一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用，属于体外受精技术领域。一种小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液。使用时将所述小鼠精子冻存液混合配制成含20～50mmol/L迷迭香酸的工作液。在精子冻存液中含有迷迭香酸，用于抗击冻存‑复苏过程中产生的过多活性氧，优化精子的生命代谢过程，增强免疫功能和抗氧化功能，达到保护精子受精的能力的作用，从而提高小鼠精子体外受精率。

权利要求

1.小鼠精子冻存液在小鼠精子冷冻保存中的应用；

所述小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液；所述小鼠精子冻存液的工作液为含20～50mmol/L迷迭香酸的基础液。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠精子冷冻保存的方法包括以下步骤：A.将小鼠精子冻存液配制成小鼠精子冻存液的工作液，平衡至37～39℃，得到预热的工作液；

B.将待精子冷冻的小鼠处死后，取出附睾尾，剪碎，得到附睾尾碎片；

C.将所述附睾尾碎片和所述预热的工作液混合，分离精子，将含有精子的工作液预冷后，保存至液氮中。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基础液为包含质量浓度18％棉子糖和质量浓度3％脱脂奶粉的水溶液。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述迷迭香酸母液的浓度为100mmol/L。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠精子冻存液的工作液为含30～

40mmol/L迷迭香酸的基础液。

说明书

一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于体外受精技术领域，具体涉及一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 由于生物医学研究的需要，在实验过程中，常常需要制备或从国外进口基因修饰小鼠，但制备或进口的小鼠由于技术难度大、价格高，得到小鼠的数量有限，而用于科学实验的小鼠需要达到具有一定统计学意义的数量才能进行，由于自然繁殖的周期长，采用精子冻存，多次实施体外受精的方法可以很快得到足够数量的小鼠用于实验；科研工作结束后，这些小鼠往往会被采取安乐死，使得资源消失。目前，采取精子冻存的方式，可以保存资源；同时，小鼠在生殖器外伤或濒临死亡的情况下，也可以采取精子冻存的方式保存该资源；保存冻存的精子，还可以进行反复多次的体外受精操作完成小鼠的微生物学净化。谷氨酰胺溶液具有增强免疫和抗氧化功能，常作为传统的小鼠精子冻存液用于近交系小鼠或基因工程小鼠，但其对小鼠精子的保护能力有待进一步提高。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高小鼠体外受精率的小鼠精子冻存液及其制备方法和应用。

[0004] 本发明提供了一种小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液。

[0005] 优选的，所述基础液为包含质量浓度18％棉子糖和质量浓度3％脱脂奶粉的水溶液。

[0006] 优选的，所述迷迭香酸母液的浓度为100mmol/L。

[0007] 优选的，所述小鼠精子冻存液的工作液为含20～50mmol/L迷迭香酸的基础液。

[0008] 优选的，所述小鼠精子冻存液的工作液为含30～40mmol/L迷迭香酸的基础液。

[0009] 本发明提供了一种所述小鼠精子冻存液的制备方法，包括以下步骤：

[0010] 1)棉子糖、脱脂奶粉和水混合，除菌，每990μL分装一管，得到基础液；

[0011] 2)用所述基础液将迷迭香酸配成100mmol/L浓度的迷迭香酸母液，每10μL分装一管，得到迷迭香酸母液。

[0012] 优选的，当配制小鼠精子冻存液的工作液时，将每管所述基础液弃去10×(n-1)μL基础液后与n管迷迭香酸母液混合，制备得到迷迭香酸浓度为10×nmmol/L的小鼠精子冻存液的工作液；其中n＝2～5。

[0013] 优选的，步骤1)中所述除菌为滤膜过滤除菌；所述滤膜的孔径为0.22μm。

[0014] 本发明提供了所述小鼠精子冻存液或所述制备方法制备的小鼠精子冻存液在小鼠精子冷冻保存中的应用。

[0015] 优选的，所述小鼠精子冷冻保存的方法包括以下步骤：

[0016] A.将小鼠精子冻存液配制成小鼠精子冻存液的工作液，平衡至37～39℃，得到预热的工作液；

[0017] B.将待精子冷冻的小鼠处死后，取出附睾尾，剪碎，得到附睾尾碎片；

[0018] C.将所述附睾尾碎片和所述预热的工作液混合，分离精子，将含有精子的工作液预冷后，保存至液氮中。

[0019] 本发明提供的小鼠精子冻存液，在基础液中提供适量的迷迭香酸，用于抗击冻存-复苏过程中产生的过多活性氧，优化精子的生命代谢过程，增强免疫功能和抗氧化功能，从而达到保护精子受精能力的作用。实验证明：使用传统小鼠精子冻存液(基础液)用于近交系小鼠或基因工程小鼠，复苏后的体外受精率较低，往往不能获得足够数量的胚胎用于胚胎转移，给近交系小鼠的保种工作带来一定的困难。当在小鼠精子冻存液中添加一定量的迷迭香酸，对精子冻存和复苏过程中能量的补充和还原精子冻存复苏过程中产生的活性氧，解除ROS对精子的毒害作用具有积极的意义，有利于精子活力的保持，得到较高的体外受精率，受精率达到73～85％，与低浓度(10mmol/L)或传统小鼠精子冻存液相比具有显著的优势。

[0020] 进一步的，本发明进一步限定了小鼠精子冻存液的工作液中迷迭香酸的含量为30～40mmol/L。实验证明：采用30mmol/L迷迭香的工作液保存小鼠精子后，体外受精率达到87％，比现有技术报道的100mmol/L谷氨酰胺小鼠精子冻存液(体外受精率78％)提高了
11.54％，这说明，本发明提供的小鼠精子冻存液具有较强的增强免疫和抗氧化功能，显著提高小鼠精子体外受精率。

具体实施方式

[0021] 本发明提供了一种小鼠精子冻存液，包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液；所述基础液为包含质量浓度16～20％棉子糖和质量浓度2～4％脱脂奶粉的水溶液；所述迷迭香酸母液的溶剂为所述基础液。

[0022] 本发明提供的小鼠精子冻存液包括独立分装的迷迭香酸母液和基础液。所述基础液优选为包含质量浓度18％棉子糖和质量浓度3％脱脂奶粉的水溶液。本发明对所述迷迭香酸母液的浓度没有特殊限制，配制成迷迭香酸工作浓度的10～100倍均可。为了举例说明本发明小鼠精子冻存液的工作液的配制方法，以迷迭香酸母液配制100mmol/L为例进行具体说明。本发明对所述棉子糖、脱脂奶粉和迷迭香酸的来源没有均没有特殊限制，采用本领域所熟知的商品购买途径获得即可。所述基础液中所用的水溶剂优选为双蒸水。

[0023] 在本发明中，所述小鼠精子冻存液在使用前再配制小鼠精子冻存液的工作液，防止免疫功能和抗氧化功能降低，从而导致对小鼠精子活力的保存能力降低。所述小鼠精子冻存液的工作液优选为含20～50mmol/L迷迭香酸的基础液，更优选为含30～40mmol/L迷迭香酸的基础液。

[0024] 本发明提供了一种所述小鼠精子冻存液的制备方法，优选包括以下步骤：

[0025] 1)棉子糖、脱脂奶粉和水混合，除菌，每990μL分装一管，得到基础液；

[0026] 2)用所述基础液将迷迭香酸配成100mmol/L浓度的迷迭香酸母液，每10μL分装一管，得到迷迭香酸母液。

[0027] 在本发明中，所述除菌优选为滤膜过滤除菌；所述滤膜的孔径优选为0.22μm。在除菌前，优选将得到的混合液进行离心，以便除去不溶性杂质。所述离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为12000rpm，所述离心的时间优选为10～30min，更优选为20～30min。

[0028] 在本发明中，采用上述制备方法制备的基础液和迷迭香酸母液进行低温保藏。

[0029] 在本发明中，当配制小鼠精子冻存液的工作液时，优选将每管所述基础液弃去10×(n-1)μL基础液后与n管迷迭香酸母液混合，制备得到迷迭香酸浓度为10×n mmol/L的小鼠精子冻存液的工作液；其中n＝2～5。

[0030] 本发明提供了所述小鼠精子冻存液或所述制备方法制备的小鼠精子冻存液在小鼠精子冷冻保存中的应用。

[0031] 在本发明中，所述小鼠精子冷冻保存的方法优选包括以下步骤：

[0032] A.将小鼠精子冻存液配制成小鼠精子冻存液的工作液，平衡至37℃，得到预热的工作液；

[0033] B.将待精子冷冻的小鼠处死后，取出附睾尾，剪碎，得到附睾尾碎片；

[0034] C.将所述附睾尾碎片和所述预热的工作液混合，分离精子，将含有精子的工作液预冷后，保存至液氮中。

[0035] 本发明将小鼠精子冻存液配制成小鼠精子冻存液的工作液，平衡至37～39℃，得到预热的工作液。平衡工作液温度的方法优选为37～39℃水浴。将小鼠精子冻存液的工作液平衡至37～39℃使后续分离精子尽量接近体温，避免对精子的冷应激。

[0036] 本发明将待精子冷冻的小鼠处死后，取出附睾尾，剪碎，得到附睾尾碎片。所述待精子冷冻的小鼠优选为12～14周龄小鼠。本发明对所述小鼠的种类没有特殊限制，采用本领域所要保存的目标小鼠即可。在本发明实施例汇总，所述小鼠为近交系小鼠C57BL/6小鼠。所述处死的方法没有特殊限制，采用本领域常规的颈椎脱臼处死法即可。

[0037] 得到附睾尾碎片和预热的工作液后，本发明将所述附睾尾碎片和所述预热的工作液混合，分离精子，将含有精子的工作液预冷后，保存至液氮。

[0038] 在本发明中，每只小鼠的附睾尾碎片优选采用1mL的预热的工作液混合。所述分离精子的时间优选为5～7min，有利于让精子充分游出，进入工作液中。在预冷前，优选将含有精子的工作液进行分装。所述分装用容器优选为250μL的麦管中，每管优选分装50-80μL含有精子的工作液，热封口。所述预冷的方法优选将分装的麦管在液氮蒸汽中放置3～5min,然后投入液氮，长期保存。

[0039] 在本发明中，为了验证本发明提供的冻存液的冻存效果，将冻存的精子复苏后进行体外受精，挑选统计受精率。

[0040] 下面结合实施例对本发明提供的一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0041] 实施例1

[0042] 小鼠精子冻存液的制备方法

[0043] 将18g棉子糖、3g脱脂奶粉溶解于100mL双蒸水中混合，得到的混合液在12000rpm离心30min后，取上清液用过滤器0.22μm过滤除菌后，990μL分装，标记为A液，置于-20度冰箱保存；用A液将迷迭香酸配成100mM浓度的溶液，10μL分装，标记为B液，置于-20度冰箱保存。A液和B液为小鼠精子冻存液。

[0044] 实施例2～实施例5

[0045] 小鼠精子冻存液的工作液的制备方法

[0046] 使用时将实施例1中制备的A液弃去10μL后再与2管B液混合，得20mM的迷迭香酸冻存液。

[0047] 将实施例1中制备的A液弃去20μL后再与3管B液混合，得30mM的迷迭香酸冻存液。

[0048] 将实施例1中制备的A液弃去30μL后再与4管B液混合，得40mM的迷迭香酸冻存液。

[0049] 将实施例1中制备的A液弃去40mL后再与5个B液混合，得50mM的迷迭香酸冻存液。

[0050] 对比例1

[0051] 实施例1中制备的A液和B液直接混合，得10mM的迷迭香酸冻存液。

[0052] 对比例2

[0053] 用实施例1中制备的A液作为传统小鼠精子保存液。

[0054] 实施例6～10

[0055] 对比例1～2以及实施例2～5分别为含有不同浓度的迷迭香酸的精子冻存液，分别标记为1、2、3、4、5、6组，其中1组的谷氨酰胺的浓度为零，具体各编号对应的组分含量见表1。

[0056] 表1不同组分的小鼠精子冻存液的配制情况

[0057]组分 1 2 3 4 5 6
棉籽糖(w/v) 18％ 18％ 18％ 18％ 18％ 18％
脱脂奶粉(w/v) 3％ 3％ 3％ 3％ 3％ 3％
迷迭香酸(mM) 0 10 20 30 40 50

[0058] 精子冻存：取12～14周龄的近交系小鼠C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取出附睾尾，在附睾尾上用眼科剪剪碎，浸入1mL平衡至37℃的精子冻存液中，让精子充分游出。5～7min后，分装入250μL的麦管中，每管装50～80μL，热封口。在液氮蒸汽中放置3～5min预冷后，投入液氮中保存。

[0059] 精子复苏：从液氮中取出精子冻存麦管，在空气中摇动15～30秒，投入37℃水浴中完全解冻30～60秒后，剪掉麦管封口，将精子吹入1mL体外受精液中，2500～3000rpm离心3～5min后，弃去上清，保留50μL液体，将精子吹散，检查精子活动力。

[0060] 卵子的获得：取5～6周与雄鼠同品系的SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)30～50IU，48小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)25～40IU，14～16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，体视显微镜下找到膨大部，释放卵团，将卵团挑入100～200μL预热的37℃体外受精液中，并洗涤2～3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。

[0061] 受精过程：取复苏后的精子液10μL置于卵团液中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，完成受精过程。

[0062] 受精卵的挑选：6～7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，选得分散的卵子，移入矿物油覆盖的100μL预热至37℃的KSOM培养液中，继续培养20～22小时后，挑选发育至2～4细胞期胚胎进行移植，并计算受精率。

[0063] 表2不同小鼠精子冻存液复苏后的体外受精率

[0064]

[0065]

[0066] 由以上结果可知，使用传统的小鼠精子冻存液用于近交系小鼠或基因工程小鼠，复苏后的体外受精率较低，往往不能获得足够数量的胚胎用于胚胎转移，给近交系小鼠的保种工作带来一定的困难，在小鼠精子冻存液中添加一定量的迷迭香酸，对精子冻存和复苏过程中能量的补充和还原精子冻存复苏过程中产生的活性氧，解除ROS对精子的毒害作用具有积极的意义，有利于精子活力的保持，得到较高的体外受精率，对比实验表明，小鼠精子冻存液中迷迭香酸的添加量在20～50mM范围内都能够得到较好的受精效果，其中30mM浓度的迷迭香酸效果最佳。

[0067] 对比例3

[0068] 根据文献报导，100mM的谷氨酰胺基础液也具有增强免疫和抗氧化功能，作为小鼠精子冻存液用于小鼠精子冻存。

[0069] 实施例11

[0070] 根据上述实施例中得到的最佳效果的30mM迷迭香酸小鼠精子冻存液工作液与对比例3中制备的100mM谷氨酰胺分别作为精子冻存液按照实施例5的方法测定小鼠精子体外受精率，得到的实验结果见表3。

[0071] 表3不同组分的小鼠精子冻存液的配制情况

[0072]组分 30mM迷迭香酸 100mM谷氨酰胺
体外受精率(％) 87 78

[0073] 实验证明：采用30mmol/L迷迭香的工作液保存小鼠精子后，体外受精率达到87％，比现有技术报道的100mmol/L谷氨酰胺小鼠精子冻存液(体外受精率78％)提高了11.54％，这表明本发明提供的小鼠精子冻存液具有较强的增强免疫和抗氧化功能，显著提高小鼠精子体外受精率。

[0074] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。