切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法

摘要

本发明公开了切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法。本发明提供的切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法采用CRISPR/Cas9系统进行，CRISPR/Cas9系统中包含名称分别为sgRNA1和sgRNA2的两个sgRNA，sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列；sgRNA2识别的靶序列为pXO2质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。本发明成功得到了不含有pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌，构建方法简单，切除效率高，且一次能筛选到三种不同质粒丢失表型的菌株，为构建新的疫苗株提供了更快捷、更方便新的手段，为炭疽芽胞杆菌的防治提供了新的思路。

权利要求

1.切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统切除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称分别为sgRNA1和sgRNA2的两个sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列；所述sgRNA2识别的靶序列为pXO2质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列；

将所述sgRNA1识别的靶序列记为靶序列1，所述靶序列1为序列表中序列3的第1-20位所示的DNA片段；

将所述sgRNA2识别的靶序列记为靶序列2，所述靶序列2为序列表中序列4的第1-20位所示的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA1的序列为将序列表中序列3中的T替换为U得到的RNA序列；

所述sgRNA2的序列为将序列表中序列4中的T替换为U得到的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1和所述sgRNA2的编码基因的表达盒，使所述sgRNA1和所述sgRNA2得到表达，得到切除pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统还包括Cas9蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中，使Cas9蛋白质得到表达。

6.成套sgRNA，由权利要求1或2中所述sgRNA1和所述sgRNA2组成。

7.成套生物材料，由名称分别为生物材料1和生物材料2的两种生物材料组成；

所述生物材料1为下述C1）至C4）中的任一种：C1）编码权利要求1或2中所述sgRNA1的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；

C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；

所述生物材料2为下述D1）至D4）中的任一种：D1）编码权利要求1或2中所述sgRNA2的核酸分子；

D2）含有D1）所述核酸分子的表达盒；

D3）含有D1）所述核酸分子的重组载体、或含有D2）所述表达盒的重组载体；

D4）含有D1）所述核酸分子的重组微生物、或含有D2）所述表达盒的重组微生物、或含有D3）所述重组载体的重组微生物。

8.成套产品，为下述X1）或X2）：

X1）成套产品，由权利要求6所述成套sgRNA与Cas9蛋白质组成；

X2）成套产品，由权利要求7所述成套生物材料和与Cas9蛋白质相关的生物材料组成；

所述与Cas9蛋白质相关的生物材料为下述E1）至E4）中的任一种：E1）编码Cas9蛋白质的核酸分子；

E2）含有E1）所述核酸分子的表达盒；

E3）含有E1）所述核酸分子的重组载体、或含有E2）所述表达盒的重组载体；

E4）含有E1）所述核酸分子的重组微生物、或含有E2）所述表达盒的重组微生物、或含有E3）所述重组载体的重组微生物。

9.权利要求1-5中任一所述方法，或权利要求6所述成套sgRNA，或权利要求7所述成套生物材料，或权利要求8所述成套产品的下述任一应用：Y1）在制备切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒产品中的应用；

Y2）在制备预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病疫苗和/或药物中的应用。

说明书

切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中，切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法。

背景技术

[0002] 炭疽芽胞杆菌(也称为炭疽芽胞杆菌)是一种革兰氏阳性、能形成芽胞的需氧杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高,造成极大经济损失，威胁生命安全。炭疽芽孢杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及它们的调控蛋白。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽芽胞杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽芽孢杆菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽芽胞杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建切除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽芽胞杆菌致病中的作用及与染色体的相关调控非常重要。

[0003] 早期去除细菌的大质粒可以使用化学试剂，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高温培养或紫外照射等方法。但是这些方法都有潜在的问题，第一是特异性差，即在驱除目的质粒的过程中可能驱除目的质粒以外的其他质粒，第二是可能在处理过程中宿主细胞产生随机突变的可能性。

[0004] CRISPR/Cas系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，被认为是原核生物防御外来噬茵体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统，该系统中的crRNA在一个反式激活crRNA(tracrRNA)的辅助下，募集效应蛋白(Cas蛋白)并把它们带到靶标DNA序列，Cas蛋白利用其核酸酶的功能切割外源DNA序列，引起DNA双链断裂(Double Strand Break,DSB)。目前该系统已经被广泛利用进行基因编辑。为了更方便简单的利用该系统，研究人员将II性CRISPR/Cas9系统中的crRNA-tracrRNA双链RNA复合体人工改造为一条嵌合的单链RNA，被称为单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，其5’端20nt(即为spacer序列，这里称为N20)的特异性的序列配对来靶向DNA位点，靶DNA序列3’末端的PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点，不能包含在sgRNA之中。应用的时候只需更换sgRNA的5’末端的N20序列就能够指导Cas蛋白切割目标DNA序列。2013年该系统率先应用到人类和小鼠胚胎干细胞的基因编辑中，目前已经成功应用到小鼠、猪、食蟹猴、斑马鱼、拟南芥、高粱、烟草、水稻、线虫、酵母、大肠杆菌等多种动植物和微生物中，成为生物学和医学各领域广泛应用的基因编辑工具。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何去除炭疽芽胞杆菌pXO1和pXO2质粒。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统切除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒，得到不含有pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称分别为sgRNA1和sgRNA2的两个sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列；所述sgRNA2识别的靶序列为pXO2质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。

[0007] 所述出发炭疽芽胞杆菌含有pXO1和pXO2质粒。

[0008] 在本发明的一个实施例中，所述出发炭疽芽胞杆菌为A16。

[0009] 将所述sgRNA1识别的靶序列记为靶序列1，所述靶序列1可为如下A1)、A2)或A3)：

[0010] A1)序列表中序列3的第1-20位所示的DNA片段；

[0011] A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA片段；

[0012] A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA片段。

[0013] 将所述sgRNA2识别的靶序列记为靶序列2，所述靶序列2可为如下B1)、B2)或B3)：

[0014] B1)序列表中序列4的第1-20位所示的DNA片段；

[0015] B2)与B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA片段；

[0016] B3)在严格条件下与B1)限定的DNA序列杂交的由B1)衍生的DNA片段。

[0017] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列3的第1-20位或序列4的第1-20位具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0018] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0019] 所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0020] 所述sgRNA1的序列可为将序列表中序列3中的T替换为U得到的RNA序列。

[0021] 所述sgRNA2的序列可为将序列表中序列4中的T替换为U得到的RNA序列。

[0022] 所述方法可包括向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1和所述sgRNA2的编码基因的表达盒，使所述sgRNA1和所述sgRNA2得到表达，得到切除pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌(即不含pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌)。

[0023] 向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒可通过将含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。

[0024] 向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA2的编码基因的表达盒可通过将含有所述sgRNA2的编码基因的表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。

[0025] 上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统还可包括Cas9蛋白质。Cas9蛋白质的序列可为序列表中序列2。

[0026] 上述方法还可包括将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中，使Cas9蛋白质得到表达。

[0027] 所述Cas9蛋白质的编码基因可为序列表中序列1所示的DNA分子。

[0028] 上述方法中，所述将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中可通过将含有所述表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。

[0029] 具体的，含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒和含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒可通过含有这两个表达盒的重组载体(记为重组载体1)导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。所述重组载体1具体可为pJO1T，所述pJO1T为向出发载体的多克隆位点间插入所述靶序列得到的能表达所述sgRNA1和Cas9蛋白质的重组载体。所述出发载体可为温敏型载体，如pJOE8999。

[0030] 含有所述sgRNA2的编码基因的表达盒和含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒可通过含有这两个表达盒的重组载体(记为重组载体2)导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。所述重组载体2具体可为pJO2T，所述pJO2T为向出发载体的多克隆位点间插入所述靶序列得到的能表达所述sgRNA2和Cas9蛋白质的重组载体。所述出发载体可为温敏型载体，如pJOE8999。

[0031] 所述方法还可包括在向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入所述重组载体1和所述重组载体2前对所述重组载体1和所述重组载体2进行去甲基化。所述去甲基化可通过将所述重组载体1或所述重组载体2导入大肠杆菌SCS110中实现。

[0032] 所述方法还可包括在切除pXO1和pXO2质粒后再切除所述重组载体1和所述重组载体2。

[0033] 所述切除所述重组载体1和所述重组载体2可将导入所述重组载体1和所述重组载体2且已切除pXO1和pXO2质粒后的重组炭疽芽胞杆菌在所述出发载体敏感的温度下进行培养，获得所述重组载体1和所述重组载体2以及pXO1和pXO2质粒均切除的目的炭疽芽胞杆菌。所述出发载体敏感的温度可为37-42℃。

[0034] 本发明还提供了一种成套sgRNA，所述成套sgRNA由所述sgRNA1和所述sgRNA2组成。

[0035] 所述成套sgRNA可用于切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒，也可用于制备切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒产品，还可用于制备预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病疫苗和/或药物，也可用于预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病。

[0036] 本发明还提供了一种成套生物材料，所述成套生物材料由名称分别为生物材料1和生物材料2的两种生物材料组成；

[0037] 所述生物材料1为下述C1)至C4)中的任一种：

[0038] C1)编码所述sgRNA1的核酸分子；

[0039] C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

[0040] C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

[0041] C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

[0042] 所述生物材料2为下述D1)至D4)中的任一种：

[0043] D1)编码所述sgRNA1的核酸分子；

[0044] D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

[0045] D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

[0046] D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。

[0047] 所述成套生物材料可用于切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒，也可用于制备切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒产品，还可用于制备预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病疫苗和/或药物，也可用于预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病。

[0048] 本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品为下述X1)或X2)：

[0049] X1)成套产品，由所述成套sgRNA与Cas9蛋白质组成；

[0050] X2)成套产品，由所述成套生物材料和与Cas9蛋白质相关的生物材料组成；所述与Cas9蛋白质相关的生物材料为下述E1)至E4)中的任一种：

[0051] E1)编码Cas9蛋白质的核酸分子；

[0052] E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；

[0053] E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；

[0054] E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物。

[0055] 所述成套产品可用于切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒，也可用于制备切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒产品，还可用于制备预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病疫苗和/或药物，也可用于预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病。

[0056] 所述切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和pXO2质粒的方法，或所述成套sgRNA，或所述成套生物材料，或所述成套产品的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

[0057] Y1)在切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒中的应用；

[0058] Y2)在制备切除炭疽芽胞杆菌中pXO1和/或pXO2质粒产品中的应用；

[0059] Y3)在制备预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病疫苗和/或药物中的应用；

[0060] Y4)在预防和/或治疗炭疽芽胞杆菌所致疾病中的应用。

[0061] 本发明采用CRISPR/Cas9系统进行炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2质粒的切除，成功得到了不含有pXO1和pXO2质粒的炭疽芽胞杆菌，本发明的方法具有以下优势：

[0062] 1.构建方法简单：只需要把一段特异性的N20寡核苷酸序列插入到骨架质粒pJOE8999中sgRNA的5’端就可以了，并不需要知道这段序列到底是什么功能；

[0063] 2.切除效率高：本发明的方法是利用sgRNA特异性的知道核酸酶Cas9切割靶标DNA，特异性好，切割效率高。诱导Cas9表达后，只需要转接1-2次就可以得到切除了目标质粒的菌株，并且从PCR鉴定的结果来看，至少50％以上的克隆一定丢掉了目标质粒，因而切割效率极高；

[0064] 3.本发明的方法把两个剪刀质粒等量混匀导入野生株中，能够根据不同的实验目的，一次筛选到三种不同质粒丢失表型的突变菌株。

[0065] 本发明为构建新的疫苗株提供了更快捷、更方便新的手段，为炭疽芽胞杆菌的防治提供了新的思路。

附图说明

[0066] 图1为骨架质粒pJOE8999图谱。

[0067] 图2为剪刀质粒pJO1T的PCR鉴定。M为DNA分子量标准。

[0068] 图3为剪刀质粒pJO2T的PCR鉴定。M为DNA分子量标准。

[0069] 图4为剪刀质粒转化大肠杆菌和炭疽杆菌PCR鉴定电泳图。剪刀质粒pJO1T和pJO2T分别转化大肠杆菌DH5α、SCS110(图A和图B)，等量混合质粒pJMix(pJO1T+pJO2T)转化炭疽芽胞杆菌A16(图C)，用骨架质粒pJOE8999上的一对特异引物pJOE8999-F/R进行PCR鉴定，初步确定剪刀质粒转化成功。

[0070] 图5为炭疽芽胞杆菌A16Mix(pXO1+pXO2+pJO1T+pJO2T+)中pXO1和pXO2切除情况的初步筛选PCR鉴定电泳图。M泳道为核酸分子量marker，A为pag基因扩增(pag-F/R)的结果，B为capA基因扩增(capA-F/R)的结果，1-12为挑选的12个A16Mix(pXO1+pXO2+pJO1T+pJO2T+)单克隆。

[0071] 图6为不同克隆切除大质粒情况PCR鉴定电泳图。M为核酸分子量marker，A克隆1，B为克隆7，C为克隆6。

[0072] 图7为PA的表达检测结果。M为蛋白marker。

[0073] 图8为菌体荚膜印度墨汁染色光学显微镜(100倍)观察结果。A图为A16MD1p，B图为A16MD2p，C图为A16MDDp。

[0074] 图9为外源“剪刀质粒”从炭疽芽胞杆菌中切除的PCR鉴定电泳图。

具体实施方式

[0075] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

[0076] 实施例1、利用CRISPR/Cas9系统切除炭疽芽胞杆菌pXO1质粒及pXO2质粒[0077] 1.含CRISPR/Cas9系统及靶标序列的质粒(“剪刀质粒”)构建

[0078] 1.1 pXO1质粒及pXO2质粒靶标序列(N20)序列设计

[0079] 以炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO1(GenBank accession no.AF065404)上的一段序列(ORF16)为目标序列，以炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO2(GenBank accession NO.NC_007323)上的一段序列(GBAA_pXO2_0038)为目标序列，使用软件sgRNAcas9_V3.0_GUI(或其他软件)设计sgRNA中的N20特异靶标序列，将pXO1上的靶标序列记为O1T(序列表中序列3的第1-20位)，将pXO2上的靶标序列记为O2T(序列表中序列4的第1-20位)，其序列如表1所示。
这两段靶标序列与炭疽芽胞杆菌Ames的染色体序列(GenBank accession NO.NC_003997)进行比对，这两段靶标序列在染色体上不存在。

[0080] 1.2构建切割pXO1和pXO2的外源“剪刀质粒”

[0081] 1.2.1将O1T插入温度敏感型穿梭质粒pJOE8999(7.8Kb)(Josef Altenbuchner.Editing of the Bacillus subtilis Genome by the CRISPR-Cas9System[J].Applied and Environmental Microbiology,2016,82(17):5421-5427.)(见图1)两个Bsal位点间，将得到的序列正确的重组质粒命名为pJO1T，pJOE8999含有Cas9的编码基因的表达盒，Cas9的编码基因序列为序列表中序列1，能编码序列2所示的Cas9。步骤如下：

[0082] (1)合成N20寡核苷酸：分别在O1T序列和O1T反向互补序列的两端加上4nt突出接头(TACG；AAAC)，合成寡核苷酸(见表1)：

[0083] Forward OT1(FOT1):5′-TACG ATAACTTGTAATAGCCCTTT-3′；

[0084] Reverse OT1(ROT1):5′-AAAC AAAGGGCTATTACAAGTTAT-3′。

[0085] (2)双链N20获得：FOT1和ROT1先退火融合，得到双链N20(含两个突出接头)。

[0086] (3)骨架质粒线性化：利用BsaⅠ酶切pJOE8999，回收载体骨架(即线性化质粒)。

[0087] (4)双链N20与线性化质粒载体连接：连接步骤(2)得到的双链N20与步骤(3)得到的载体骨架，得到连接产物。

[0088] (5)重组质粒的筛选与鉴定：将步骤(4)的连接产物化转DH5α，蓝白斑筛选(涂4μL IPTG，40μL X-gal)，挑选白斑，使用pJOE8999上的一对特异引物(spacer_F/R，见表1)进行PCR鉴定，利用pJOE8999作为对照。结果显示O1T成功的插入到了骨架质粒pJOE8999中(图2)，这个重组质粒经过商业公司测序，再次确认重组质粒构建成功，序列正确，此重组质粒记为pJO1T，即为切除pXO1的“剪刀质粒”。pJO1T为将pJOE8999的两个BsaⅠ识别序列间的DNA片段替换为O1T得到的重组质粒，pJO1T含有序列表中序列3所示的DNA片段，该DNA片段能转录靶向O1T的sgRNA(记为sgRNA1)。

[0089] 1.2.2按照步骤1.2.1的方法，将O1T替换为O2T，其他步骤均不变，得到含有O2T的重组质粒pJO2T，即为切除pXO2的“剪刀质粒”。使用pJOE8999上的一对特异引物(spacer_F/R，见表1)进行PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，相关序列见表1。结果显示O2T成功的插入到了骨架质粒pJOE8999中。pJO2T为将pJOE8999的两个BsaⅠ识别序列间的DNA片段替换为O2T得到的重组质粒，pJO2T含有序列表中序列4所示的DNA片段，该DNA片段能转录靶向O2T的sgRNA(记为sgRNA2)。

[0090] 所用N20寡核苷酸如下(见表1)：

[0091] Forward OT2(FOT2):5′-TACG ACACAAAGTGATAGCCTAGA-3′；

[0092] Reverse OT2(ROT2):5′-AAAC TCTAGGCTATCACTTTGTGT-3′。

[0093] 2.炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO1/pXO2的切除

[0094] 2.1转化：将步骤1构建正确的“剪刀质粒”pJO1T和pJO2T在导入炭疽芽胞杆菌之前要先转入大肠杆菌SCS110(北京全式金生物技术有限公司)去甲基化，再分别将其电转入炭疽芽胞杆菌感受态细胞中。

[0095] pJO1T和pJO2T分别化转SCS110：将剪刀质粒pJO1T和pJO2T的溶液各5μL分别加到50μL的大肠杆菌SCS110化学感受态细胞中，混匀后冰浴30min，热击90s后再冰浴2min，然后加入适量LB液体培养基，置于30℃摇床复苏1h，取150μL涂布含卡那霉素(Kan，25μg/ml)的LB琼脂平板，放置30℃培养箱中培养过夜。牙签挑取单克隆制成菌悬液作模板，以pJOE8999上特异引物对pJOE8999-F/R进行PCR验证(见表1)，确认剪刀质粒已化转到SCS110(图4)，将得到的含有pJO1T的重组菌记为SCS110-pJO1T，将得到的含有pJO2T的重组菌记为SCS110-pJO2T。

[0096] 将剪刀质粒pJO1T和pJO2T的等量混合后电转入炭疽芽胞杆菌野生株A16(含有pXO1和pXO2，A16(pXO1+pXO2+))：分别从SCS110-pJO1T和SCS110-pJO2T提取pJO1T和pJO2T，取提取的剪刀质粒pJO1T和pJO2T等质量混合，上下颠倒摇匀，得到混合剪刀质粒，取5μL混合剪刀质粒(pJO1T+pJO2T，在以后的描述中简称pJMix)加入到40μL的炭疽芽胞杆菌A16感受态细胞中(感受态细胞的制备，参照文献：高美琴,刘先凯,冯尔玲,唐恒明,朱力,陈福生,王恒樑.炭疽芽胞杆菌A16R株eag基因缺失突变株构建.微生物学报,2009,49(1):23-31.)，冰浴2min，电击(条件：电压，0.6kv；电阻，500；电容，25μF；所用电击仪为：产自美国的Bio-RAD GenePulserⅡelectroporator；电击杯为0.1cm。)，加入电转复苏液1mL，置于30℃摇床复苏3h，涂含有Kan(25μg/ml)抗性的LB固体平板，放置30℃培养箱中培养，次日长出明显的单克隆。牙签挑取其中4个单克隆分别制成菌悬液作模板，以pJOE8999特异引物pJOE8999-F/R进行PCR验证(见表1)，确认剪刀质粒已化转到炭疽芽胞杆菌中(图4)。阳性克隆用引物对Spacer-F/R进行测序(见表1)，确认两个剪刀质粒均正确转化到炭疽芽胞杆菌中，将含有两个剪刀质粒的阳性克隆记为A16Mix(pXO1+pXO2+pJO1T+pJO2T+)(简称为A16Mix)。

[0097] 2.2筛选过程：

[0098] 2.2.1诱导Cas9表达：挑取步骤2.1的A16Mix(pXO1+pXO2+pJO1T+pJO2T+)单克隆接种到5ml LB液体培养基(含25μg/ml Kan)30℃ 220rpm摇床培养3小时，加0.4％的甘露糖转25℃ 220rpm摇床诱导培养10小时，1％接菌量转接5ml LB液体培养基传代，相同条件再诱导1代，得到培养液。

[0099] 2.2.2PCR验证毒力大质粒丢失情况：将步骤2.2.1得到的培养液稀释105倍涂LB平板(含25μg/ml Kan)，然后将平板放置在30℃培养箱中培养，大约1天长出明显的克隆。牙签挑取单克隆，PCR鉴定不同克隆的大质粒切除情况，包括pXO1切除、pXO2切除、两个质粒(pXO1和pXO2)同时切除三种情况。

[0100] (1)初步筛选

[0101] 使用炭疽芽胞杆菌pXO1上的一个特异基因(保护性抗原pag)，pXO2上的一个特异基因(荚膜编码基因capA)为靶标进行PCR初步筛选，初步筛选验证不同克隆中pXO1、pXO2及双质粒(pXO1pXO2)同时切除的克隆。挑选了12个克隆，使用两对引物pag-F/R，capA-F/R进行PCR验证(见表1)，结果显示克隆1-5没有pag基因的扩增条带，表明这个克隆的pXO1可能切除，克隆7-11没有capA基因的扩增条带，表明这个克隆的pXO2可能切除，克隆6、12中pag基因和capA基因都没有扩增条带，表明这个克隆的pXO1和pXO2两个质粒可能同时切除了(图5)

[0102] (2)采用多基因PCR扩增对不同克隆切除大质粒情况确认

[0103] 分别挑选1个可能切除了pXO1的炭疽芽胞杆菌(即步骤(1)中的克隆1，A)、1个可能切除了pXO2的炭疽芽胞杆菌(即步骤(1)中的克隆7，B)，1个可能同时切除了两个质粒(pXO1和pXO2)的炭疽芽胞杆菌(即步骤(1)中的克隆6，C)，使用位于pXO1上的5对特异的引物和位于pXO2上的5对特异的引物(见表2)，对这3个克隆进一步验证确认。

[0104] 所用位于pXO1上的5对特异的引物如下：pXO1-70F和pXO1-70R，pXO1-90F和pXO1-90R，pXO1-95F和pXO1-95R，pXO1-98F和pXO1-98R，pXO1-116F和pXO1-116R。

[0105] 所用位于pXO2上的5对特异的引物如下：pXO2-89F和pXO2-89R，pXO2-94F和pXO2-94R，pXO2-97F和pXO2-97R，pXO2-107F和pXO2-107R，pXO2-111F和pXO2-111R。结果显示，所有位于pXO1上的特异引物在克隆1中都没有PCR扩增到特异条带(图6)，表明这个克隆的pXO1已经被切除，命名这个克隆为A16MD1p(pXO1-pXO2+pJMix+)(简称为A16MD1p)(见表2)。

[0106] 所有位于pXO2上的特异引物在克隆7中都没有PCR扩增到特异条带(图6)，表明这+ - +个克隆的pXO2已经被切除，命名这个克隆为A16MD2p(pXO1pXO2pJMix)(简称为A16MD2p)(见表2)。

[0107] 所有位于pXO1和pXO2上的特异引物在克隆6中都没有PCR扩增到特异条带(图6)，表明这个克隆的pXO1和pXO2已经被同时切除，命名这个克隆为A16MDDp(pXO1-pXO2-pJMix+)(简称为A16MDDp)(见表2)。

[0108] 2.2.3表型鉴定：

[0109] (1)Western blot分析确认PA在炭疽芽胞杆菌A16MD1p和A16MDDp中表达[0110] 把A16MD1p(pXO1-pXO2+pJMix+)、A16MD2p(pXO1+pXO2-pJMix+)和A16MDDp(pXO1-pXO2-pJMix+)接种到固体LB培养基，放置到CO2培养箱37℃培养13h。用接种环刮下菌苔，加入到2ml震荡管(加有玻璃珠)中，配制尿素裂解液(该溶液为向8M尿素水溶液中加入1％DTT，现配现用)，向振荡管中加入尿素裂解液200μl混匀。然后在均质器5500震荡10-15次，16℃，1300rpm离心20min，收集上清(即蛋白溶液)并分装，-80℃冻存。取40μl蛋白溶液，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min使蛋白变性。取12％的预制胶，按照蛋白Marker(北京全式金生物技术有限公司)、A16MD1p、A16MD2p和A16MDDp的顺序每孔上样10μl，重复上样两份，进行SDS-PAGE蛋白电泳。蛋白质电泳结束后，一份用来考马斯亮兰染色，另外一份分别利用PA抗体作为一抗进行Western blot分析，所用PA抗体为兔多克隆抗体(abcam公司，http://www.abcom.cn，ab21268)，二抗为HRP标记的山羊抗兔。

[0111] 考马斯亮兰染色的结果利用扫描仪扫描图像，Western blot分析的结果使用低温凝胶成像仪照相。结果显示，A16MD2p有PA(83kDa)表达，切除pXO1后的A16MD1p和A16MDDp无PA表达(图7)。

[0112] (2)印度墨汁染色确认炭疽芽胞杆菌A16MD2p和A16MDDp无荚膜结构

[0113] 一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察- + + + - +分辨。荚膜染色的步骤：将A16MD1p(pXO1 pXO2 pJMix )、A16MD2p(pXO1 pXO2 pJMix )和A16MDDp(pXO1-pXO2-pJMix+)接种到LB固体培养基(含8‰NaHCO3,5％马血清)，放置到通5％CO2的恒温培养箱37℃培养48h左右，挑取炭疽芽胞杆菌制成菌悬液，加1滴墨汁充分混匀，然后在载玻片上滴加一滴，盖上盖玻片压紧，使用擦镜纸擦掉多余溶液即可镜检。100倍镜检结果，背景灰黑色，菌体较暗，有荚膜的单质粒切除株A16MD1p，其菌体外有一层无色透明圈(图8中A)，无荚膜的单质粒切除株A16MD2p和双质粒切除株A16MDDp其菌体外没有无色透明圈(图8中B、C)。表明，A16MD1p含有pJO2T，A16MD2p和A16MDDp均不含有pJO2T。

[0114] 3.把外源“剪刀质粒”pJMix从炭疽芽胞杆菌中切除的过程

[0115] 因为本发明构建的外源“剪刀质粒”pJMix为温敏性质粒，在37-42℃下丢失，而37℃为炭疽芽胞杆菌的最佳生长温度，为了避免炭疽芽胞杆菌在过高的温度生长传代，所以选择在37℃丢外源重组质粒。步骤如下：

[0116] 挑取步骤2得到的A16MD1p、A16MD2p或A16MDDp的单克隆接5mL无抗性LB液体培养基在37℃的摇床上培养10-12h，然后按1％转接到另一5mL无抗性LB液体培养中于37℃摇床上培养12h，反复按1％转接3次后，对菌液进行梯度稀释，取104、105倍的两个稀释度的菌液，涂布无抗平板。放置在30℃培养箱中培养，次日挑取平板上的单克隆进行点板，每一个单克隆分别点板于LB无抗板和LB(含25μg/ml Kan)琼脂平板，将点板后的平板置30℃培养箱中培养。次日，挑取在无抗性平板上生长而在Kan(含25μg/ml Kan)抗性琼脂平板上不生长的单克隆进行菌落PCR鉴定和Kan抗性试管转接培养(30℃摇床培养)，确定其在Kan抗性试管中不长，由此选出阳性克隆。对选出的阳性克隆接种于无抗性试管培养，然后提取它的基因组，使用载体质粒上的特异引物pJOE8999-F/R(见表1)进行PCR，鉴定外源重组质粒的被驱除情况，利用pJOE8999作为阳性对照。

[0117] 结果显示A16MD1p、A16MD2p和A16MDDp都没有PCR特异扩增条带，表明这些克隆的外源剪刀质粒已经丢失(图9)。至此，得到了pXO1切除、pXO2切除和双质粒切除，又不含外源质粒的突变株，分别命名为A16MD1(pXO2+)(简称为A16MD1)、A16MD2(pXO1+)(简称为A16MD2)和A16MDD。

[0118] 表1.本发明使用的寡核苷酸序列及引物

[0119]

[0120]

[0121] 表2.本发明得到的菌株及特性

[0122]

[0123]

[0124] 注：表2中，“-”表示不含有相应的质粒，“+”表示含有相应的质粒。