N-乙酰氨基葡萄糖的新用途

摘要

本发明提供N‑乙酰氨基葡萄糖的新用途，具体为N‑乙酰氨基葡萄糖用于制备酪酸梭菌生长增殖促进剂或用于促进酪酸梭菌适应不利环境的用途。能促进酪酸梭菌生长和增殖，在环境不利条件下，能促进酪酸梭菌生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。

权利要求

1.N-乙酰氨基葡萄糖用于促进酪酸梭菌适应低温有氧环境的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述低温有氧环境为4℃有氧环境。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在低温有氧条件下，N-乙酰氨基葡萄糖能促进酪酸梭菌生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。

4.一种促进酪酸梭菌适应低温有氧环境的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：将N-乙酰氨基葡萄糖添加到含有酪酸梭菌的培养物中，在低温有氧环境下进行培养。

5.如权利要求4所述的促进酪酸梭菌适应低温有氧环境的方法，其特征在于，所述低温有氧环境为4℃有氧环境。

6.如权利要求4所述的促进酪酸梭菌适应低温有氧环境的方法，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖在培养物当中的初始摩尔浓度为10μmol/L。

说明书

N-乙酰氨基葡萄糖的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学领域，具体涉及N-乙酰氨基葡萄糖的新用途。

背景技术

[0002] 20世纪40年代以来，抗生素的广泛使用拯救了无数的生命，但抗生素的耐药的发生以及它的副作用，已经引起了人们的重视。新的研究表明，抗生素可扰乱肠道内氧含量和纤维分解促进致病菌的生长繁殖，即低水平的丁酸与沙门氏菌之间具有关联。研究人员指出既往的研究表明，产丁酸微生物的水平较低可导致炎症性肠道疾病的发生。丁酸作为丁酸菌的主要产物，在丁酸菌的益生功能中发挥很大作用。上世纪50年代，德国人Rusch用健康人的肠道菌群治疗肠道疾病取得成功，并于1977年提出“微生态学”概念。机体“微生态失衡”容易导致疾病，而微生态平衡的重要维护者是益生菌。例如酪酸梭菌就是一种重要的益生菌。目前，临床上补充益生菌，调节肠道微生态的产丁酸菌主要是酪酸梭菌，酪酸梭菌作为益生菌已经广泛应用于医药、食品、保健等多种行业，有研究表明酪酸梭菌可以拮抗幽门螺杆菌，可以防治阿司匹林导致的胃溃疡，能促进乳酸菌等益生菌增殖，改善肠道微生态平衡。但是，酪酸梭菌也具有生长繁殖量低，体外培养难度大的特性。

发明内容

[0003] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供N-乙酰氨基葡萄糖的新用途。

[0004] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供N-乙酰氨基葡萄糖用于制备酪酸梭菌生长增殖促进剂或用于促进酪酸梭菌适应不利环境的用途。

[0005] 进一步的，用于制备酪酸梭菌生长增殖促进剂时，所述N-乙酰氨基葡萄糖为酪酸梭菌生长增殖促进剂的有效成分。

[0006] 在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖为酪酸梭菌生长增殖促进剂的唯一有效成分或有效成分中的一种。

[0007] 在一种实施方式中，用于制备酪酸梭菌生长增殖促进剂时，所述生长增殖促进剂在使用时，所述N-乙酰氨基葡萄糖在酪酸梭菌培养物中的初始摩尔浓度为10μmol/L-25mmol/L。

[0008] 可选的，N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔浓度可以为10μmol/L，100μmol/L，1mmol/L，5mmol/L，25mmol/L。

[0009] 在一种实施方式中，用于促进酪酸梭菌适应不利环境时，所述环境不利条件为有氧环境和4℃～37℃环境。

[0010] 在一种实施方式中，用于促进酪酸梭菌适应不利环境时，在环境不利条件下，N-乙酰氨基葡萄糖能促进酪酸梭菌生长增殖，或者生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。

[0011] 本发明第二方面，提供一种促进酪酸梭菌生长增殖的方法，将N-乙酰氨基葡萄糖添加到含有酪酸梭菌的培养物中，在适合酪酸梭菌生长的培养条件下进行培养。

[0012] 所述N-乙酰氨基葡萄糖在培养物当中的初始摩尔浓度为10μmol/L-25mmol/L。

[0013] 可选的，N-乙酰氨基葡萄糖的摩尔浓度可以为10μmol/L，100μmol/L，1mmol/L，5mmol/L，25mmol/L。

[0014] 在一种实施方式中，所述培养条件为厌氧条件。

[0015] 在一种实施方式中，所述培养条件为体外培养。

[0016] 在一种实施方式中，培养初始pH值为7.0-7.5

[0017] 可选的，培养初始pH值为7.0，7.4，7.5。

[0018] 在一种实施方式中，培养温度为37℃。

[0019] 在一种实施方式中，所述培养条件还含有酪酸梭菌生长增殖的必需物质，包括足够量的水，碳源，氮源，无机盐和生长因子。

[0020] 本发明第三方面，提供一种促进酪酸梭菌适应不利环境的方法，所述方法至少包括以下步骤：将N-乙酰氨基葡萄糖添加到含有酪酸梭菌的培养物中，在不利于酪酸梭菌生长的环境下进行培养。

[0021] 在一种实施方式中，所述不利于酪酸梭菌生长的环境为有氧环境和4℃～37℃环境。

[0022] 在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖在培养物当中的初始摩尔浓度为10μmol/L-25mmol/L。

[0023] 在一种实施方式中，所述培养可以是体外培养，或动物体内的培养。所述动物为哺乳动物，如啮齿类动物，灵长类动物。如大鼠，猴，人等。

[0024] 在不利环境下，N-乙酰氨基葡萄糖能促进酪酸梭菌生长增殖，或者生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。

[0025] 如上所述，本发明提供了N-乙酰氨基葡萄糖的新用途，具有以下有益效果：

[0026] 本发明首次发现N-乙酰氨基葡萄糖能用于促进酪酸梭菌生长和增殖，在环境不利条件下，能促进酪酸梭菌生长增殖，或者生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。拓展了N-乙酰氨基葡萄糖的应用领域。

附图说明

[0027] 图1显示为实施例1的1.2.1中空白对照组1酪酸梭菌在48h，出厌氧罐时的观察图。

[0028] 图2显示为实施例1的1.2.1中GlcNAc组1酪酸梭菌在48h，出厌氧罐时的观察图(GlcNAc浓度：10uM)

[0029] 图3显示为实施例1的1.2.1中空白对照组1酪酸梭菌4℃冰箱放置10天后的观察图。

[0030] 图4显示为实施例1的1.2.1中GlcNAc组1酪酸梭菌在4℃冰箱放置10天后的观察图(GlcNAc浓度：10uM)。

[0031] 图5显示为实施例1的1.2.2的细菌增殖情况。系列1为空白对照组2，系列2为葡萄糖对照组2，系列3为GlcNAc组2。横坐标依次表示1mM，5mM，10mM，20mM，25mM的情况(空白对照组2的横坐标不变)

[0032] 图6显示为实施例1的1.2.3的细菌增殖情况。系列1为空白对照组3，系列2为葡萄糖对照组3，系列3为GlcNAc组3。

[0033] 图7显示为实施例1的1.2.4的对照组4℃冰箱放15天后的生长情况。

[0034] 图8显示为实施例1的1.2.4的1uM GlcNAc组4℃冰箱15天后的生长情况。

[0035] 图9显示为实施例1的1.2.4的10uM GlcNAc组4℃冰箱15天后的生长情况。

具体实施方式

[0036] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

[0037] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

[0038] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

[0039] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。

[0040] 单位说明：M＝mol/L.

[0041] 实施例1

[0042] 本实施例用于说明N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)在体外对酪酸梭菌生长、增殖的影响以及GlcNAc在环境不利条件下对酪酸梭菌生长、生存的作用。

[0043] 1.1实验材料

[0044] 1.1.1菌种

[0045] 酪酸梭菌，来源于助宝康酪酸梭菌活菌制剂。

[0046] 1.1.2梭菌增殖培养基(RCM)

[0047] 酵母浸膏3g，牛肉浸膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，三水合乙酸钠3g，半胱氨酸盐酸盐0.15g，琼脂15g，蒸馏水1000毫升，调PH值7.4，121℃灭菌20分钟。

[0048] 1.1.3主要仪器设备

[0049] 电热恒温培养箱，厌氧培养罐，生物安全柜，奥林巴斯多功能显微镜，BX41，Olympus公司；

[0050] 1.2试验方法

[0051] 1.2.1低温有氧条件下芽孢生成率的变化

[0052] GlcNAc组1：在RCM液体培养基中加入超滤GlcNAc生理盐水溶液，使GlcNAc终浓度达到10uM。

[0053] 空白对照组1：等量RCM液体培养基中加入等量生理盐水。

[0054] 分别接种等量酪酸梭菌，观察实验组1和空白对照组1在：

[0055] (1)相同条件下厌氧培养48h后

[0056] (2)相同条件下厌氧培养后48h后在放置4℃冰箱10天后的芽孢生成率的变化。

[0057] 1.2.2无葡萄糖培养基细菌生长、增殖情况

[0058] GlcNAc组2：RCM培养基配方去掉葡萄糖，加入GlcNAc生理盐水溶液(无菌超滤后加入)，使之在培养基里的终浓度分别为1mM，5mM，10mM，20mM，25mM。

[0059] 葡萄糖(Glu)对照组2：RCM培养基配方去掉葡萄糖，加入Glu生理盐水溶液(无菌超滤后加入)，使之在培养基里的终浓度分别为1mM，5mM,10mM,20mM,25mM，Glu生理盐水溶液的体积与GlcNAc组的GlcNAc生理盐水溶液体积相同。

[0060] 空白对照组2：RCM培养基配方去掉葡萄糖为空白对照。加入一定体积的生理盐水，生理盐水的体积与GlcNAc组的GlcNAc生理盐水溶液体积相同。

[0061] 在生物安全柜中按5％的接种量无菌操作，接种酪酸梭菌入各组的液体培养基中，放入厌氧罐中，37℃培养箱厌氧培养48h后在660nm处检测其培养液的吸光度。以吸光度的变化来判定N-乙酰氨基葡萄糖对酪酸梭菌生长的促进作用。

[0062] 1.2.3无糖无蛋白质培养基细菌生长、增殖情况

[0063] GlcNAc组3：在RCM液体培养基的基础上，配方中去掉牛肉浸膏、葡萄糖、可溶性淀粉，在此基础上分别加入GlcNAc生理盐水溶液，使终浓度达到10mM。

[0064] 葡萄糖(Glu)对照组3：与实验组3等量同条件的RCM液体培养基(配方中去掉牛肉浸膏、葡萄糖、可溶性淀粉)，加入等量Glu生理盐水溶液，使终浓度达到10mM。

[0065] 空白对照组3：与实验组3等量同条件的RCM液体培养基(配方中去掉牛肉浸膏、葡萄糖、可溶性淀粉)，加入等量生理盐水。

[0066] 在生物安全柜中按5％的接种量无菌操作，接种酪酸梭菌入各组的液体培养基中，放入厌氧罐中，37℃培养箱厌氧培养48h。酪酸梭菌计数在660nm处检测其培养液的吸光度。观察细菌生长、增殖情况。

[0067] 1.2.4不同浓度的GlcNAc，低温有氧条件下对酪酸梭菌的影响

[0068] 分别配制含1uM、10uM的GlcNAc的RCM固体培养基平板，分别为1uM GlcNAc组，10uM GlcNAc组；以不含GlcNAc的RCM固体培养基平板为对照组4，涂布等量接种酪酸梭菌，37℃培养箱厌氧培养72h,然后放入4℃冰箱放置，将整个菌落制备成菌悬液，观察放入4℃冰箱前和放入后菌落和菌体形态的变化。

[0069] 2、结果

[0070] 在液体培养基培养48小时后，出厌氧罐时，计数芽孢生成率，空白对照组1和GlcNAc组1的芽孢生成率都是3％，(如图1，图2)，二组的细菌数量区别不大；放置4℃冰箱的有氧环境中，在GlcNAc组1液体培养基培养后的酪酸梭菌能继续生成芽孢，在10天内将芽胞生成率从3％提高到30％(图4)，而空白对照组1液体培养后的芽孢生成率未变(图3)。

[0071] 无葡萄糖培养基细菌生长、增殖情况实验证明，在无葡萄糖的条件下，GlcNAc组2的酪酸梭菌数量高于空白对照组2(p<0.05)，表明GlcNAc对酪酸梭菌生长增殖具有促进作用。(图5)。细菌总菌数计数结果皆取对数后比较。

[0072] 无糖无蛋白质培养基细菌生长、增殖情况的实验结果显示，在糖无蛋白质的条件下，GlcNAc组3的酪酸梭菌数量高于空白对照组3(p<0.05)，GlcNAc促进了酪酸梭菌生长增殖(图6)。

[0073] 不同浓度的GlcNAc，低温有氧条件下对酪酸梭菌的影响的实验结果显示，放冰箱前，各组菌体形态变化不大，放冰箱15天，对照组(图7)和1uM GlcNAc组(图8)变化不大，而含10uM的GlcNAc的平板，在涂片观察时发现生成了大量的潜生体(CGC)(图9)，表明10uM的GlcNAc促进了酪酸梭菌以潜生体方式生长和增殖。

[0074] 综上所述，本发明所述的酪酸梭菌生长增殖促进剂能促进酪酸梭菌生长和增殖，在环境不利条件下，能促进酪酸梭菌生成芽孢形式生存下来，或者以潜生体方式生长和增殖。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

[0075] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。