一株加速堆肥腐熟的耐高温芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8及其应用转让专利
申请号 : CN201910247608.7
文献号 : CN110066746B
文献日 : 2019-12-27
发明人 : 沈其荣 , 李荣 , 徐谞 , 刘超 , 何宙阳 , 刘东阳
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
本发明提供一株加速堆肥腐熟的耐高温芽孢杆菌属细菌NJAU‑ND8及其应用。所述的芽孢杆菌属细菌NJAU‑ND8的保藏编号为CGMCC No.16737，所述的菌株的应用为其加速堆肥发酵。步骤如下：将畜禽粪污与辅料按照一定C/N混匀后接种液体菌种，砌成条垛后，采用条垛式发酵工艺，翻抛发酵。相比于对照不添加菌种，菌种的添加有效促进了堆肥初期堆体温度的升高，促使堆体提前进入降温期，促进堆肥产品发芽指数的提高和促使堆体C/N提前降至腐熟范围。
权利要求 :
1.一种具有加速堆肥腐熟的高温芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.) NJAU-ND8，其特征在于所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年
11月 12日，保藏编号为CGMCC No.16737。
2.权利要求1所述的高温细菌NJAU-ND8在高温堆肥生产有机肥中的应用。
3.采用权利要求1所述的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8生产有机肥的方法，其特征在于包括：将权利要求1所述的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8接种至堆体中混匀得到有机肥发酵基料，发酵过程每2天翻抛一次，发酵30天后结束，最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为成品有机肥。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于堆肥过程中控制堆肥发酵温度，发酵时间，翻堆次数，使堆肥含水量低于30%，色泽发黑。
5.权利要求3 所述的方法，其特征在于：所述的堆体的C/N比在发酵9天后即从25降至
15-17；发芽率在发酵9天后即≥60%，30天后≥90%；堆体温度在发酵10天后即进入降温期。
6.按照权利要求3-5中任一项所述的方法制备的有机肥。
说明书 :
一株加速堆肥腐熟的耐高温芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业微生物领域，提供一株加速堆肥腐熟的芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.) NJAU-ND8及其应用。
背景技术
[0002] 我国的畜禽养殖业已经进入规模化蓬勃发展阶段，大规模的集约化养殖企业迅速涌现， 这在确保我国人民对肉类、蛋类等产品需求同时，同样产生的大量的养殖废弃物，这些养 殖废弃物如不能经过有效处理，将会成为潜在的环境污染。然而，在农业部启动“减肥减 药”行动中，这些养殖场废弃物的肥料化，在确保养殖业健康发展的前提下，同样能够提 供大量的替代化肥的优质有机肥料。因此，提升有机肥生产技术，发展产业化和商品化的 精制有机肥、有机无机复合肥成为有效解决养殖污染的保障。但传统的堆肥方式和技术已 经不能适应于商品有机肥的发展，同时，现有的现代化堆肥技术，均需要高效堆肥菌种的 辅助，进而提高发酵效率，降低生产成本，提高堆肥附加值。
[0003] 为加快有机物料的降解速度，提高堆肥的腐殖化程度，近年来国内外学者对堆肥过程 中的微生物过程进行了一系列研究。由于堆肥是一系列由微生物活动主导的，兼具物理、 化学、生物各种变化的复杂过程，而微生物的活动则会影响堆肥的时间和堆肥产品质量， 因此在堆肥过程中加入微生物菌剂来增加微生物数量、调节菌群结构，是一种促进堆肥快 速腐熟的有效方法。但目前整个堆肥行业，仍存在部分堆肥菌种不稳定，堆肥效果促进效 果不强等缺点，因此，开发更多的高温或耐高温菌种，利用工厂化实际堆肥，评估菌株的 促进效果，变的异常重要。
[0004] CN 105524858 A公开了一种腐熟有机废弃物的耐高温腐熟菌剂，枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)H1-7。所述H1-7菌剂，在55℃的环境中生长良好，55℃时的α-淀 粉酶活可达62.1U/mL，蛋白酶活为673.2U/mL，纤维素酶活为6.75U/mL。通过堆肥初 期接种耐高温H1-7菌剂，快速提高堆体温度，耐高温菌剂能在高温环境下能够维持较好的 降解效果，具有更强的环境适应性，加速了堆肥化进程。CN 106957807A一种地衣芽孢杆 菌菌株TA65及其在促进堆肥腐熟中的应用。CN 106978367A公开了一种脲芽孢杆菌菌株 TB42及其在促进堆肥腐熟中的应用。这两菌株耐高温，增长繁殖快，且能够产木质纤维素 降解酶；其菌剂能够提高堆肥温度，加速有机质降解和水溶有机质(DOM)降解，提高凯氏氮 的含量，促进堆肥腐熟；还具有产生物表面活性剂的功能。CN 104560817B公开了一株产 植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)UTM102菌株及其应用。UTM102菌 株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好 氧堆肥发酵，能够适应高温的环境，并能在有机固体废弃物中大量增殖，堆体升温速度快、 温度高，腐熟快，并能加速降解有机物，减量化、无害化更为彻底，可将有机固体废弃物 转化成生物肥料，此肥料中含有的大量地衣芽孢杆菌可抑制植物病原菌，对植物生长能够 起到促进作用，可以提高作物的产量。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株具有加速堆肥腐熟的 解淀粉芽孢杆菌。
[0006] 本发明提供了所述菌种在促进堆肥腐熟中的用途。
[0007] 本发明测定了提供的芽孢杆菌属细菌在50℃高温下培养1天的产多种酶活能力。
[0008] 一种具有加速堆肥腐熟的高温芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)NJAU-ND8，其特征在于所 述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年11月 12日，保藏编号为CGMCC No.16737。
[0009] 所述的耐高温枯草芽孢杆菌NJAU-ND8，其生理学特征是：
[0010] (1)菌种有效活菌数高，采用液态接种体，浓度大于109cfu/ml；
[0011] (2)耐高温，能够在55度高温下生长；
[0012] (3)耐盐，能够在含盐15％的培养基中生产；
[0013] (4)菌株NJAU-ND8被鉴定为芽孢杆菌属细菌，对作物无害，对人和动物无致病性。
[0014] (5)菌株在LB液体培养基55℃，170r/min水平震荡培养1d测定产酶值，外切-β-1、 4-葡聚糖酶活力达到1.2813U，内切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到1.2326U，β-葡聚糖苷酶的 酶活力达到4.4221U，中性木聚糖酶活力达到1265.4149U，滤纸酶活力达到0.012494U，中 性蛋白酶活力达到2.2983U，β-淀粉酶活力达到0.08242U。
[0015] 本发明所述的高温细菌NJAU-ND8在高温堆肥生产有机肥中的应用。
[0016] 采用所述的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8生产有机肥的方法，包括：将权利要求1所述 的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8接种至堆体中混匀得到有机肥发酵基料，发酵过程每2天翻 抛一次，发酵30天后结束，最后在温度不超过50℃的条件下将有机肥的含水量蒸发至30％ 以下，包装出厂即为成品有机肥。
[0017] 所述的方法，优选包括如下步骤：
[0018] (1)原料混合：将猪粪、木屑和蘑菇渣按照堆体C/N 24:1-26:1配比混合，初始含水率调 节至55-65％，采用液态接种体，接种量为9.5-10.5mg/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌 成条垛状，堆体基料宽1.1-1.2m，高1.4-1.5m，长度不限；
[0019] (2)堆肥发酵：有机肥发酵基料按条垛式堆放于发酵棚内后，采用人工翻堆发酵，堆心 温度达40℃以上时开始翻堆，2天翻堆1次，在堆肥第10天后堆体开始降温，整个堆肥过 程中堆温50℃以上维持10天以上；
[0020] 本发明所述的方法优选，堆肥过程中控制堆肥发酵温度，发酵时间，翻堆次数，堆肥 结束时使堆肥含水量低于30％，色泽发黑。
[0021] 其中，所述的液态接种体优选由以下生产工艺实现：
[0022] 将-80℃甘油管保存的NJAU-ND8菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培 养小时，挑取NJAU-ND8单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液 作为种子液，以1％(v/v)的接种量将一种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养 至对数中期，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。
[0023] 本发明所述的方法，优选接菌堆体的C/N比在发酵9天后即从25降至15-17；发芽率 在发酵9天后即≥60％，30天后≥90％；堆体温度在发酵10天后即进入降温期。
[0024] 在发酵过程中，堆体自然升温，保持50℃以上10天。在第10天堆体温度开始降低， 发芽指数大于60％，C/N小于17，均表示加菌堆体已经腐熟。表明菌株的添加显著驱动了 堆肥的进行，提高了堆肥的效率。
[0025] 按照上述的方法生产的有机肥。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明主要利用分离筛选出的能够加速堆肥腐熟的芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8生产有 机肥。该菌株耐高温，生长繁殖快，具有高效产木质纤维类酶活能力。与不接菌的对照堆 体相比，接种NJAU-ND8堆体的C/N比在发酵9天后即从25降至16左右；发芽率在发酵 9天后即≥60％，30天后≥90％；堆体温度在发酵10天后即进入降温期。接种液态接种体 后的堆肥效率得到大幅度提高。
附图说明
[0028] 图1为基于菌株NJAU-ND8的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树[0029] 图2为温度随堆肥时间的变化曲线。室温，空白组(CK)，试验组(NJAU-ND8)[0030] 图3为pH随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，试验组(NJAU-ND8)
[0031] 图4为C/N随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，试验组(NJAU-ND8)
[0032] 图5为发芽指数随堆肥时间的变化曲线。空白组(CK)，试验组(NJAU-ND8)[0033] 生物材料保藏信息
[0034] NJAU-ND8，分类命名为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，保藏日期为2018年11月12日，保藏编号为CGMCC No.16737。
具体实施方式
[0035] 实施例1、功能菌株的分离和鉴定
[0036] 将堆肥高温期样品加入带玻璃珠并装有100ml无菌水的250ml锥形瓶中，25℃、170 r/min振荡20min形成土壤悬液，分别吸取10-2、10-3、10-4、10-5稀释倍数的肥料悬液0.1ml， 涂布于木质纤维素培养平板上，每个浓度3个重复，28℃培养5天后，在平板上挑生长的 菌落纯化5次以上，选取仍然可以生长的菌落转至斜面培养，4℃保藏备用。
[0037] 通过定性和定量筛选最终获得一株细菌命名为NJAU-ND8，菌株NJAU-ND8在LB平 板上的菌落较大，呈淡白色，边缘呈散射状，菌体较柔软，具有一定的黏稠性，易挑起。 淀粉分解呈阳性、色氨酸分解呈阴性，利用LB液体培养基培养，在3％～15％NaCl和25～55℃ 环境下仍然具有较强的活性。用NJAU-ND8菌株的16S rDNA序列登录号(MK450453) 为所构建发育树表明NJAU-ND8与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens(CP000560) 同源性达到99％，与枯草芽孢杆菌\地衣芽孢杆菌、脲芽孢杆菌、嗜热地衣芽孢杆菌不属于 同种微生物。结合菌株的形态特征、理化特征和16S rDNA序列分析，将菌株NJAU-ND8 初步鉴定为芽孢杆菌属细菌。将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.16737。
[0038] 表1芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8不同温度下培养情况(5％NaCl)
[0039]
[0040]
[0041] (++：生长情况良好；+：可以生长；—：不能生长；下表同)
[0042] 表2芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8不同盐浓度下培养情况(37℃)
[0043]
[0044] 本专利同样比较了专利菌株NJAU-N30与目前已发表的其他菌株的差异，根据形态和 生理生化特征，本专利菌株显而易见的不同于已发表菌株(表3)。
[0045] 表3菌株NJAU-N30与其他已发表菌株的差异
[0046]
[0047] 实施例2、NJAU-ND8产多种酶活的测定
[0048] 使用LB培养基作为NJAU-ND8产酶培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，1000ml 去离子水，pH 7.0，121℃灭菌20min。用3ml无菌水将菌体制成菌悬液，取0.5ml分别接 种于产酶培养基中，50℃下170r/min摇床震荡培养。24小时取菌液，加入提取液提取后， 利用超声破碎仪(300W，超声3s，间隔7s，持续3min)进行细胞膜破碎形成原液。
[0049] 纤维素酶活性的测定参照Albrecht et al.(2008)的方法。将原液与醋酸缓冲液(50mM, pH 5)以1:5混合(W/V)，于水平摇床振荡1h后，10000r/min 4℃离心10min制得粗酶 液。该酶活的测定使用二硝基水杨酸法(DNS)，基于50℃反应1h后体系中还原糖的产 生量。反应体系为0.5ml粗酶液，0.5ml 1％醋酸羧甲基纤维素(50mM，pH 6)溶液。反 应液于520nm下测定吸光度。酶活单位定义：1U定义为每毫升样品每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位(μg/min/ml)。
[0050] 中性蛋白酶酶活的测定参照Albrecht et al.(2008)的方法。将原液与磷酸缓冲液(50mM, pH 7.5)以1:15混合(W/V)，于水平摇床振荡1h后，10000r/min 4℃离心10min制得粗 酶液。酶促反应体系为0.5ml粗酶液，0.5ml磷酸Azoll(2.5mg/ml)缓冲溶液(50mM,pH 7.5)于37℃温育1h后加入0.5ml 5％三氯乙酸终止酶促反应。测定520nm下通过酶促反 应产生的偶氮染料的含量。NP活性单位定义：1U定义为30℃每毫升样本每分钟水解产生
1nmol酪氨酸为1个酶活单位(nmol/min/ml)。
1nmol酪氨酸为1个酶活单位(nmol/min/ml)。
[0051] 中性木聚糖酶的酶活测定参照Liu et al.(2011)的方法。原液与醋酸缓冲液(0.2M pH 5.5)以1:10(W/V)混合，于摇床振荡1h后，10000r/min 4℃离心10min制得粗酶液。 酶促反应为0.2ml粗酶液、1.8ml 1.7％木聚糖溶液，于50℃水浴30min。冷却后用DNS 法在550nm下测定还原糖生成量。酶活定义：1U定义为50℃，pH 6.0条件下，每毫开液 体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位 (nmol/min/ml)。
[0052] β-葡聚糖苷酶的酶活测定参照Liu et al.(2011)的方法。原液与柠檬酸缓冲液(0.05M， pH 6.0)、对硝基β-D-葡萄糖苷(25mM)以1:4:1(W/V/V)混合，于37℃培育1h后， 加入1ml CaCl2溶液(0.5M)和4ml三羟甲基氨基甲烷溶液(0.2M)，用NaOH调节pH 至12.0，10000r/min 4℃离心10min搜集上清液，测定410nm处吸光度。单位的定义： 1U定义为每毫升样本每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位 (nmol/min/ml)。
[0053] 滤纸酶活力的测定步骤：将50mg新华1号滤纸放入比色管，加入0.5mL稀释10倍 的原液，加入2.0mL HAc-NaAc缓冲液，于50℃恒温水浴锅中60min，加入3.0mL DNS 溶液，沸水浴10min，冷却后定容至25.0mL，在540nm处测OD值。测得OD值后查阅 葡萄糖标准曲线，求出酶解所得葡萄糖含量，换算成相应酶活力值。单位定义：1U定义为 在50℃，pH 4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个 酶活力单位(mg/min/ml)。
[0054] β-淀粉酶酶活力测定采用DNS法：反应体系2.05mL，1mL0.05mol/L pH值5.6柠檬 酸缓冲液，0.5mL 1％可溶性淀粉，50μL原液，37C保温3min，0.5mL终止液DNS，沸水 浴5min，冷却至室温，加15mL去离子水，混合均匀，测OD540nm吸光值。对照组先加 DNS后加酶液。酶活力单位：1U定义为在实验条件下(37C，pH值5.6)，以每分钟催化底 物(淀粉)产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位(mg/min/ml)。
[0055] LB液体培养基50℃，170r/min水平震荡培养1d测定产酶值，纤维素酶活力达到2.514U， β-葡聚糖苷酶的酶活力达到4.4221U，中性木聚糖酶活力达到1265.4149U，滤纸酶活力达 到0.012494U，中性蛋白酶活力达到2.2983U，β-淀粉酶活力达到0.08242U。菌株在较高 培养温度下具有高产酶能力，与常温细菌相比其应用于生物质固废堆肥、食用菌培养基材 料生产中具有优势。
[0056] 实施例3、液态接种体的产生
[0057] 将-80℃甘油管保存的NJAU-ND8菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培 养小时。挑取NJAU-ND8单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液 作为种子液。以1％(v/v)的接种量将一种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养 至对数中期(OD600＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬 备用。
[0058] 所用LB培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：蛋白栋10g，酵母粉5g，NaCl10g 琼脂20g，定容至1000ml，pH自然，121℃灭菌20min。
[0059] 实施例4、固体发酵有机肥
[0060] 将猪粪、木屑和蘑菇渣按照堆体C/N 24:1-26:1配比混合堆成条垛型(45吨，湿重)， 初始含水率调节至55-65％。设置2个处理，实验组接种液态接种体，接种量为10mg/kg； 对照组不做添加；每隔1天进行翻堆，使固体发酵温度不超过60度，并在第0、1、2、3、 4、5、6、9、30天采样(如遇翻抛，翻抛后采样)。每天上午9点(如翻抛，采集翻抛前 样品)和下午
3点使用水银温度计对堆体中部同一高度(50cm)随机测量3个点，取平均 温度作为堆体的实际温度。堆肥温度变化主要有3个阶段，分别为升温阶段、高温阶段和 后熟降温阶段。由图1可见：NJAU-ND8处理在6天内堆体温度达到了50℃，最高温度是 55℃，堆体温度大于50℃的保持时间为26天，而对照处理9天后温度达到了50℃，温度 大于50℃保持时间为14天。
有研究表明，当堆体的温度高于50℃并维持在7天以上，堆 体中的病菌可被杀死，可以保证堆肥的无害化卫生质量(Deportes I，1995)。因此，虽然 推测处理与对照结果30天的堆肥均能腐熟，但加菌后显著促进了堆体在堆肥升温期温度的 升高，同时堆体提前进入的降温期(10天左右，而对照需要15天)，表明菌株的添加显著 驱动了堆肥的进行，提高了堆肥的效率。
3点使用水银温度计对堆体中部同一高度(50cm)随机测量3个点，取平均 温度作为堆体的实际温度。堆肥温度变化主要有3个阶段，分别为升温阶段、高温阶段和 后熟降温阶段。由图1可见：NJAU-ND8处理在6天内堆体温度达到了50℃，最高温度是 55℃，堆体温度大于50℃的保持时间为26天，而对照处理9天后温度达到了50℃，温度 大于50℃保持时间为14天。
有研究表明，当堆体的温度高于50℃并维持在7天以上，堆 体中的病菌可被杀死，可以保证堆肥的无害化卫生质量(Deportes I，1995)。因此，虽然 推测处理与对照结果30天的堆肥均能腐熟，但加菌后显著促进了堆体在堆肥升温期温度的 升高，同时堆体提前进入的降温期(10天左右，而对照需要15天)，表明菌株的添加显著 驱动了堆肥的进行，提高了堆肥的效率。
[0061] 将风干、磨碎的样品经过100目筛过滤后，采用重铬酸钾氧化-水浴加热法，利用重铬 酸钾在酸性溶液中将有机质氧化，并用硫酸亚铁将多余的重铬酸钾还原，由消耗的重铬酸 钾求得碳的数量，再乘以常数即得有机质含量。采用半微量开氏法测得样品中全氮的含量。 样品中的含氮化合物在硫酸铜、硫酸钾和硒粉这些加速剂的参与下，用浓硫酸在消煮炉中 消化分解，使其中所含的氮转化成氨，并与硫酸结合生成硫酸铵，然后在微量定氮蒸馏器 中用氢氧化钠碱化蒸馏出氨，经硼酸吸收，用标准酸滴定，经计算得其含量。C/N＝总碳含 量/总氮含量。C/N比值是用来判断堆肥反应是否达到腐熟的重要指标，同时也对微生物的 生长代谢起着重要的作用。对起始C/N比为25的堆肥原料，当该值降到16左右时，则可 认为堆肥基本腐熟(邱瑞宗，1991)。加菌后的堆体C/N在第9天时小于17，基本腐熟。 而对照组C/N同期大于20，表明菌株的添加显著加速了堆肥腐熟的进程。
[0062] 将风干样品磨碎过20目筛后与去离子水以1:10混合(w/v)，置于水平摇床以2000r/min 振荡2h，静置30min后过滤。取8ml滤液加入铺有滤纸的培养皿内，每个培养皿内放置20 颗独行菜种子，空白对照为去离子水。培养皿放置于25℃恒温培养箱中暗培养2天后，测 定发芽种子数以及根长。发芽指数是用来评价有机肥的毒性和腐熟度的重要指标。
以种子 发芽和根长度计算发芽指数GI，当GI值>50％时，堆肥对植物已基本没有毒性，堆肥基 本腐熟，当GI值>80％时，堆肥完全腐熟，因此，在30天时，加菌处理和对照的肥料均 符合要求。但由图5可见，第9天时CK和试验处理的发芽指数分别为45％和60％，且加 菌处理的发芽指数一直高于对照，尤其在堆肥前期，推断加菌处理提高了堆肥的腐熟进程。
以种子 发芽和根长度计算发芽指数GI，当GI值>50％时，堆肥对植物已基本没有毒性，堆肥基 本腐熟，当GI值>80％时，堆肥完全腐熟，因此，在30天时，加菌处理和对照的肥料均 符合要求。但由图5可见，第9天时CK和试验处理的发芽指数分别为45％和60％，且加 菌处理的发芽指数一直高于对照，尤其在堆肥前期，推断加菌处理提高了堆肥的腐熟进程。
[0063] 结论：芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8具有在高温条件下产多种堆肥物质降解相关降解酶 的能力，接种该菌株后能够驱动堆体快速进入升温期，提前进入降温期(10天后)，能够 有效驱动堆肥进行，提高堆肥效率。