一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法

摘要

本发明涉及一种用于监测沉积物速效磷负荷污染的特异性引物，主要针对河流、湖泊等沉积物磷素累积引起水体富营养化进行风险预判。本发明的步骤如下：根据对河湖底泥中速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属设计特异性引物：5'‑GCTCACCAAGCCGAAGATG‑3'，与16s通用引物806R 5'‑GGACTACHVGGGTWTCTAAT‑3'配对使用能够从各类沉积物样品DNA中直接扩增出长度大约为534bp的不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段，根据环境样品目的片段拷贝数的相对丰度评价沉积物磷素累积引起水体富营养化风险。本发明是基于生态学统计方法和分子生物学方法，克服传统指标评价和生物培养的局限性，能够从混合DNA样品中直接扩增出速效磷敏感指示菌靶标序列进行综合评价。

权利要求

1.一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，其特征在于，根据对河湖底泥中速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属设计特异性引物为：5 '-GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'，与16s通用引物806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'配对使用从各类沉积物DNA中直接扩增出长度为534bp的不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段，利用引物扩增目的片段相对丰度与速效磷负荷呈线性正相关的特点，指示沉积物速效磷负荷。

2.根据权利要求1所述利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，其特征在于，所述沉积物为江、河和湖底泥沉积物中的一种或者多种。

3.根据权利要求1所述利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，其特征在于，所述5'-GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'为正向引物，5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'为反向引物。

4.根据权利要求1所述利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，其特征在于，所述特异性引物针对不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段进行扩增。

说明书

一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法

技术领域

[0001] 本发明属于环境污染监测技术领域，特别涉及一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，可用于沉积物样品速效磷敏感指示菌靶标序列扩增。

背景技术

[0002] 河湖沉积物的内源污染是影响水体水质的主要因素，当上覆水体污染物浓度发生变化或湖泊底泥受到扰动时，积累在底泥中的污染物又会再次向水体释放，造成“二次污染”。底泥中速效磷含量往往响应水体中磷素含量，间接表征水体富营养化程度。浮霉菌门(Planctomycetes)菌属普遍存在于海水、半咸水、淡水等，它们的生长需求往往与水体中藻类互利。目前，已分离的浮霉菌属(Planctomyces)和小梨形菌属(Pirellula)等都是专性好氧菌，在浮霉菌门中还有许多和浮霉菌属等关系较远的细菌，如Candidatus Brocadia、 Candidatus Kuenenia属等，它们至今未能成功分离得到纯菌株，并尚未获得正式命名和分类，其中Pla3目下存在较多不可培养菌属，且普遍存在于底泥样品中，统计不同底泥样品Illumina测序结果发现，这些菌属的相对丰度与速效磷含量存在正相关性。对于水体富营养化普遍基于水体磷等营养物质含量、通过观察藻类及其他浮游生物迅速繁殖情况进行评估，但这些手段往往不能预判磷素累积趋势，因此，挖掘对磷素变化的敏感的浮霉菌门Pla3目种属生物指示剂可起到改善水体富营养化评估的预判能力。

[0003] 传统生物指示菌的分离主要是依赖选择性培养基分离培养的经典生物学方法，但该法分离周期长，工作量大且不易获得目的功能菌，这使浮霉菌门 Pla3目不可培养菌属的分离和丰度计量大大提升，也降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。随着分子生物学的飞速发展，基于PCR的分子检测技术已在环境微生物研究中应用越来越普遍。通过对菌株进行DNA提取，使用细菌16s rDNA通用引物338F/806R扩增目的片段，测序可得知其基因序列，但该法的特异性不强，特别是多种菌共存的混合DNA样品，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出浮霉菌门Pla3目种属可变区域部分序列，进而难以利用生物指示剂预判底泥速效磷累积和水体富营养化。

发明内容

[0004] 为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，根据对河湖底泥中速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属设计特异性引物从各类沉积物样品DNA中直接扩增出长度大约为534bp的不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段，根据环境样品目的片段拷贝数的相对丰度评价沉积物磷素累积引起水体富营养化风险，对河流、湖泊等沉积物磷素累积引起水体富营养化进行风险预判。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0006] 一种利用特异性引物监测沉积物速效磷负荷污染的方法，根据对河湖底泥中速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属设计特异性引物为：5'- GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'，与16s通用引物806R 5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'配对使用从各类沉积物DNA中直接扩增出长度为534bp的不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段，利用引物扩增目的片段相对丰度与速效磷负荷呈线性正相关的特点，指示沉积物速效磷负荷，并评价沉积物磷素累积引起水体富营养化风险。

[0007] 所述沉积物为江、河和湖底泥沉积物中的一种或者多种。

[0008] 所述5'-GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'为正向引物，5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'为反向引物。

[0009] 所述特异性引物针对不可培养浮霉菌门Pla3目菌属目的片段进行扩增。

[0010] 本发明所述5'-GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'是使用过Primer5软件根据浮霉菌门Pla3目NCBI数据库中序列信息综合设计的。

[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0012] 本发明的方法可以解决目前缺乏引物从混合DNA样品中直接扩增出具有速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属16s rDNA可变区区域部分序列的问题，可利用高敏感指示微生物对底泥源引起的水体富营养化进行准确预判。

附图说明

[0013] 图1为Pla3F/806R引物对3种底泥样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。

[0014] 图2为3种底泥样品速效磷含量与PCR产物相对丰度回归分析。

具体实施方式

[0015] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，以下描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。

[0016] 实施例：以特异性引物5'-GCTCACCAAGCCGAAGATG-3'(命名为Pla3F) 为正向引物，5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'为反向引物(通用引物中的 806R)为反向引物配对使用，可从底泥样品DNA中直接扩增出长度大约为534 bp的速效磷变化敏感的浮霉菌门Pla3目种属目的基因片段，预判样品中速效磷累积。

[0017] 具体操作步骤如下：

[0018] 选取不同河流中3处采样点底泥进行采样，提取DNA进行PCR扩增试验。PCR扩增体系为25μL，包括以下成分0.5μL DNA模板(从底泥样品提取的总DNA样品约10ng)、2.5μL正向引物Pla3F(10pM)、2.5μL反向引物 806R(10pM)、2.5μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、2.0μL dNTP s(2.5mmol/L)、 0.1μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，灭菌双蒸水补足25μL。

[0019] PCR扩增反应条件为：预变性95℃ 5min，变性94℃ 1min，退火56℃ 50s，延伸72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，图1 中M泳道为标准DL2000，1-3号泳道分别为底泥样品DNA的扩增结果，0 号泳道为空白对照的扩增结果。可以看出本实施方式采用的特异性引物 Pla3F/806R能够准确的从所有底泥样品DNA中扩增出浮霉菌门Pla3目种属的靶标序列片段，而空白对照中不会产生干扰条带。随机挑选对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞测序，测序结果为：序列长度为534bp，并且经blast分析，为Uncultured planctomycete PLA3序列。

[0020] 通过QuantityOne软件对目标条带相对丰度进行数值转化，底泥样品1-3 目标条带相对丰度(强度)分别为180、247、253，通过直接测定样品速效磷含量，结果发现底泥样品1-3速效磷含量分别为35.4mg/kg、48.6mg/kg和51.1mg/kg。性拟合结果如图2所示，底泥样品速效磷含量与Pla3F/806R特异性引物PCR产物相对丰度呈现较好相关性，R2大于0.99.[0021] 由该实施例可以看出，通过本发明设计的特异性引物Pla3F/806R能够准确的从底泥样品混合DNA中扩增出浮霉菌门Pla3目种属的靶标序列片段并根据相对丰度指示底泥速效磷变化，综合预判水体富营养化风险。

[0022] 。