蛋白质TaWRKY13在调控植物抗逆性中的应用

摘要

本发明公开了蛋白质TaWRKY13在调控植物抗逆性中的应用，蛋白质TaWRKY13的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，在野生型拟南芥中过表达TaWRKY13基因可以提高拟南芥的耐盐性，耐盐性提高表现为总根长增加和根系表面积增加；在水稻品种日本晴中过表达TaWRKY13基因可以提高水稻的耐盐性，耐盐性提高表现为株高增加、脯氨酸含量增加和丙二醛含量降低。蛋白质TaWRKY13可以调控植物的抗逆性。本发明具有重要的应用价值。

权利要求

1.蛋白质TaWRKY13的应用，为S1）或S2）：S1）调控植物耐盐性；

S2）培育耐盐性改变的转基因植物；所述蛋白质TaWRKY13为a1）或a2）：a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述植物为水稻或拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物耐盐性为增加植物耐盐性。

3.编码权利要求1所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子的应用，为S1）或S2）：S1）调控植物耐盐性；

S2）培育耐盐性改变的转基因植物；

所述植物为水稻或拟南芥。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白质TaWRKY13的核酸分子为编码区是序列表中序列1所示的DNA分子。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白质TaWRKY13的核酸分子为核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

6.如权利要求3至5任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物耐盐性为增加植物耐盐性。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中权利要求1中所述蛋白质TaWRKY13的表达量，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的耐盐性增加；

所述提高出发植物中所述蛋白质TaWRKY13的表达量通过向出发植物中导入编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子实现；

所述植物为水稻或拟南芥。

8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质TaWRKY13的含量，从而增加耐盐性；

所述增加植物中所述蛋白质TaWRKY13的含量通过向出发植物中导入编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子实现；

所述植物为水稻或拟南芥。

说明书

蛋白质TaWRKY13在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质TaWRKY13在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

[0002] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。

[0003] 在干旱、高盐和养分缺乏等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

[0004] 干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，从而提高植物品种的抗逆性，成为植物遗传研究及植物品种改良的重要任务之一。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提高植物的抗逆性，如耐盐性。

[0006] 本发明首先保护蛋白质TaWRKY13的应用，可为S1)或S2)：

[0007] S1)调控植物抗逆性；

[0008] S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

[0009] 上述应用中，所述蛋白质TaWRKY13可为a1)或a2)或a3)：

[0010] a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

[0011] a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

[0012] a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。

[0013] 其中，序列表中序列2由222个氨基酸残基组成。

[0014] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0015] 表1.标签的序列

[0016]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0017] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0018] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0019] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0020] 本发明还保护编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子的应用，可为S1)或S2)：

[0021] S1)调控植物抗逆性；

[0022] S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

[0023] 上述应用中，所述编码蛋白质TaWRKY13的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

[0024] b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

[0025] b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

[0026] b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质TaWRKY13的DNA分子；

[0027] b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质TaWRKY13的DNA分子。

[0028] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0029] 其中，序列表中序列1由669个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

[0030] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质TaWRKY13的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质TaWRKY13的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质TaWRKY13，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0031] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质TaWRKY13的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0032] 上述任一所述的应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

[0033] 上述任一所述的应用中，所述“培育抗逆性改变的转基因植物”可为培育抗逆性增加的转基因植物。

[0034] 上述任一所述的应用中，所述抗逆性可为耐盐性。

[0035] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质TaWRKY13的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性增加。

[0036] 上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质TaWRKY13的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中上述任一所述蛋白质TaWRKY13的表达量和/或活性的效果。

[0037] 上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质TaWRKY13的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子实现。

[0038] 上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质TaWRKY13的核酸分子，得到的重组质粒。

[0039] 所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13。所述重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13具体可为向pCAMBIA1302载体的限制性内切酶NcoI的识别序列之间插入序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

[0040] 所述转基因植物具体可为实施例3提及的35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3。此时出发植物为拟南芥，具体为野生型拟南芥Columbia-0亚型。

[0041] 所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13。所述重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13可为将pCAMBIA1305载体的限制性内切酶NcoI和EcoRI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

[0042] 所述转基因植物具体可为实施例4提及的35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3。此时出发植物为水稻，具体为水稻品种日本晴。

[0043] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质TaWRKY13的含量和/或活性，从而增加抗逆性。

[0044] 上述任一方法中，所述抗逆性可为耐盐性。

[0045] 上述任一所述增加耐盐性可表现为总根长增加和/或根系表面积增加(出发植物为拟南芥)。

[0046] 上述任一所述增加耐盐性可表现为株高增加和/或脯氨酸含量增加和/或丙二醛含量降低(出发植物为水稻)。

[0047] 上述任一所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种日本晴；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

[0048] 实验证明，在野生型拟南芥中过表达TaWRKY13基因可以提高拟南芥的耐盐性，耐盐性提高表现为总根长增加和根系表面积增加；在水稻品种日本晴中过表达TaWRKY13基因可以提高水稻的耐盐性，耐盐性提高表现为株高增加、脯氨酸含量增加和丙二醛含量降低。蛋白质TaWRKY13可以调控植物的抗逆性。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

[0049] 图1为实施例1中步骤2获得的PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果。

[0050] 图2为蛋白质TaWRKY13在小麦原生质体中的亚细胞定位结果。

[0051] 图3为转TaWRKY13基因拟南芥的耐盐性鉴定结果。

[0052] 图4为转TaWRKY13基因水稻的耐盐性鉴定结果。

具体实施方式

[0053] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

[0054] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0055] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0056] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0057] 野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.在下文中，野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。

[0058] 16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体记载于如下文献中：谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定[J].中国农业科学，2015，48(5):851-860.在下文中，16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体简称为16318hGFP载体。

[0059] pCAMBIA1305载体记载于如下文献中：Wang C，Wang Y，Cheng Z，et al.The role of OsMSH4 in male and female gamete development in rice meiosis[J].Journal of Experimental Botany，2015，67(5)：1447.

[0060] 金禾9123记载于如下文献中：ω-黑麦碱基因沉默对小麦1B/1R易位系加工品质的影响[J].作物学报，2016，42(5):627-632.

[0061] 下述实施例中的纤维素酶解液的制备方法如下：(1)将0.225g纤维素酶R10、0.045g果胶酶R10、1.09g甘露醇、1mL浓度为0.3M的KCl水溶液、1mL浓度为0.3M的MES水溶液(pH值5.7)和10mL蒸馏水混匀，然后55℃水浴10min，冷却至室温；(2)完成步骤(1)后，加入
1mL浓度为0.15M的CaCl2水溶液、1mL浓度为1.5％(m/v)的BSA水溶液和1mL浓度为75mM的β-巯基乙醇，混匀；然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤，收集滤液；滤液即为制备的纤维素酶解液。

[0062] W5溶液：将NaCl9g、CaCl2H2O18.4g、KCl0.37g、glucose0.9g和MES0.3g溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L；KOH调节pH值至5.8；121℃灭菌20min。

[0063] MMG溶液：将0.71gMgCl2、0.5gMES和36.5g甘露醇溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至500mL；KOH调节pH值至5.6；121℃灭菌20min。

[0064] WI溶液：将18.217g甘露醇、0.3gMES和0.12gKCl溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至200mL；121℃灭菌20min。

[0065] PEG4000溶液：由1g PEG4000、0.75mL水、0.625mL浓度为0.8M的甘露醇和0.25mL浓度为1M的CaCl2水溶液混合而成。

[0066] 纤维素酶R10为Yakult公司的产品，产品目录号为C6270-1g。果胶酶R10为荣兴生物公司的产品，产品目录号为RX-L0042-100mg。甘露醇为北京梦怡美商贸中心的产品，产品目录号为M0122-500g。KCl为北京宝瑞杰科技有限公司的产品，产品目录号为7447-40-7。MES、CaCl2、NaCl、MgCl2、Glucose和PEG4000均为北京拜尔迪生物技术有限公司的产品，产品目录号依次为DE-E169-100g、031-00435、7647-14-5、DE-0288-500g、049-31165和BR-0084。
BSA为北京泽平科技有限责任公司的产品，产品目录号为0219989980。β-巯基乙醇为北京瑞德百奥生物科技有限公司的产品，产品目录号为0482-100ML。KOH为北京溪洋汇智科技有限公司的产品，产品目录号为XYHZ-2017-05185。Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0为TaKaRa公司的产品，Code No.为DV807A。

[0067] 实施例1、蛋白质TaWRKY13的编码基因(即TaWRKY13基因)的克隆

[0068] 1、采用Trizo1法提取生长至7天的金禾9123幼苗的叶片的总RNA，然后先利用反转录酶反转录出第一链cDNA，再采用SMART法合成ds cDNA，即获得金禾9123的ds cDNA。

[0069] 2、以步骤1获得的金禾9123的dscDNA为模板，采用：TaWRKY13-F：5’-ATGGCCCTGGACTCCGT-3’和TaWRKY13-R：5’-TCACAAGAACTGAAAGTACTCGAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0070] 将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

[0071] 1％琼脂糖凝胶电泳结果见图1(BM2000+为DNA Marker，1-7均为PCR扩增产物)。

[0072] 3、采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从步骤2得到的PCR扩增产物中回收约670bp的DNA片段。

[0073] 将步骤3回收的DNA片段进行测序。测序结果表明，步骤3回收的DNA片段(即TaWRKY13基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

[0074] 实施例2、蛋白质TaWRKY13的亚细胞定位分析

[0075] 一、重组质粒16318hGFP-TaWRKY13的构建

[0076] 1、以实施例1中步骤3回收的DNA片段为模板，采用TaWRKY13-GFP-F：5’-TATCTCTAGAGGATCCATGGCCCTGGACTCCGT-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)和TaWRKY13-GFP-R：5’-TGCTCACCATGGATCCTCACAAGAACTGAAAGTACTCGAT-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0077] 2、采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从步骤1得到的PCR扩增产物中回收约700bp的DNA片段。

[0078] 3、将步骤2回收的DNA片段和16318hGFP载体进行同源重组，得到重组质粒16318hGFP-TaWRKY13。

[0079] 二、小麦原生质体的制备

[0080] 按照如下步骤制备小麦原生质体：

[0081] 1、在土培室中播种金禾9123种子，正常培养。

[0082] 2、完成步骤1后，在未开花前，剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。

[0083] 3、完成步骤2后，取培养皿，加入叶条和纤维素酶解液(10-20片叶子大约需5-10mL纤维素酶解液)且使叶条完全浸入纤维素酶解液中，然后置于真空泵，黑暗(通过锡箔纸包裹实现)抽真空30min。

[0084] 4、完成步骤3后，将所述培养皿置于黑暗条件下，28℃、50rpm振荡培养；当培养皿中的液相变绿时轻轻摇晃(目的为促使原生质体释放)，然后用显微镜观察小麦原生质体。

[0085] 5、完成步骤4后，取所述培养皿，加入与培养皿中液相等体积的冰上预冷的W5溶液，混合均匀，然后过滤除去未溶解的叶条，收集滤液。

[0086] 6、取尼龙膜(直径为35-75μm)或筛子(60-100目)，先用冰上预冷的W5溶液润湿，然后对步骤5收集的滤液进行过滤，收集滤液。

[0087] 7、将步骤6收集的滤液置于圆底离心管，4℃、100g离心1-2min，沉淀原生质体，尽量去除上清；然后用10mL冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体，冰上静止30min，即获得小麦原生质体。

[0088] 三、蛋白质TaWRKY13的亚细胞定位分析

[0089] 下述操作均在23℃条件下进行。

[0090] 1、取步骤二中7所述圆底离心管，100g离心8-10min，使原生质体沉淀；然后在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液；最后用适量MMG溶液重悬，得到原生质体溶液；5
原生质体溶液中，原生质体的浓度为2×10个/mL。

[0091] 2、完成步骤1后，取EP管(规格为2mL)，加入10-20μg待测质粒(重组质粒16318hGFP-TaWRKY13或16318hGFP载体)和100μL原生质体溶液(约2×104个原生质体)，轻柔混合。

[0092] 3、完成步骤2后，向所述EP管中加入110μL PEG4000溶液轻柔拍打离心管完全混合，然后静置处理20-30min。

[0093] 4、完成步骤3后，取所述EP管，加入400-440μL W5溶液，然后轻柔颠倒摇动EP管使之混合完好，以终止转化反应。

[0094] 5、完成步骤4后，取所述EP管，100g离心2min，弃上清；然后加入1mL W5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min，弃上清。

[0095] 6、完成步骤5后，取所述EP管，用1mL WI溶液轻柔重悬原生质体，然后置于多孔组织培养皿中，20-25℃暗培养18h以上。

[0096] 7、完成步骤6后，将原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad MicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)下观察GFP的荧光，并扫描照像。激光扫描共聚焦显微镜的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。

[0097] 结果见图2(第1行为16318hGFP载体(作为空载体对照)，第2行为重组质粒16318hGFP-TaWRKY13，第1列(即图2中GFP)为GFP蛋白激活的绿色荧光形态，第2列(即图2中Bright frield)为明场下的形态，第3列(即图2中ChloroplastII)为叶绿体的形态，第4列(即图2中Merged)为1、2、3列叠加的照片)。结果表明，蛋白质TaWRKY13定位于细胞核中。

[0098] 实施例3、转TaWRKY13基因拟南芥的获得及鉴定

[0099] 一、重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13、GV3101/pCAMBIA1302-TaWRKY13和GV3101/pCAMBIA1302的获得

[0100] 1、以实施例1中步骤3回收的DNA片段为模板，采用TaWRKY13-1302-F：5’-GGACTCTTGACCATGGATGGCCCTGGACTCCGT-3’(下划线为限制性内切酶NcoI的识别位点)和TaWRKY13-1302-R：5’-GTCAGATCTACCCATGGTCACAAGAACTGAAAGTACTCGAT(下划线为限制性内切酶NcoI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收约669bp的DNA片段。

[0101] 2、用限制性内切酶NcoI酶切pCAMBIA1302载体(记载于如下文献中：HE G H，XU J Y，WANG Y X，LIU J M，LI P S，CHEN M，MA Y Z，XU Z S.Drought-responsive WRKY transcription factor genes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistance in Arabidopsis.BMC Plant Biology，2016，16(1):116.)，采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收约10.549kb的载体骨架1。

[0102] 3、将步骤1回收的DNA片段和载体骨架1连接，得到重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13。

[0103] 将重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13为向pCAMBIA1302载体的限制性内切酶NcoI的识别序列之间插入序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13表达序列表中序列2所示的蛋白质TaWRKY13。

[0104] 4、将重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA1302-TaWRKY13。将pCAMBIA1302载体导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA1302。

[0105] 二、转TaWRKY13基因拟南芥的获得

[0106] 1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将GV3101/pCAMBIA1302-TaWRKY13转至野生型拟南芥中，获得T1代转TaWRKY13基因拟南芥种子。

[0107] 2、将步骤1获得的T1代转TaWRKY13基因拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转TaWRKY13基因阳性苗，T1代转TaWRKY13基因阳性苗收到的种子即为T2代转TaWRKY13基因拟南芥种子。

[0108] 3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转TaWRKY13基因拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为TaWRKY13基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转TaWRKY13基因拟南芥种子。

[0109] 4、将步骤3筛选出的T3代转TaWRKY13基因拟南芥种子再次播种于含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转TaWRKY13基因拟南芥。将其中3个T3代纯合转TaWRKY13基因拟南芥株系分别命名为35S：：TaWRKY13#1(或35S：：TaWRKY13 OE#1)、35S：：TaWRKY13#2(或35S：：TaWRKY13 OE#2)和35S：：TaWRKY13#3(或35S：：
TaWRKY13 OE#3)，并进行后续实验。

[0110] 按照上述方法，将GV3101/pCAMBIA1302-TaWRKY13替换为GV3101/pCAMBIA1302，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。

[0111] 三、分子鉴定

[0112] 待测拟南芥种子为35S：：TaWRKY13#1的T3代种子、35S：：TaWRKY13#2的T3代种子、35S：：TaWRKY13#3的T3代种子、转空载体拟南芥种子或野生型拟南芥种子。

[0113] (1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。

[0114] (2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。

[0115] (3)提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-ATGGGCGAGGGCGCGGT-3’和5’-TCACAAGAACTGAAAGTACTCGAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约699bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为阳性苗。

[0116] 结果表明，35S：：TaWRKY13#1的T3代种子、35S：：TaWRKY13#2的T3代种子、35S：：TaWRKY13#3的T3代种子获得的幼苗均为阳性苗。

[0117] 四、转TaWRKY13基因拟南芥的耐盐性鉴定

[0118] MS0固体培养基记载于如下文献中：Du,Y.T.；Zhao,M.J.；Wang,C.T.；Gao,Y.；Wang,Y.X.；Liu,Y.W.；Chen,M.；Chen,J.；Zhou,Y.B.；Xu,Z.S.；Ma,Y.Z.,Identification and characterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress.BMC Plant Biol.2018，18，(1),320.

[0119] 待测拟南芥种子为35S：：TaWRKY13#1的T3代种子、35S：：TaWRKY13#2的T3代种子、35S：：TaWRKY13#3的T3代种子、转空载体拟南芥种子或野生型拟南芥种子。

[0120] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

[0121] 1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化3天。

[0122] 2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)4天，得到待测拟南芥幼苗。

[0123] 3、完成步骤2后，取60株生长状态基本一致的待测拟南芥幼苗，随机分成三组，每组20株；然后进行如下处理：

[0124] 第一组：将待测拟南芥幼苗转移至MS0固体培养基上，竖直培养10天；

[0125] 第二组：将待测拟南芥幼苗转移至含100mMNaCl的MS0固体培养基上，竖直培养10天；

[0126] 第三组：将待测拟南芥幼苗转移至含120mMNaCl的MS0固体培养基上，竖直培养10天。

[0127] 4、完成步骤3后，观察各组待测拟南芥幼苗的表型，统计总根长和根系表面积并按组求平均值。

[0128] 实验结果见图3(A为各组待测拟南芥幼苗的表型，B为总根长统计结果，C为根系表面积统计结果，MS0为第一组，100mMNaCl为第二组，120mMNaCl为第三组，Col-0为野生型拟南芥)。结果表明，在MS0固体培养基上，野生型拟南芥、3个T3代纯合转TaWRKY13基因拟南芥株系(35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3)和转空载体拟南芥的表型、总根长和根系表面积均无显著差异；一定浓度的NaCl处理后，与野生型拟南芥相比，3个T3代纯合转TaWRKY13基因拟南芥株系(35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3)的总根长和根系表面积均显著增加。转空载体拟南芥和野生型拟南芥的总根长和根系表面积均无显著差异。

[0129] 上述结果表明，在野生型拟南芥中过表达TaWRKY13基因可以提高拟南芥的耐盐性；耐盐性提高表现为：总根长增加和根系表面积增加。

[0130] 实施例4、转TaWRKY13基因水稻的获得及鉴定

[0131] 一、重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13的构建和重组农杆菌的获得

[0132] 1、以实施例3步骤一中3得到的重组质粒pCAMBIA1302-TaWRKY13为模板，采用TaWRKY13-1305-F：5’-TTACTTCTGCACTAGGTACCATGGCCCTGGACTCCGT-3’(下划线为限制性内切酶NcoI的识别位点)和TaWRKY13-1305-R：5’-CGGACTTAAGACTAGTTCACAAGAACTGAAAGTACTCGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0133] 2、用限制性内切酶NocI和EcoRI酶切步骤1得到的PCR扩增产物，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收约699bp的DNA片段。

[0134] 3、用限制性内切酶NocI和EcoRI酶切pCAMBIA1305载体，回收约11.846kb的载体骨架。

[0135] 4、将DNA片段和载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13。

[0136] 将重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13为将pCAMBIA1305载体的限制性内切酶NcoI和EcoRI之间的DNA小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13表达序列表中序列2所示的蛋白质TaWRKY13。

[0137] 5、将重组质粒pCAMBIA1305-TaWRKY13导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1305-TaWRKY13。将pCAMBIA1305载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1305。

[0138] 二、转TaWRKY13基因水稻的获得

[0139] 将EHA105/pCAMBIA1305-TaWRKY13转化至日本晴，然后通过自交，获得T3代纯合转TaWRKY13基因水稻，具体方法参考如下文献：Mei-Rong，X.U.，Xia,Z.H.，Zhai，W.X.，Jian-Long，X.U.，Zhou,Y.L.，&Zhi-Kang，L.I.(2008).Construction of double right-border binary vector carrying non-host gene rxo1 resistant to bacterial leaf streak of rice.Rice Science，15(3)，243-246.。其中筛选阳性苗的方法为：提取待测水稻幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用TaWRKY13-1305-F和TaWRKY13-1305-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约699bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的水稻幼苗为阳性苗。

[0140] 按照上述方法，将EHA105/pCAMBIA1305-TaWRKY13替换为EHA105/pCAMBIA1305，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体水稻的植株，简称转空载体水稻。

[0141] 三、实时荧光定量检测转TaWRKY13基因水稻中TaWRKY13基因的表达量[0142] 1、分别将各个T3代纯合转TaWRKY13基因水稻生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。将转空载体水稻生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。取日本晴种子，28℃光暗交替培养10天，得到待测水稻幼苗；将该待测水稻幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

[0143] (2)采用Trizo1法提取待测样本的总RNA，然后采用反转录试剂盒(TransGen公司的产品)反转录出第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，实时定量PCR检测TaWRKY13基因的相对表达量(OsActin基因为内参基因)。

[0144] 检测TaWRKY13基因的引物为5’-CCCTGCGACAAAACAAGTCC-3’和5’-TAAGCGCCTCTGTCGTTCTG-3’。

[0145] 检测OsActin基因的引物为5’-GCAGAAGAACGGCATCAAGGT-3’和5’-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGCT-3’。

[0146] 结果表明，日本晴和转空载体水稻中TaWRKY13基因的相对表达量无显著差异；与日本晴相比，各个T3代纯合转TaWRKY13基因水稻中TaWRKY13基因的相对表达量均有不同程度的增加，其中3个T3代纯合转TaWRKY13基因水稻株系中TaWRKY13基因的相对表达量最高，将其依次命名为35S：：TaWRKY13#1(或35S：：TaWRKY13 OE#1)、35S：：TaWRKY13#2(或35S：：TaWRKY13 OE#2)和35S：：TaWRKY13#3(或35S：：TaWRKY13OE#3)，并进行后续实验。

[0147] 四、转TaWRKY13基因水稻的耐盐性鉴定

[0148] 待测水稻种子为35S：：TaWRKY13#1的T3代种子、35S：：TaWRKY13#2的T3代种子、35S：：TaWRKY13#3的T3代种子、转空载体水稻种子或日本晴种子。

[0149] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

[0150] 1、取待测水稻种子，用0.7％(v/v)过氧化氢水溶液浸泡过夜，清水洗涤3次；然后37℃光暗交替培养至露白芽(约2天)。

[0151] 2、完成步骤1后，将待测水稻种子移至剪去下部的96孔板上，每个孔放置一粒待测水稻种子，然后将所述96孔板置于清水中，37℃光暗交替培养1周；向清水加入营养液，混匀，然后37℃光暗交替培养1周，得到两叶一心时期的待测水稻幼苗。

[0152] 营养液的配方记载于如下文献中：宁蕾，王曙光，琚鹏举，柏星轩，葛林豪，&齐欣，et al.(2018).过表达谷子siant1对水稻耐盐性的影响.中国农业科学，v.51(10)，23-34.[0153] 3、完成步骤2后，取48株生长状态基本一致的待测水稻幼苗，随机分成两组，每组24株；然后进行如下处理：

[0154] 实验组：将待测水稻幼苗置于0.7％(m/v)NaCl水溶液中，37℃光暗交替培养5天。

[0155] 对照组：将待测水稻幼苗置于水中，37℃光暗交替培养5天。

[0156] 4、完成步骤3后，观察各组待测水稻幼苗的表型，测定脯氨酸含量和丙二醛含量并按组求平均值。

[0157] 实验结果见图4(A为各组待测水稻幼苗的表型，B为脯氨酸含量测定结果，C为丙二醛含量测定结果)。

[0158] 结果表明，对照组中，日本晴、3个T3代纯合转TaWRKY13基因水稻株系(35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3)和转空载体水稻的表型、脯氨酸含量和丙二醛含量均无显著差异；0.7％(m/v)NaCl水溶液处理5天后，与日本晴相比，3个T3代纯合转TaWRKY13基因水稻株系(35S：：TaWRKY13#1、35S：：TaWRKY13#2和35S：：TaWRKY13#3)的株高和脯氨酸含量均显著增加，丙二醛含量则显著降低，转空载体水稻和日本晴的株高、脯氨酸含量和丙二醛含量均无显著差异。

[0159] 上述结果表明，在日本晴中过表达TaWRKY13基因可以提高水稻的耐盐性；耐盐性提高表现为：株高增加、脯氨酸含量增加和丙二醛含量降低。