一种仿刺参葡聚糖结合蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明属于分子生物学领域和基因工程技术领域，具体公开了一种仿刺参葡聚糖结合蛋白及其制备方法和应用。本发明利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ‑GBP，仿刺参葡聚糖结合蛋白(AJ‑GBP)优选为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。该重组蛋白对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌具有凝集作用，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌具有抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

权利要求

1.一种仿刺参葡聚糖结合蛋白，其特征在于，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.编码权利要求1所述的仿刺参葡聚糖结合蛋白的氨基酸序列的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的DNA分子的重组表达载体或转基因细胞系统。

5.含有权利要求2或3所述的DNA分子的转基因重组菌。

6.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将所述的DNA分子插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的重组表达载体，其中，所述大肠杆菌表达载体为pEASY-E2。

7.如权利要求5所述的转基因重组菌，其特征在于，所述转基因重组菌是将重组表达载体导入大肠杆菌中筛选得到。

8.权利要求2所述的DNA分子在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

9.权利要求4所述的重组表达载体在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

10.权利要求4所述的转基因细胞系统在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

11.权利要求5所述的转基因重组菌在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

12.一种权利要求1所述的葡聚糖结合蛋白的制备方法，其特征在于，制备方法如下：以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增；

PCR产物经纯化后与大肠杆菌载体pEASY-E2载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子；

将表达载体pEASY-AJ-GBP转入Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用超滤管纯化重组蛋白，即得葡聚糖结合蛋白AJ-GBP；

其中，所述引物分别为：F1：5’-ATGACCGCCGGTGGTGGAGG-3’；R1：5’-GCACCAGGATCGACGCTCAAG-3’。

13.权利要求1所述的仿刺参葡聚糖结合蛋白的应用，其特征在于，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP用于制备广谱抗菌类制剂或饲料添加剂。

14.权利要求1所述的仿刺参葡聚糖结合蛋白的应用，其特征在于，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP用于制备抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌的药物制剂或饲料添加剂。

说明书

一种仿刺参葡聚糖结合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种仿刺参葡聚糖结合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003] 仿刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺参科(Stichopodidae)，素有“海中人参”的美誉，具有很高的营养价值和医药价值。其在我国山东、辽宁和河北附近海域分布较为广泛。近年来，随着人们社会生活条件的提高和健康意识的增强，仿刺参市场需求量逐年增加，不断刺激养殖规模加大，仿刺参因此成为我国水产养殖业中单一产值最大的养殖品种。但是养殖过程中遇到的病害问题一直是困扰产业进一步发展的重要制约因素。而所使用化学药物，如二氧化氯、高锰酸钾、福尔马林及抗生素等进行治疗，对仿刺参在不同程度上都有一定的毒性作用。因此利用生物技术的手段进行疾病防治越来越引起人们的重视。

[0004] 天然抗菌物质广泛存在于动植物中。目前，从动植物中分离的抗菌物质主要有生物碱、萜类、黄酮、多酚、多糖、有机酸、多肽、蛋白等，不同的活性成分，其结构组成不同，抗菌抑菌作用机制也不同。其中，抗菌蛋白是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的大分子蛋白质。然而，发明人发现，目前针对较易合成获得的小分子抗菌肽研究较多，而对大分子抗菌蛋白研究较少，特别是基于仿刺参制备相关抗菌蛋白的研究鲜有报道，不利于仿刺参产品的质量安全以及相关食品产业的健康发展。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种仿刺参葡聚糖结合蛋白及其制备方法和应用。通过对仿刺参β-1,3-葡聚糖结合蛋白的研究，为寻找新的仿刺参病害防控、良种选育的策略提供思路，有利于促进我国仿刺参养殖业的健康、可持续发展。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0007] 本发明的第一个方面，提供一种仿刺参葡聚糖结合蛋白，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有90％以上(含90％)序列同源性；更优选的，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

[0008] 本发明的第二个方面，提供了编码上述氨基酸序列的DNA分子。

[0009] 进一步的，本发明提供一种编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同源性，且能够表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

[0010] 本发明的第三个方面，提供含有编码所述仿刺参葡聚糖结合蛋白的氨基酸序列的DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

[0011] 本发明的第四个方面，提供所述的DNA序列、所述重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

[0012] 本发明的第五个方面，提供一种葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的制备方法，包括如下步骤：

[0013] 以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增；

[0014] PCR产物经纯化后与大肠杆菌表达载体pEASY-E2载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子，得表达载体pEASY-AJ-GBP；

[0015] 将上述表达载体pEASY-AJ-GBP转入Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用超滤管纯化重组蛋白，即得葡聚糖结合蛋白AJ-GBP。

[0016] 本发明的第六个方面，提供上述仿刺参葡聚糖结合蛋白的应用，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP用于制备广谱抗菌类药物制剂或饲料添加剂。

[0017] 进一步的，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白用于制备抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌的药物制剂或饲料添加剂。

[0018] 本发明具有如下有益技术效果：

[0019] 本发明首次利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP，经试验验证，该重组蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有明显抑制作用，具体的，该重组蛋白对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌具有凝集作用，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌具有抑制作用，因此在开发新型广谱抗菌药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。

附图说明

[0020] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0021] 图1为本发明实施例1中的SDS-PAGE检测到的蛋白表达图，1为MARKER1，分子量从大到小依次为100kDa、60kDa、45kDa、28kDa、18kDa，2为MAKER2,分子量从大到小依次为97.2kDa、66.4kDa、44.3kDa、29kDa、20.1kDa、14.3kDa，3道为诱导表达细胞破碎后上清中蛋白，4道为未诱导菌体的蛋白，5道为诱导表达后包涵体溶解纯化后的蛋白，6道为诱导表达后包涵体蛋白，7、8、9、10道分别为超滤过程中第一、二、三、四次滤液。

[0022] 图2为本发明实施例2提供的仿刺参葡聚糖结合蛋白对细菌的凝集作用图，其中图2(1)为枯草芽孢杆菌，图2(2)为金黄色葡萄球菌，图2(3)为藤黄短小杆菌，图2(4)为鳗弧菌，图2(5)为大肠杆菌，图2(6)为绿脓杆菌。

[0023] 图3为本发明实施例3提供的仿刺参葡聚糖结合蛋白抑菌活性图，其中图3(1)为枯草芽孢杆菌生长曲线图，图3(2)为藤黄短小杆菌生长曲线图，图3(3)为金黄色葡萄球菌生长曲线图，图3(4)为鳗弧菌生长曲线图，图3(5)为大肠杆菌生长曲线图，图3(6)为绿脓杆菌生长曲线图。

[0024] 图4为本发明实施例4提供的仿刺参葡聚糖结合蛋白细菌结合活性图，其中4A为菌体结合的蛋白，图4B为第四次洗涤液的蛋白；其中图4A和图4B中1为MAKER，2为大肠杆菌，3为枯草芽孢杆菌，4为金黄色葡萄球菌，5为鳗弧菌，6为藤黄短小杆菌，7为绿脓杆菌。

[0025] 图5为本发明实施例5提供的仿刺参葡聚糖结合蛋白葡聚糖结合活性图。

具体实施方式

[0026] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0027] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0028] 如前所述，基于仿刺参制备相关抗菌蛋白的研究成果甚少，因此不利于仿刺参产品的质量安全以及相关食品产业的健康发展。

[0029] 研究发现，β-1,3-葡聚糖结合蛋白(β-1,3-glucan-binding proteins,简称GBP)，又称β-1,3-葡聚糖识别蛋白(beta-1,3-glucan recognition protein,简称GRP)，与脂多糖葡聚糖结合蛋白(lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein，简称LGBP)属于同一基因的不同亚型。GBP有识别非己物质，激活前酚氧化酶系统，激活凝血级联系统和激活导致一系列细胞毒素因子/细胞溶解因子/抗菌因子释放的血细胞脱粒等功能。而目前对于仿刺参葡聚糖结合蛋白抗菌作用尚未有报道。因此发掘仿刺参的功能基因，制备生物抗菌药物，有助于解决当前养殖中抗生素抗药性问题，具有十分重要的理论和现实意义。

[0030] 有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种仿刺参葡聚糖结合蛋白，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性；更优选的，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

[0031] 本发明的又一具体实施方式中，提供上述氨基酸序列的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的葡聚糖结合蛋白的核苷酸序列。对于编码本发明所述仿刺参葡聚糖结合蛋白的氨基酸序列的DNA分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于仿刺参葡聚糖结合蛋白的氨基酸序列的DNA分子。

[0032] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2具有至少90％的同源性，且能够表达SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

[0033] 需要说明的是，术语“同源”主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。

[0034] 本发明的又一具体实施方式中，提供含有编码所述仿刺参葡聚糖结合蛋白的氨基酸序列的DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

[0035] 所述重组表达载体，是将所述DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的重组表达载体。

[0036] 所述大肠杆菌表达载体为pEASY-E2。

[0037] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

[0038] 所述的DNA序列、所述重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在制备仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP中的应用。

[0039] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种葡聚糖结合蛋白AJ-GBP的制备方法，包括如下步骤：

[0040] (1)以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，待用；

[0041] (2)PCR产物经纯化后与大肠杆菌表达载体pEASY-E2载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测序鉴定重组子；

[0042] (3)将上述表达载体pEASY-AJ-GBP转入Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞，筛选转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用超滤管纯化重组蛋白，即得到葡聚糖结合蛋白AJ-GBP。

[0043] 所述引物分别为：

[0044] F1:5’-ATGACCGCCGGTGGTGGAGG-3’(SEQ ID NO.3)；

[0045] R1:5’-GCACCAGGATCGACGCTCAAG-3’(SEQ ID NO.4)。

[0046] 本发明的又一具体实施方式中，提供仿刺参葡聚糖结合蛋白的应用，所述仿刺参葡聚糖结合蛋白AJ-GBP用于制备广谱抗菌类药物制剂或饲料添加剂。

[0047] 本发明的又一具体实施方式中，提供所述仿刺参葡聚糖结合蛋白用于制备抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌和鳗弧菌的药物制剂或饲料添加剂。

[0048] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0049] 实施例1：仿刺参AJ-GBP编码区的原核重组表达

[0050] 具体步骤如下：

[0051] 1.原核重组表达载体的构建

[0052] 本发明采用北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司的pEASY-E2原核表达载体。利用特异性引物PCR扩增AJ-GBP的全部编码区。PCR反应程序设置为：①94①预变性4min；②94①变性30s；③52①复性30s；④72①延伸1min；⑤72①终延伸10min。将步骤②③④进行40个循环。将PCR产物进行纯化回收，与pEASY-E2载体连接。连接产物转化大肠杆菌Trans BL21(DE3)pLysS，挑选5～10个单个菌落接种于LB液体培养基，并送测序公司测序，以验证阅读框的正确性，所述特异性引物分别为：

[0053] F1:5’-ATGACCGCCGGTGGTGGAGG-3’；

[0054] R1:5’-GCACCAGGATCGACGCTCAAG-3’。

[0055] 重组蛋白的表达：将验证正确的菌株接种于50mL的LB液体培养基，置于振荡培养箱中，37①200rpm中培养12～16小时，然后将此培养液以1:100的比例接种于新LB的500mL液体培养基中，37①培养至OD600＝0.6。加入IPTG，使之终浓度达到0.8mM，37①培养5h。收集细胞用PBS缓冲液清洗3遍后重悬，细胞破碎后10000g离心20min,取沉淀包涵体蛋白用Buffer A(5mM EDTA，50mM Tris-HCL)清洗2次，Buffer B(5mM EDTA,50mMTris-HCL,2M尿素)清洗2次，使用Buffer C(10mMTris-HCL,0.1MNaH2PO4,8M尿素)溶解后，用0.45μm滤膜过滤后，使用Millipore10kd超滤离心管纯化重组蛋白，即可得到如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白。

[0056] >AJ-GBP-aa

[0057] MTAGGGGNWEFQYYTNNRSNSYVRDNTLYIKPTLTSEKEGEAFLTSGTLNLWGASPADLCTGNNWWGCERTGSFNNILNPIQSARLRTVNSFAFKHGRIEVFAQLPKGDWLWPAIWLLPKRNAYGGWPASGEIDLVESRGNRNLRAADGTHVGAEQVGMTLHWGPYWPLNGYPMTHNAKNLPDGQTFGDGFHNYTLVWTADSLDFYLDGEPILERRSWC[0058] 序列特征：

[0059] 长度：219个氨基酸

[0060] 类型：氨基酸

[0061] 链型：单链

[0062] 拓扑结构：线型

[0063] 特征：特征：分子量为24.64kDa，等电点为5.94。具有两个蛋白激酶C磷酸化位点(S36EK，S83AR)，三个酪蛋白激酶II磷酸化位点(S36EKE,S55PAD,T186FGD)，一个β-1,3-葡聚糖酶位点(W127-E132-I133-D134) ,一个β-1,3-多糖连接识别基序(FHNYTLVWTADSLDFYLDG),一个多糖结合基序(VFAQLPKGDWLWPAIWLLP)和一个葡聚糖酶基序(WPASGEIDLVES)。此外，AJ-GBP没有虾β-GRP特有的细胞粘着位点RGD,而在氨基酸序列的
107位置发现KGD。

[0064] 来源：仿刺参

[0065] 实施例2：仿刺参AJ-GBP编码区的原核重组蛋白的细菌凝集活性分析

[0066] 对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄短小杆菌(Curtobacteriumluteum)(G+菌)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(G-菌)的凝集实验[0067] 将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄短小杆菌接种到LB液体培养基中，37①培养至OD600值至0.6，鳗弧菌采用TCBS培养基在28①培养至OD600值至0.6，然后用无菌生理盐水稀释至OD600值为0.001，然后5000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用TBS缓冲液洗涤三次后重悬，使菌浓度调至2×109个细胞/mL。将75μL重组蛋白(约600μg/ml)分别加入96孔板中，然后加入30μL菌液，室温孵育1h，阴性对照组将重组蛋白用牛血清白蛋白(BSA)代替。结果发现重组蛋白可以凝集上述6种检测菌。

[0068] 实验表明重组AJ-GBP蛋白能够有效凝集革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

[0069] 实施例3：仿刺参AJ-GBP原核重组蛋白的抑菌活性分析

[0070] 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄短小杆菌(G+菌)和鳗弧菌、大肠杆菌、绿脓杆菌(G-菌)的生长抑制实验

[0071] 将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄短小杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37①培养至OD600值至0.6，鳗弧菌接种到TCBS培养基在28①培养至OD600值至0.6，用新鲜培养基稀释20倍后备用。在96孔细胞培养板中每孔各加入100μl菌液和100μl重组蛋白混匀，设置培养温度为37①培养3h后，每隔30min用酶标仪记录一次OD600值，约7-8h达到生长平台期，BSA设为对照组，统计OD600值绘制不同组的生长曲线，每组设置3个平行。

[0072] 实验表明重组AJ-GBP蛋白能够抑制革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌也有抑制作用，但对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑制作用不明显。

[0073] 实施例4：仿刺参AJ-GBP编码区的原核重组蛋白的细菌结合活性分析

[0074] 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄短小杆菌(G+菌)和鳗弧菌、大肠杆菌、绿脓杆菌(G-菌)的结合实验

[0075] 将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄短小杆菌、绿脓杆菌和大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37①培养至OD600值至0.6，鳗弧菌接种到TCBS培养基在28①培养至OD600值至0.6，然后5000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用TBS缓冲液洗涤三次后重悬，使菌浓度调至
3.5×108个细胞/mL。取200uL菌悬液与200uL重组蛋白(约600μg/ml)混匀，室温下震荡孵育
30min。5000rpm离心10分钟弃上清液收集菌体，TBS洗涤菌体4次后，第四次洗涤液和菌体分别加入蛋白上样缓冲液沸水浴10min，离心收集上清后，进行SDS-PAGE以及Western blotting检测目的条带。

[0076] 实验表明重组AJ-GBP蛋白对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有明显的结合活性；且重组AJ-GBP蛋白能够有效抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌也有明显的抑制作用。

[0077] 实施例5：仿刺参AJ-GBP编码区的原核重组蛋白的葡聚糖、脂多糖、肽聚糖结合活性分析

[0078] 将80μl/ml的葡聚糖、脂多糖、肽聚糖分别取50μl加入高亲和性的96孔板中，37①过夜晾干；次日60①孵育30min；每孔加入200μl含5％脱脂奶粉的PBS，于37①封闭2h；倒掉封闭液，每孔加入200μl的PBST(20％Tween-20:PBS＝1:100)洗四次，每次5min；每孔加入50μl蛋白(蛋白用含1％脱脂奶粉的PBS二倍梯度稀释，共六组蛋白；对照组使用BSA)；倒掉蛋白，每孔加入200μl的PBST(20％Tween-20:PBS＝1:100)洗四次，每次5min；将一抗(大鼠抗His-tag抗体)按照1:300的比例稀释于含1％脱脂奶粉的PBS中，每孔加入100μl，室温条件下反应2h；倒掉一抗，每孔加入200μl的PBST(20％Tween-20:PBS＝1:100)洗四次，每次5min；将辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠二抗按照1:3000的比例稀释于含1％脱脂奶粉的PBS中，每孔加入100μl，室温条件下反应2h；倒掉二抗，每孔加入200μl的PBST(20％Tween-
20:PBS＝1:100)洗四次，每次5min；使用上海生工EL-TMB显色试剂盒进行显色，在酶标仪
450nm处读取吸光值。

[0079] 实验表明重组AJ-GBP蛋白对葡聚糖有明显的结合活性，而且结合强度与蛋白浓度成正比，而对脂多糖、肽聚糖没有明显的结合活性。

[0080] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围。