一种黄连素衍生物NBD-125及其应用

摘要

一种黄连素衍生物NBD‑125及其应用，涉及人工改造的黄连素全新衍生物。所述黄连素衍生物NBD‑125可在制备抗肿瘤药物中应用。所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌等。通过对黄连素进行改造，获得的黄连素衍生物NBD‑125在RXRα的转录激活活性、溶解度、结肠癌细胞抑制活性三方面均优于黄连素。与黄连素相比，NBD‑125在DMSO中的溶解度是黄连素的10.66倍；在水中的溶解度是黄连素的6倍。与黄连素相比，50μM浓度条件下，NBD‑125在结肠癌细胞KM12C细胞中视黄醇受体RXRα转录激活活性是同等条件黄连素的2.7～2.8倍，NBD‑125对结肠癌细胞KM12C细胞增殖抑制能力均优于黄连素。

权利要求

1.黄连素衍生物NBD-125，其特征在于其化学结构式如下：简称为B125。

2.如权利要求1所述黄连素衍生物NBD-125在制备抗肿瘤药物中应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌。

说明书

一种黄连素衍生物NBD-125及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种人工改造的黄连素全新衍生物，尤其是涉及为了获得一种与黄连素相比，视黄醇受体RXRα转录激活活性更高、抗肿瘤活性更优、溶解度更好的一种黄连素衍生物NBD-125及其应用(黄连素衍生物命名为NBD-125)。

[0002] 说明：本发明所有用图中，B125是化合物NBD-125的简称，Ber是黄连素的简称。

背景技术

[0003] 黄连素(Berberine，BBR)，又称小檗碱，是从黄连、黄柏等药用植物中提取的一种季胺型异喹啉类生物碱，其游离碱型(氢氧化小檗碱)不稳定，在植物中以盐的形式存在。它具有广谱抗菌作用，对多种革兰阳性和阴性细菌有抑制作用，19世纪初，已被确认并药用，主要用于胃肠炎、细菌性痢疾。另外，黄连素可以治疗糖尿病和心血管疾病，具有确切的降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、抗过氧化、抗高血压等作用。近年来，黄连素的抗肿瘤活性也越来越引起重视。

[0004] 尽管黄连素由于其自身的来源天然、药理学功能广泛、安全性高等优点，使其在现在流行的抗癌药物中显得非常罕见，掀起了国际上研究黄连素的热潮，但其具体的作用分子机制还未完全清楚。另外，黄连素本身有一些药学和化学弱点，比如，第一，黄连素水溶性及脂溶性都很小，故口服吸收利用度比较低导致其效率差[1-2]，这是因为，从结构上看，黄连素作为一种常见的异喹啉生物碱，具有异喹啉并二氢异喹啉四环结构，分子内存在一个季铵盐单元以及两个烷氧基取代的苯环，从三维结构来看，黄连素是个近似平面的结构，芳环π体系的堆积作用一定程度上导致其在水中和有机溶剂中的溶解性都不好；第二，黄连素的主体活性成分小檗碱本身对内脏没有伤害，但目前临床应用的只有盐酸小檗碱这一种形式，其成盐的搭档氯离子存在一些不良影响和潜在风险(盐酸小檗碱进入胃肠后水解产生的盐酸刺激肠胃，会引起肠胃不适[3-5])；最后，由于黄连素通常用于治疗腹泻和胃肠炎，服用剂量小、时间短，不良反应很难发现，若需长期服用，就必须考虑它的成盐搭档氯离子在体内过度累积可能带来的伤害。

[0005] 自上个世纪70年代至今，大量药物学家尝试对黄连素进行结构改造。目前，旨在提高黄连素抑癌活性的研究主要集中在增强黄连素与DNA结合能力，比如，在C9-O位置引入各种多种不同类型基团可显著提高黄连素与DNA的结合能力。然而，大部分研究并没有进一步检测这些衍生物的抗肿瘤活性。张万金等人发现，在C9-O位置引入侧链可以显著增强黄连素与DNA的结合能力，然而，这些衍生物并不能增强黄连素的抗肿瘤作用[6]。因此，旨在提高黄连素抑癌活性的结构改造可能并不适合以其与DNA的结合能力作为改造的判据。在另一研究中，在C9-O位置引入亲脂性基团可以将黄连素体外抑制肿瘤细胞生长的能力提高104倍，推测可能与其对细胞膜的亲和力增强有关，但这也将造成黄连素更差的水溶性和生物利用度，不利于黄连素在体内发挥抑癌作用。

[0006] 总之，由于黄连素的分子靶点不清楚，目前的改造比较盲目和随机，特别是在抗肿瘤活性方面的改造并未取得较好的进展。因此，只有找到黄连素的直接靶点，才能对黄连素进行理性而高效的设计、改造以及系统性的验证。

[0007] 参考文献：

[0008] [1]Xin  HW,Wu XC,Li Q,et al.The effects  of berberine on the pharmacokinetics of cyclosporin A in healthy volunteers[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2006,28(1):25-29.

[0009] [2]Qiu W,Jiang XH,Liu CX,Ju,et al.Effect of berberine on the pharmacokinetics of substrates of CYP3A and P-gp[J].Phytother Res,2009,23(11):1553-1558.

[0010] [3]Cannillo M,Frea S,Fornengo C,et al.Berberine behind the thriller of marked symptomatic bradycardia[J].World J Cardiol,2013,5(7):261-264.[0011] [4]Sheng WD,Jiddawi MS,Hong XQ,et al.Treatment of chloroquine-resistant malaria using pyrimethamine in combination with berberine,tetracycline or cotrimoxazole[J].East Afr Med J,1997,74(5):283-284.

[0012] [5]Peng WH,Hsieh MT,Wu CR.Effect of long-term administration of berberine on scopolamine-induced amnesia in rats[J].Jpn J Pharmacol,1997,74(3):261-266.

[0013] [6]张万金.小檗碱衍生物的设计合成及其抗肿瘤和菌活性研究[D].广东中山大学,[博士论文],2007.

发明内容

[0014] 本发明的目的在于提供一种新的黄连素衍生物NBD-125。

[0015] 本发明的另一目的在于提供黄连素衍生物NBD-125的应用。

[0016] 所述黄连素衍生物NBD-125的化学结构式如下：

[0017]

[0018] 简称为B125。

[0019] 所述黄连素衍生物NBD-125可在制备抗肿瘤药物中应用。所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌等。

[0020] 本发明通过对黄连素进行改造，获得的黄连素衍生物NBD-125(化合物NBD-125)在RXRα的转录激活活性、溶解度、结肠癌细胞抑制活性三方面均优于黄连素。

[0021] 实验证明，与黄连素相比，NBD-125在DMSO中的溶解度是黄连素的10.66倍；在水中的溶解度是黄连素的6倍。与黄连素相比，50μM浓度条件下，NBD-125在结肠癌细胞KM12C细胞中视黄醇受体RXRα转录激活活性是同等条件黄连素的2.7～2.8倍，NBD-125对结肠癌细胞KM12C细胞增殖抑制能力均优于黄连素。

[0022] 在结肠癌细胞KM12C细胞中，与黄连素相比，50μM浓度条件下，NBD-125抑制β-catenin表达的能力明显优于黄连素；在促进RXRα与β-catenin的结合方面，NBD-125是黄连素的1.93倍。

[0023] 与黄连素相比，NBD-125对结肠癌细胞的周期抑制作用明显优于黄连素，NBD-125对小鼠移植瘤抑制作用明显优于黄连素，NBD-125对RXRα的结合及构象改变优于黄连素。

[0024] 与黄连素一样，NBD-125对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，而对结肠上皮细胞NCM460无抑制作用。这说明，经过改造后，NBD-125仍保留有黄连素的肿瘤选择性。

[0025] 由此可见，与黄连素相比，NBD-125的生物利用度明显优于黄连素。

[0026] 本发明经过一系列的化学生物学、分子生物学和动物模型研究，阐明了黄连素能够作为一种新型激动剂靶向RXRα，从而抑制结肠癌的细胞增殖。更重要的是，还发现黄连素能通过RXRα的介导选择性抑制肠癌细胞的生长，而对正常肠上皮细胞的影响很小。尽管与临床治疗癌症的RXRα的天然配体9-cis-RA相比，黄连素激活RXRα的能力虽仍有差距，但其具有很好的安全性和选择性，因而本发明通过针对黄连素的直接靶向RXRα进行理性设计和改造，利用全合成的策略对黄连素进行“定点突变”，以实现一些官能团的增加或敲除，合成一种新的黄连素衍生物NBD-125。利用基于哺乳动物单杂交体系的双荧光素酶报告基因检测，分析NBD-125对RXRα转录激活活性的影响；MTT比色法及Edu检测法测试衍生物对人结肠癌细胞增殖的影响；免疫印迹实验、哺乳动物双杂交系统，检测衍生物对Wnt信号通路的影响；免疫印迹实验检测衍生物对结肠癌细胞周期的影响；裸鼠成瘤实验、免疫印迹实验、免疫组化检测衍生物对肿瘤的抑制作用；荧光滴定法和圆二色谱法检测衍生物与RXRα的结合力及构效改变；药代动力学检测NBD-125的生物利用度；结果证明，发现NBD-125在RXRα转录激活活性、溶解度、抗肿瘤活性和生物利用度四方面均优于黄连素。

附图说明

[0027] 图1为黄连素(berberine)衍生物B125的合成途径。

[0028] 图2为B125的核磁共振氢谱(1H NMR)。

[0029] 图3为B125的碳谱(13C NMR)。

[0030] 图4为结肠癌细胞KM12C中黄连素及NBD-125对RXRα转录激活活性的影响。在图4中，在人结肠癌细胞KM12中，共转染pBind-GAL4-RXRα/LBD和内参pG5Luc报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、NBD-125处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析，每组数据以Mean±SEM表示。

[0031] 图5为结肠癌细胞KM12C中黄连素及NBD-125对RXRE转录激活活性的影响。在图5中，在人结肠癌细胞KM12C中，共转染pGL3-RXRE和pRL-tk报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、NBD-125处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析，每组数据以Mean±SEM表示。

[0032] 图6为黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞增殖能力的抑制作用(MTT法)。在图6中，在人结肠癌细胞KM12C中，分别用6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM黄连素、NBD-125处理15h后，用MTT检测结肠癌细胞KM12C的增殖率。

[0033] 图7为黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞增殖能力的抑制作用(EdU法)。在图7中，在人结肠癌细胞KM12C中，分别用6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM黄连素、NBD-125处理15h后，用EdU法检测结肠癌细胞KM12C的增殖率。

[0034] 图8为黄连素及NBD-125抑制结肠癌KM12C细胞β-catenin蛋白的表达。在图8中，在人结肠癌细胞KM12C中，分别用25μM、50μM黄连素、NBD-125处理15h后，用免疫印迹实验检测结肠癌细胞KM12C中β-catenin蛋白表达。

[0035] 图9为黄连素及NBD-125促进结肠癌KM12C细胞中β-catenin和RXRα的结合。在图9中，在人结肠癌细胞KM12C中，共转染pAct-RXRα、pBIND-β-catenin/33Y和pG5Luc报告基因质粒24h后，分别孵育黄连素、NBD-125处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析。每组数据以Mean±SEM表示。

[0036] 图10为黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞周期蛋白的影响。在图10中，在人结肠癌细胞KM12C中，分别用25μM、50μM的黄连素、NBD-125处理15h后，用免疫印迹实验检测结肠癌细胞KM12C中细胞周期蛋白c-Myc、CDK1、CyclinB1和p21WAF1/CIP1的表达。

[0037] 图11为黄连素及NBD-125对裸鼠移植瘤生长的影响。在图11中，在无菌条件下，BALB/c裸鼠皮下注射结肠癌细胞KM12C，裸鼠移植瘤实验检测黄连素及NBD-125对人结肠癌细胞KM12C移植瘤生长的影响。

[0038] 图12为黄连素及NBD-125对移植瘤组织中β-catenin以及细胞周期相关蛋白的表达的影响。在图12中，免疫印迹实验检测黄连素及NBD-125对移植瘤组织内β-catenin以及细胞周期相关蛋白c-Myc、CDK1、CyclinB1和p21WAF1/CIP1的表达水平的影响。

[0039] 图13为黄连素及NBD-125对移植瘤组织中移植瘤细胞内增殖标记蛋白、β-catenin以及细胞周期相关蛋白的表达水平的影响。在图13中，在裸鼠移植瘤组织中，通过免疫组化检测PCNA,Ki67,β-catenin，p21WAF1/CIP1,c-Myc，CDK1和Cyclin D1的蛋白表达(A)，(B)为免疫组化实验对移植瘤细胞内增殖标记蛋白、β-catenin以及细胞周期相关蛋白的表达水平的影响。

[0040] 图14为不同浓度的黄连素及NBD-125与RXRα-LBD蛋白滴定的荧光光谱。在图14中，(a)为Ber，(b)为NBD-125。

[0041] 图15为黄连素及NBD-125对RXRα-LBD蛋白构象的影响。在图15中，曲线a为BBR,曲线b为B-125,曲线c为RXR-DMSO,曲线d为RXR-BBR,曲线e为RXR+B-125。

[0042] 图16为黄连素及NBD-125对人正常肠上皮细胞NCM460增殖能力的影响。在图16中，在人正常上皮细胞NCM460中，分别用6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM黄连素、NBD-125处理15h后，用MTT检测正常上皮细胞NCM460的增殖率。

具体实施方式

[0043] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步地说明。

[0044] 所述黄连素衍生物NBD-125实施例的化学结构式如下：

[0045]

[0046] 简称为B125。

[0047] B125的合成途径参见图1，核磁共振氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)参见图2和3，在图2和3中，1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.92(s,1H),8.96(s,1H),8.21(d,J＝8.8Hz,1H),8.11(t,J＝8.1Hz,1H),7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.38(d,J＝7.9Hz,1H),7.12(dd,J＝8.7,2.6Hz,1H),7.08(d,J＝2.5Hz,1H),4.94(t,J＝6.3Hz,2H),4.13(s,3H),3.88(s,3H),3.31～3.26(m,2H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ171.5,166.7,155.0,149.8,148.8,147.9,147.1,137.7,
128.9,128.8,128.2,127.2,123.9,122.7,118.2,66.2,65.2,64.3,36.1.HRMS(ESI,m/z)calcd for C19H18NO2,[M]+:292.1332,found:292.1329。

[0048] 所述黄连素衍生物NBD-125可在制备抗肿瘤药物中应用。所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌等。

[0049] 本发明通过对黄连素进行改造，获得的黄连素衍生物NBD-125(化合物NBD-125)在RXRα的转录激活活性、溶解度、结肠癌细胞抑制活性三方面均优于黄连素。

[0050] 以下给出具体实施例。

[0051] 实施例1、黄连素及NBD-125的溶解度评估

[0052] 通过观察新合成的黄连素衍生物NBD-125，并与黄连素作对比，黄连素及NBD-125相关物理属性的汇总表如表1所示，二者在物理属性上既有相同点，又有差异。第一，在结构上，二者的整体架构一致，均具有异喹啉并二氢异喹啉四环结构，分子内存在一个季铵盐单元以及两个烷氧基取代的苯环；不同的是，黄连素C2、C3位为一个亚甲二氧基，C9、C10位各有一个单独的甲氧基，而NBD-125仅在C3位和C9位分别保留有一个甲氧基。第二，二者固态及溶液都为黄色，黄连素颜色比NBD-125稍微深一些。第三，在溶解度方面，以DMSO为溶剂时，NBD-125的完全溶解时间是黄连素的十分之一，可以保守地认为，NBD-125的溶解度(DMSO)提高了10倍；以灭菌双蒸水为溶剂时，NBD-125的完全溶解时间是黄连素的六分之一，可以保守地认为，NBD-125的溶解度(水)提高了5倍。因此，得出结论，改造后的黄连素衍生物NBD-125的溶解度比黄连素高了至少5倍，是溶解度更好的化合物。

[0053] 表1

[0054]

[0055] 实施例2、黄连素及NBD-125在结肠癌细胞KM12C中视黄醇受体RXRα、RXRE转录激活活性的测定

[0056] 采用荧光素酶双报告基因实验测定黄连素及NBD-125在结肠癌细胞KM12C中视黄醇受体RXRα转录激活活性。具体步骤如下：

[0057] (1)用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL、1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、
95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为104个/mL，传代到24孔细胞培养板中，每孔细胞数为20万细胞左右，待细胞密度达到85％时进行转染。具体转染过程如下：转染前将培养液换成细胞用 (Gibco，31985070)无血清培养基。在1.5mL离心管中分别配制以下两种溶
液：①稀释1～2μg质粒于100μL无血清OPTI-MEM中；②稀释2～8μL Lipofectamine 2000于
100μL无血清OPTI-MEM中，室温放置5min。轻轻混匀两种溶液，室温放置20min，使质粒---脂质体复合物形成。再次混匀，然后缓慢均匀加到培养液。4～6h后，更换新鲜的MEM完全培养液。

[0058] (2)待转染48h后，换成含有浓度分别为0、25、50μM的黄连素、NBD-125的MEM无血清培养基培养15h；

[0059] (3)弃去培养液，用500μL预冷的PBS清洗细胞两次，吸尽PBS；

[0060] (4)然后向每孔中加入100μL 1×Passive lysis buffer。4℃放置1h裂解细胞；

[0061] (5)用Dual-Luciferase Assay System试剂盒测定进行荧光素酶报告基因的检测，取50μL细胞裂解上清液，避光条件下加入100μL荧光素素酶底物LAR II，迅速混匀，使用酶标仪(Bio-Tek)的自发光检测系统Luminescence检测萤火虫荧光素酶的活性。然后依然在避光条件下加入100μL 试剂，振荡混匀，用酶标仪(Bio-Tek)的自发光检测系统Luminescence检测海肾荧光素酶的活性。每个实验重复三次并取平均值作为实验结果。采用数理统计学软件Origin7.0进行统计学分析。

[0062] 结果如图4和5所示：在图4的实验中，通过在人结肠癌细胞KM12C中转染pBind-GAL4-RXRα/LBD和内参pG5Luc质粒24h后，加入黄连素和NBD-125处理15h后，检测荧光素酶报告基因的激发程度，结果发现，这两种化合物均能显著提高RXRα/LBD的转录激活活性；并且，在50μM浓度条件下，NBD-125对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的2.83倍左右，并呈显著性差异。图5的实验中，通过在KM12C人结肠癌细胞中共转染pGL3-RXRE和pRL-tk报告基因质粒24h后，加入黄连素和NBD-125处理15h后，检测荧光素酶报告基因的激发程度。结果发现，在结肠癌细胞KM12C中，黄连素及NBD-125均能增强启动子中含RXRE的荧光素酶报告基因的转录水平，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，促进作用越强，表明黄连素和NBD-125都能激活内源RXRα的转录激活活性。同时，二者相比，在50μM浓度条件下，NBD-125对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的2.5倍左右，并呈显著性差异。

[0063] 实施例3、黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C增殖能力的影响

[0064] 3-1.采用MTT法考查黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C的增殖抑制作用[0065] 用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为104/mL，到96孔细胞培养板中，每孔细胞数为104左右，培养过夜。待细胞贴壁后弃去原培养基，根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即无药物细胞对照组、溶剂(DMSO)对照组、黄连素组(12.5、25、50μM)、NBD-125组(12.5、25、50μM)。每孔的最终细胞培养液的体积为200μL。每组设5个重复，继续培养15h。接着，用pH 7.4的PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)洗涤2次，每孔加入20μL的5mg/mL MTT和180μL新鲜的MEM完全培养基，继续培养细胞4h后，弃上清液。每孔加入200μL DMSO，在37℃条件下，震荡10min，使蓝紫色结晶甲臜完全溶解。以630nm为参考波长，立即用Bio-Rad酶标仪Model 680测定490nm光吸收值。每次实验均取同一传代细胞。按下式计算抑制率：抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％。

[0066] 结果如图6所示，黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。另外，同一浓度下，黄连素和NBD-125的肿瘤抑制作用进行平行对比，结果发现，在6.25、12.5、25、50μM浓度条件下，NBD-125对结肠癌细胞的增殖抑制作用均优于黄连素，且呈显著差异性。

[0067] 3-2.EdU试剂盒检测法

[0068] 采用EdU试剂盒检测法考查黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C的增殖抑制作用[0069] (1)细胞培养：取对数生长的结肠癌KM12C细胞，以每孔10000个接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

[0070] (2)药物处理：待细胞贴壁后弃去原培养基，根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即无药物细胞对照组、溶剂(DMSO)对照组、黄连素组(6.25、12.5、25、50μM)、NBD-125组(6.25、12.5、25、50μM)。每孔的最终细胞培养液的体积为200μL。每组设5个重复，继续培养15h。

[0071] (3)EdU标记：用MEM完全培养基稀释EdU溶液，制备适量的50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃去培养基。

[0072] (4)细胞固定：每孔加入100μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min；每孔加入2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃去甘氨酸溶液；每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5min，弃去PBS；向每孔加入100μL渗透剂(0.5％Trition X-100的PBS)脱色摇床孵育
10min；PBS清洗1次，5min。

[0073] (5)Apollo染色

[0074] 每孔加入100μL的1*Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后弃染色反应液；加入100μL渗透剂脱色摇床清洗2～3次，每次10min，弃渗透剂；每孔每次加入100μL甲醇清洗2次，每次5min；PBS清洗1次，5min/次。

[0075] (6)DNA染色

[0076] 用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量的1*Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μL 1*Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；每孔每次加入100μL的PBS清洗3次。

[0077] (7)图像获取及分析

[0078] 染色完成后，立即进行观测和统计。

[0079] 结果如图7所示，黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。另外，同一浓度下，黄连素和NBD-125的肿瘤抑制作用进行平行对比，结果发现，在12.5、25、50μM浓度条件下，NBD-125对结肠癌细胞的增殖抑制作用均优于黄连素，且呈显著差异性。

[0080] 实施例4、黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞Wnt信号通路的影响

[0081] 4-1.免疫印迹法检测黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞β-catenin蛋白表达的影响

[0082] 用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为1×107个/mL，到6孔细胞培养板中，每孔细胞数为2×105左右，培养过夜。待细胞贴壁后弃去原培养基，根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，即无药物细胞对照组、溶剂(DMSO)对照组、黄连素组(25、50μM)、NBD-125组(25、50μM)。每孔的最终细胞培养液的体积为2mL。每组设3个重复，继续培养15h。接着，用pH7.4的PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)洗涤2次，每孔加入200μL的细胞裂解液lysis buffer，冰上超声破碎，4℃，13000rpm离心30min后收集上清液，测蛋白浓度。

[0083] a蛋白浓度的测定：

[0084] 采用Thermo公司的BCA测定蛋白浓度试剂盒。实验原理是：蛋白质在碱性条件下可以将Cu2+转变为Cu+，BCA能够与Cu+结合，产生紫色产物，在562nm处有较强的吸光值，此吸光值在20～2000μg/ml范围内与蛋白浓度呈线性关系。具体实验步骤如下：

[0085] (1)每孔加入8μL的生理盐水，再加入2μL的待测蛋白样品；标准品用2mg/mL的BSA按照倍比稀释法稀释；

[0086] (2)按ReagentA与Reagent B＝50:1的比例混和均匀配制总共所需的工作液，现用现配；

[0087] (3)每孔加入200μL的工作液，小心拍打30s，充分混匀；

[0088] (4)盖上96孔板的盖子，37℃放置25min；

[0089] (5)将样品放入酶标仪中并设置为570nm的吸光值测定；

[0090] (6)根据标准品的浓度得出相应的公式，然后算出待测样品的浓度以及上样的体积。

[0091] b.蛋白电泳：

[0092] 取30μg蛋白样品，加等体积2×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5min，于不连续SDS-PAGE胶中，以衡定电流60mA电泳。

[0093] c.电转移：

[0094] 电转液于4℃预冷，切好胶后将比胶稍大一些的PVDF膜(甲醇预处理)以及滤纸浸于电转液中；PVDF膜贴于胶后，两面覆盖滤纸，赶尽气泡，按膜朝正极的方向装于电转槽中，于-20℃电转(100V，60min)。

[0095] d.抗原抗体反应：

[0096] 封闭液没过膜，室温孵育1h；封闭后的膜与相应一抗在室温孵育3h；TBST洗3次，每次5min；然后加入相应的二抗，室温孵育2h。

[0097] e.ECL检测：TBST洗3次，每次10min。临用前将ECL的A液和B液以1∶1(V/V)混和，于暗室中滴加于膜表面，孵育1min后用胶片曝光。

[0098] 溶液配方：

[0099] Lysis Buffer：50mM HEPES(pH7.4)，100mM NaCl，10％glycerol，1％Triton-X-100，1.5mMMgCl2，25mM NaF，临用前加1mM的PMSF。

[0100] 10×下层胶缓冲液(1L)：422.5g Tris，10g SDS，用HCl调pH值至8.8。

[0101] 4×上层胶缓冲液(1L)：60.6g Tris，4g SDS，用HCl调pH值至6.8。

[0102] 10％下层胶(10mL)：3.33mL 30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29∶1)，1mL 10×下层胶缓冲液，5.6mL水，100μL 10％过硫酸铵，10μL TEMED。

[0103] 4％上层胶(5mL)：0.67mL 30％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29∶1)，1.25mL 4×上层胶缓冲液，3.05mL水，50μL 10％过硫酸铵，5μL TEMED。

[0104] 2×SDS上样缓冲液(10mL)：2mL甘油，4mL 10％SDS，2mL 4×上层胶缓冲液，1mLβ-巯基乙醇，0.002g溴酚兰。

[0105] 10×电泳缓冲液(1L)：30g Tris，144g Glycine，10g SDS。

[0106] 10×电转缓冲液(1L)：24.25g Tris，112.5g Glycine，临用前加甲醇至终浓度为10％。

[0107] 10×TBS(1L)：24.2g Tris，80g NaCl，用HCl调pH值至7.6。

[0108] TBST洗脱液(1L)：100mL 10×TBS，1mL Tween-20。

[0109] 封闭液：5％脱脂奶粉溶于TBST。

[0110] 一抗稀释缓冲液：5％BSA，0.03％NaN3溶于TBST。

[0111] 结果如图8所示，黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C中β-catenin的蛋白表达都有抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，抑制作用越强。另外，同一浓度下，黄连素和NBD-125的肿瘤抑制作用进行平行对比，结果发现，在25、50μM浓度条件下，NBD-125对β-catenin的蛋白表达的抑制作用均优于黄连素。

[0112] 4-2.哺乳动物双杂交实验证明黄连素及NBD-125促进结肠癌细胞KM12C中RXRα与β-catenin的结合，从而抑制结肠癌细胞的增殖

[0113] 具体实验方法同实施例1。实验结果如图9所示，为了检测黄连素及NBD-125能否通过以RXRα配体结合的方式促进RXRα与β-catenin的结合，在结肠癌细胞KM12C中，共转染质粒pAct-RXRα、pBIND-β-catenin/33Y和pG5Luc报告基因质粒24h后，分别加入黄连素、NBD-125处理15h，最后进行双荧光素酶报告基因表达分析。如图所示，黄连素、NBD-125都能增强RXRα与β-catenin的结合，并呈浓度依赖性，药物浓度越高，促进作用越强；同时，在50μM浓度条件下，NBD-125对RXRα/LBD的转录激活活性的提高作用是黄连素的1.93倍左右，并呈显著性差异。

[0114] 实施例5、黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞周期蛋白表达的影响

[0115] 具体实施方法同实施例4-1，采用免疫印迹法考查黄连素及NBD-125对结肠癌KM12C细胞周期蛋白表达的影响。如图10所示，在结肠癌细胞KM12C中，黄连素及其衍生物以浓度依赖地方式下调周期蛋白c-Myc、CDK1、CyclinB1的蛋白表达和上调p21WAF1/CIP1的表达。另外，同一浓度下，黄连素和NBD-125的肿瘤抑制作用进行平行对比，结果发现，在25、50μM浓度条件下，NBD-125对周期相关蛋白表达调控水平均优于黄连素。

[0116] 实施例6、黄连素及NBD-125对裸鼠移植瘤的影响

[0117] 6.1裸鼠成瘤实验

[0118] 裸鼠饲养于厦门大学实验动物中心，待其6～7周龄，体重18～20g后进行移植瘤实验。用MEM完全培养基(货号Gibco，61100061，添加10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1mM维生素、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL、1.5g NaHCO3/L)，在CO2培养箱中37℃、5％CO2、95％饱和湿度的条件下培养结肠癌细胞KM12C。待细胞生长至近融合状态，经0.25％胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为1×107个/mL，皮下注射裸鼠右侧背部(每只注射0.1mL，为1×106个细胞)。待小鼠形成可触摸的移植瘤后，将其随机分为3组，每组8只，一组灌胃生理盐水(5μL/g体重)，其他两组分别灌胃黄连素(100mg/kg体重，溶于0.5％的CMC-Na溶液)和NBD-125(100mg/kg体重，溶于0.5％的CMC-Na溶液)，每天灌胃一次。15天后断颈处死小鼠，剥离移植瘤，并拍照和称量质量。

[0119] 6.2免疫组化检测

[0120] (1)固定

[0121] 切取一部分移植瘤固定于4％多聚甲醛48h。

[0122] (2)脱水

[0123] 将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h——85％酒精2h——90％酒精2h——95％酒精1h——无水乙醇I 30min——无水乙醇II30min——醇苯5～10min——二甲苯I 5～10min——二甲苯II 5～10min——蜡I 
1h——蜡II 1h——蜡III 1h。

[0124] (3)包埋、切片

[0125] 将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。

[0126] (4)烤片

[0127] 切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存。

[0128] (5)脱水

[0129] 在65℃烤箱中烘烤组织切片1h后，二甲苯I 5min——二甲苯II 5min——无水乙醇I--3min——无水乙醇II 3min——95％乙醇1min——80％乙醇1min——70％乙醇1min——超纯水清洗1min。

[0130] (6)抗原修复

[0131] 将切片放入预热的柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，高温高压抗原修复30min；用PBS冲洗切片后，滴加适量的过氧化氢酶阻断剂，室温孵育10min。

[0132] (7)封闭

[0133] 用PBS冲洗切片3次，每次5min，滴加正常非免疫动物血清，室温封闭30min。

[0134] (8)抗体(一抗、二抗)孵育

[0135] 吸去血清，滴加2％BSA稀释的一抗，4℃孵育过夜；用PBS冲洗切片3次，每次5min，滴加增强剂，室温孵育20min；用PBS冲洗切片3次，每次5min，滴加酶标二抗(迈新)，室温孵育1h；用PBS冲洗切片3次，每次5min。

[0136] (9)显色、封片、观察

[0137] 使用DAB试剂盒(迈新)显色，自来水冲洗终止反应；染苏木素溶液1min，冲水反蓝；超纯水清洗——70％乙醇30s——80％乙醇30s——95％乙醇1min——无水乙醇Ⅰ——无水乙醇Ⅱ1min——二甲苯Ⅰ5min——二甲苯Ⅱ5min，取出片子在通风橱晾干，中性树胶封片，带胶干后即可镜检。

[0138] 另取一部分移植瘤样品于液氮中保存备用，以进行组织蛋白提取和免疫印迹分析，具体操作可见实施例4。

[0139] 0.5％苏木素配方：A液：苏木素0.5g、无水乙醇5ml；B液：硫酸铝钾10g、蒸馏水100ml；将AB液分别溶解后混合加热煮沸，缓缓加入0.25g氧化汞(此时产生大量气泡，故容器要足够大)，然后迅速冷却，过滤，使用前加入冰醋酸4ml。

[0140] 结果如图11所示，裸鼠移植瘤实验检测黄连素及NBD-125对KM12C人结肠癌细胞移植瘤生长抑制均有影响，其中NBD-125对移植瘤的生长抑制作用优于黄连素；免疫印迹实验检测到黄连素及NBD-125抑制移植瘤细胞内β-catenin蛋白水平的表达，下调周期蛋白c-Myc、CDK1、CyclinB1的蛋白表达和上调p21WAF1/CIP1的表达。对黄连素和NBD-125对相关蛋白表达作用进行平行对比，NBD-125对移植瘤细胞内β-catenin蛋白和周期相关蛋白表达调控水平均优于黄连素(图12)；免疫组化实验结果(图13)显示黄连素及NBD-125对移植瘤细胞内增殖标记蛋白ki-67、PCNA；β-catenin蛋白以及细胞周期相关蛋白的表达水平的影响与肿瘤组织免疫印迹实验结果一致。

[0141] 实施例7、黄连素及NBD-125与RXRα的配体结合区结合

[0142] 质粒pET15b-RXRα-LBD编码的RXRα-LBD蛋白在N端带有连续的6个组氨酸残基(6×His)，可以利用Ni2+-NTA树脂层析柱进行亲和纯化。将构建好的pET15b-RXRα-LBD表达质粒转化入Ecoli菌株BL21(DE3)，用来表达目的蛋白。将菌株培养于含100μg/ml氨苄青霉素的10mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中培养过夜，以1:100的体积比转接到1L含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导6h后以5000rpm离心20min收集菌体，冻存于-80℃超低温冰箱中备用。按照标准His-标签融合蛋白方法进行蛋白纯化。首先，以Binding buffer A(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、10mM咪唑、1mM PMSF，pH 8.0)充分重悬冻存的菌体,再用超声破碎仪以300W功率，超声5s，停10s，共计超声20min，破碎细菌，细胞碎片以离心方式除去(10000rpm，30min，4℃)。上清液加入到Ni2+-NTA树脂层析亲和柱上，亲和柱提前以2倍体积的结合缓冲液A平衡。树脂与上清液在4℃混和1h后，以50mLWash buffer B(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、40mM咪唑，pH 8.0)冲洗，再以20mLwash buffer(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、80mM咪唑，pH 8.0)冲洗。最后以Elution buffer D(20mM Tris-HCl、500mM NaCl、
300mM咪唑，pH 8.0)洗脱目标蛋白，即得到纯化好的RXRα/LBD蛋白。

[0143] 7-1.荧光滴定法检测黄连素、NBD-125与RXRα/LBD蛋白之间的结合作用[0144] (1)测定蛋白浓度(具体操作见实施例4)。

[0145] (2)荧光光谱仪设定：打开仪器开关，软件，设定激发波长为280nm，检测发射波长为285～430nm.激发和发射的狭缝波长一般射为5nm和5nm。

[0146] (3)用PBS(室温)将蛋白稀释至所需浓度(如5μM)，吸入干净的比色杯(溶液体积2mL)，室温静置10min，使稳定。

[0147] (4)扫描蛋白的荧光光谱图并记录峰值，重复测定3次后开始滴定。

[0148] (5)向比色杯中的蛋白溶液分别加入DMSO或黄连素(1mM)或NBD-125(1mM)1μL，扫描蛋白的荧光光谱图并记录峰值，重复测定3次后开始下一次的滴定。

[0149] (6)重复滴定步骤12次，扫描蛋白的荧光光谱图并记录峰值。

[0150] (7)处理数据，对光谱图进行叠加，确定滴定的情况：荧光淬灭(峰值所在横坐标不变。

[0151] 结果如图14所示，在280nm波长激发下，RXRα/LBD在337nm处有最大的荧光发射峰，而黄连素及NBD-125则没有。随着黄连素及NBD-125浓度的逐渐增加，RXRα/LBD(1μM)的荧光峰值逐渐降低，表明黄连素及NBD-125均能与RXRα/LBD结合并导致其发生荧光淬灭。根据文献报道的方法，算出黄连素与RXRα/LBD结合的解离平衡常数Kd为24.28μM；NBD-125与RXRα/LBD结合的解离平衡常数Kd为18.91μM。

[0152] 7-2.圆二色光谱(CD)实验检测黄连素及NBD-125对RXRα蛋白的二级结构的影响[0153] (1)纯化体外表达的蛋白His-RXRα-LBD，并透析至0.01M磷酸缓冲液PB(4℃)；

[0154] (2)测定蛋白浓度；

[0155] (3)圆二色谱仪设定：打开仪器开关，软件，设定检测波长为190～260nm，光路径0.5cm，其余条件为默认值；

[0156] (4)用PB(室温)将蛋白稀释至1mM，吸入干净的CD专用比色杯(溶液体积1ml，比色皿规格0.5cm)，室温静置10min，使稳定；

[0157] (5)扫描蛋白的圆二色光谱图，重复测定3次后可以开始加入药物；

[0158] (6)向比色杯中的蛋白溶液加入DMSO或黄连素(1mM)或NBD-125(1mM)(使药物与蛋白终浓度为1︰1)，用200μL枪头吹吸8次混匀，静止5min，扫描圆二色光谱图，重复测定3次；

[0159] (7)处理数据，对光谱图进行叠加。

[0160] 结果如图15所示，RXRα蛋白的构象在190～260nm处有明显的峰值；黄连素与NBD-125的圆二色光谱曲线，基本呈直线，说明黄连素与NBD-125没有手性结构，不会因为其自身的圆二色性给实验结果带来干扰；黄连素或NBD-125与RXRα/LBD共孵育后的蛋白构象，RXRα蛋白的构象光谱曲线相比，RXRα/LBD在190～260nm的峰值明显改变了，表明黄连素或NBD-
125能够使RXRα/LBD的构象发生变化，且NBD-125对RXRα/LBD蛋白的二级构象的影响明显强于黄连素。

[0161] 实施例8、黄连素及NBD-125的肿瘤选择性

[0162] 具体实施方法同实施例2-1，采用MTT法考查黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C、结肠上皮细胞NCM460增殖的影响。实验结果如图16所示，黄连素及NBD-125对结肠癌细胞KM12C都有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性，即药物浓度越高，抑制作用越强。并且，NBD-125的抑制作用比黄连素更为明显，在25、50μM浓度时均优于黄连素的效果，且呈显著性差异。相比之下，在25μM时，黄连素及NBD-125对结肠上皮细胞株NCM460的增殖基本无抑制作用；在50μM时，二者对结肠上皮细胞株NCM460的增殖有轻微抑制作用，但效果都不及对结肠癌细胞KM12C的抑制作用。这样的结果显示，黄连素、NBD-125对正常结肠上皮细胞的损伤作用较小，说明改造出的衍生物NBD-125保留了黄连素本身所具备的低毒、高选择性等优势，可以让药物在发挥抗癌功效的同时，最大程度地减少对正常结肠细胞的损伤。同时，也提示我们，在以后NBD-125的开发应用中可以对用药浓度进行一定浓度范围内的临床摸索，便于降低临床用药毒性，提高临床用药效果。

[0163] 实施例9、药代动力学检测黄连素及NBD-125的生物利用度

[0164] SPF级SD雄性大鼠18只，6～8周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。大鼠适应性饲养一周后，随机平均分成6组，静脉注射组(IV组)和灌胃组(PO组)，每组3只大鼠。IV组给药剂量为5mg/kg，PO组给药剂量为100mg/kg。给予药物后0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36h后，进行尾静脉取血200μL，肝素钠抗凝，2000rpm、4℃离心10min，精密量取100μL上清血浆置另一EP管中，-60℃冰箱保存待用。用时取50μL血浆加入1.5mL管中，加入200μL含内标普诺奈尔的乙腈进行蛋白质沉淀。将混合物旋流，离心14000rpm，离心5min，注入200μL上清液进行LC-MS/MS(UPLC(waters)色谱系统)分析。

[0165] 色谱分离采用UPLC BEH C18柱，50×2.1mm，1.7μm，柱温保持在室温下，流速保持在0.6mL/min，使用以下流动相：

[0166] A:水相(0.1％甲酸水溶液含10mm乙酸铵)

[0167] B:有机相(0.1％甲酸乙腈溶液含10mm乙酸铵)

[0168] UPLC流动相条件如表2所示。

[0169] 表2

[0170]时间(min) 流速(mL/min) A(％) B(％)
0 0.6 72 28
1.5 0.6 72 28

[0171] 实验数据采集和处理分析采用1.5软件包(Apple BioSosies)。

[0172] 黄连素及NBD-125的生物利用度检测结果如表3所示。

[0173] 表3

[0174]

[0175] 黄连素及NBD-125的主要药动学参数结果显示：NBD-125与黄连素相比，NBD-125末端消除半衰期(T1/2)缩短了40％，药峰浓度(Cmax)增加了16.75倍，药时曲线下面积(AUC)增加了21.25倍，平均驻留时间(MRT)缩短了50％，生物利用度(F％)增加了26倍。