四苯乙烯大环双季铵盐在四苯乙烯顺式位有一个冠醚环，能使两个季铵盐基团处于顺式位置。本发明将具有聚集诱导发光(AIE)特性的顺式-四苯乙烯大环双季铵盐作为DNA检测的试剂，当两个季铵盐基团通过静电作用同时结合在DNA链上后，不仅四苯乙烯单元苯环旋转受到限制，其双键在激发态下的旋转也受到阻碍，因而在检测DNA时表现出特别高的灵敏度。

[0005] 根据本发明的第一方面，提供了一种具有如式I所示结构通式的化合物：

[0006]

[0007] 其中：m为0或1；X为氯或溴原子。

[0008] 按照本发明的另一方面，提供了所述的化合物的制备方法，所述制备方法由顺式二氯亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺进行反应，或者由顺式二溴亚甲基四苯乙烯冠醚与三乙胺进行反应。

[0009] 优选地，将式II所示结构通式的化合物溶解于有机溶剂后，再加入三乙胺，充分混合后，在70℃-100℃条件下加热4h-20h，使所述式II所示结构通式的化合物与三乙胺发生亲核取代反应；蒸发除掉溶剂后重结晶，即得到式I所示结构通式的化合物；所述式II为：其中m为0或1，X为氯原子或溴原子。

[0010] 优选地，式II所示结构通式的化合物的质量与三乙胺的体积比为0.01g/mL-2g/mL；所述三乙胺和有机溶剂的体积比为(0.5-5):(5-30)。

[0011] 优选地，所述有机溶剂为乙腈。

[0012] 优选地，所述重结晶为用二氯甲烷和乙酸乙酯进行重结晶。

[0013] 按照本发明的另一方面，提供了一种DNA浓度检测的试剂，含有所述化合物。

[0014] 按照本发明的另一方面，提供了所述的化合物用于DNA浓度检测的应用。

[0015] 优选地，当所述DNA为具有30个碱基的DNA时，所述DNA浓度最小为32pmol/L。

[0016] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

[0017] (1)本发明提供了一种用于高灵敏度DNA荧光检测的化合物及制备方法，化合物为具有聚集诱导发光(AIE)特性的顺式-四苯乙烯大环双季铵盐。由于在四苯乙烯顺式位有一个冠醚环，能使两个季铵盐基团处于顺式位置。当两个季铵盐基团通过静电作用同时结合在DNA链上后，不仅四苯乙烯单元苯环旋转受到限制，其双键在激发态下的旋转也受到阻碍，按照AIE分子内运动受阻机理，其荧光增强更多，因而在检测DNA时表现出特别高的灵敏度，当所述DNA为具有30个碱基的DNA时，所述DNA检测的浓度最小为32pmol/L。

[0018] (2)本发明中要求保护的化合物中的冠醚环结构是关键的结构，没有这个环的话，在光照下会变成反式，使检测灵敏度变低；另外，有了这个环，会进一步限制苯环的旋转，使荧光强度增加。

[0019] (3)本发明制备方法中三乙胺和有机溶剂的体积比优选为(0.5-5):(5-30)，在该比例条件下，不仅能保证原料的溶解，而且能使产物的产率高。

附图说明

[0020] 图1为实施例1制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)的1H-NMR谱。

[0021] 图2为实施例1制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)的13C-NMR谱。

[0022] 图3为实施例1制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)的高分辨质谱。

[0023] 图4为实施例4制备得到的化合物(m＝0，X＝Br)的1H-NMR谱。

[0024] 图5为实施例4制备得到的化合物(m＝0，X＝Br)的13C-NMR谱。

[0025] 图6为实施例4制备得到的化合物(m＝0，X＝Br)的高分辨质谱。

[0026] 图7为实施例1制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)用于DNA检测的荧光光谱随DNA浓度的变化。

[0027] 图8为实施例1制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)用于DNA检测的荧光强度随DNA浓度的变化。

[0028] 图9为实施例4制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)用于DNA检测的荧光光谱随DNA浓度的变化。

[0029] 图10为实施例4制备得到的化合物(m＝1，X＝Cl)用于DNA检测的荧光强度随DNA浓度的变化。

具体实施方式

[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0031] 本发明提供的用于高灵敏度DNA荧光检测的化合物具有以下式Ⅰ所示结构：

[0032]

[0033] 其中，在四苯乙烯单元顺式位连接有冠醚环，使两个季铵盐基团处于顺式位，有利于阻止双键在激发态下的旋转运动，增强荧光发射，提高DNA检测的灵敏度。

[0034] 一些实施例中：

[0035] m为0或1；

[0036] X为氯或溴原子。

[0037] 上述化合物可由如下路线合成：

[0038]

[0039] 将式II化合物(0.05g-1g)和乙腈(5mL-30mL)加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺(0.5mL-5mL)。在70-100℃下加热搅拌4h-20h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率60％-90％。

[0040] 结构确定：通过NMR，HRMS，IR，Mp，UV-Vis等测试手段确定结构。

[0041] 本发明提出的式I化合物可以由式II化合物与三乙胺反应而成。本发明提出的式I化合物可用于用于高灵敏度DNA的荧光检测。本发明在四苯乙烯单元顺式位连接有冠醚环，使两个季铵盐基团处于顺式位，有利于阻止双键在激发态下的旋转运动，增强荧光发射，提高DNA检测的灵敏度。当所述DNA为SEQ ID NO:1所示的具有30个碱基的DNA时，所述DNA浓度最小为32pmol/L或者0.29ng/mL。

[0042] 以下为具体实施例：

[0043] 实施例1

[0044] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝1；X＝Cl)的合成：

[0045]

[0046] 将式II化合物0.05g和乙腈5mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺0.5mL。在70℃下加热搅拌4h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于85％。

[0047] 式I化合物在CH3OD中的1H-NMR谱见图1，13C-NMR谱见图2，HRMS谱见图3。由图1、图2和图3可以得出，本实施例制备得到的是式I所示结构的化合物(m＝1；X＝Cl)。

[0048] 实施例2

[0049] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝1；X＝Cl)的合成：

[0050]

[0051] 将式II化合物0.2g和乙腈10mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺2mL。在80℃下加热搅拌10h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于85％。

[0052] 实施例3

[0053] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝1；X＝Cl)的合成：

[0054]

[0055] 将式II化合物0.5g和乙腈20mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺5mL。在100℃下加热搅拌20h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷和乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于85％。

[0056] 实施例4

[0057] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝0；X＝Br)的合成：

[0058]

[0059] 将式II化合物0.05g和乙腈5mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺0.5mL。在70℃下加热搅拌4h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于70％。

[0060] 式I化合物在CDCl3中的1H-NMR谱见图4，13C-NMR谱见图5，HRMS谱见图6。由图4、图5和图6可以得出，本实施例制备得到的是式I所示结构的化合物(m＝0；X＝Br)。

[0061] 实施例5

[0062] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝0；X＝Br)的合成：

[0063]

[0064] 将式II化合物0.2g和乙腈10mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺2mL。在90℃下加热搅拌12h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于70％。

[0065] 实施例6

[0066] DNA检测试剂I(在通式I中，m＝0；X＝Br)的合成：

[0067]

[0068] 将式II化合物0.5g和乙腈20mL加入到圆底烧瓶中，然后加入三乙胺5mL。在95℃下加热搅拌18h后，蒸发除掉溶剂，剩下固体用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶，得到式I所述化合物，产率大于70％。

[0069] 实施例7

[0070] 将实施例1制备得到的化合物(在通式I中，m＝1；X＝Cl)溶解在蒸馏水中，配成1.0×10-6M的溶液，然后逐渐加入鱼精DNA的蒸馏水溶液，使鱼精DNA的浓度从0M,1.0×10-9M,5.0×10-9M,1.0×10-8M,2.0×10-8M,5.0×10-8M,1.0×10-7M,2.0×10-7M,5.0×10-7M到1.0×10-6M逐渐加大，同时测定不同DNA浓度下式I化合物的荧光光谱，谱图见图7，由图7可知，随时DNA浓度的增大，荧光光谱逐渐增强。绘制式I化合物荧光强度随DNA浓度变化图，谱图见图8，在低浓度范围内为一直线，计算直线斜率。然后配制9个式I化合物浓度均为1.0×
10-6M、DNA浓度均为1.0×10-9M的溶液样品，测定每一个样品的荧光强度，计算标准偏差，其值为0.593。按照检测极限＝3×σ/k(σ,标准偏差；k,直线斜率)进行计算，得到鱼精DNA的检测极限为74pM或者1.5ng/mL。

[0071] 实施例8

[0072] 将实施例4制备得到的化合物(在通式I中，m＝0；X＝Br)溶解在蒸馏水中，配成1.0×10-6M的溶液，然后逐渐加入人工合成30nt DNA进行测试，序列为SEQ ID NO:1，的蒸馏水溶液，使30nt DNA的浓度从0M,1.0×10-9M,5.0×10-9M,1.0×10-8M,2.0×10-8M,5.0×10-8M,1.0×10-7M,2.0×10-7M,5.0×10-7M到1.0×10-6M逐渐加大，同时测定不同DNA浓度下式I化合物的荧光光谱，谱图见图9，由图9可知，随着人工合成DNA浓度的增大，荧光光谱逐渐增强。绘制式I化合物荧光强度随DNA浓度变化图，谱图见图10，在低浓度范围内为一直线，计算直线斜率。然后配制9个式I化合物浓度均为1.0×10-6M、DNA浓度均为1.0×10-9M的溶液样品，测定每一个样品的荧光强度，计算标准偏差，其值为0.584。按照检测极限＝3×σ/k(σ,标准偏差；k,直线斜率)进行计算，得到30nt DNA的检测极限为32pM或者0.29ng/mL。

[0073] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。