结合OX40的抗体及其用途转让专利
申请号 : CN201910071673.9
文献号 : CN110078825B
文献日 : 2020-05-26
发明人 : 胡稳奇 , 李江美 , 江伦 , 李锋
申请人 : 北京天广实生物技术股份有限公司
摘要 :
本发明提供一种与人OX40特异结合的分离的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供包含该抗体的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本发明抗体的治疗方法。
权利要求 :
1.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链CDR1区、CDR2区和CDR3区，以及轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1、3、6、8、10和12所示；或者分别如SEQ ID NOs：1、4、6、8、10和12所示，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合，其中所述抗原结合部分选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段、和scFv片段。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含SEQ ID NOs：14、15、17、18、19、20、21或22所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NOs：23、24、26、27或28所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：14和23；(2)SEQ ID NOs：15和24；(3)SEQ ID NOs：17和26；(4)SEQ ID NOs：18和27；(5)SEQ ID NOs：18和28；(6)SEQ ID NOs：19和27；(7)SEQ ID NOs：19和28；(8)SEQ ID NOs：20和26；(9)SEQ ID NOs：21和27；(10)SEQ ID NOs：21和28；(11)SEQ ID NOs：22和27；或(12)SEQ ID NOs：22和28所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人OX40结合；
(b)与猴OX40结合；(c)阻碍OX40-OX40L相互作用；(d)不与小鼠OX40结合；(e)促进T细胞共刺激；(f)促进IL-2分泌；和(g)促进CD8+T细胞增殖。
7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、嵌合或人源化抗体。
8.一种双特异性分子、免疫交联物、嵌合抗原受体、基因改造T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
9.一种组合物，包含权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的组合物，还包含第二抗体和/或OX40表达激活剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述第二抗体选自PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-
3抗体、TIM-3抗体、STAT3抗体和ROR1抗体。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述OX40表达激活剂为非甲基化的CpG寡核苷酸、血凝素-白细胞凝集素、和/或IL-2。
13.一种核酸，编码权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
14.一种表达载体，包含权利要求13所述的核酸。
15.一种宿主细胞，包含权利要求14所述的表达载体。
16.权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求9-
12中任一项所述的组合物在制备治疗癌症疾病的药物中的用途，其中所述癌症疾病选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。
说明书 :
结合OX40的抗体及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种与人OX40特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在治疗与OX40相关疾病中的用途，例如癌症和感染性疾病。
背景技术
[0002] T细胞共刺激受体OX40，也称为CD134、TNFRSF4和ACT35，是肿瘤坏死因子受体超家族的一员。它增强由TCR触发的T细胞反应，并主要在激活的T细胞，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞(Treg)的表面表达(Redmond et al.，(2009)Crit.Rev.Immunol.29(3)：187-201；Jensen et al.，(2010)Semin.Oncol.37(5)：524-532)。不像CD28，OX40不在初始T细胞上表达，而是在抗原刺激后12小时至5-6天间出现表达高峰。其配体OX40L，呈现出相同的模式，可以在抗原暴露后1-3天后在抗原提呈细胞表面上检测到(Willoughby et al.，(2017)MolImmunol 83：13-22)。
[0003] 与OX40L结合后，OX40信号通路增加细胞因子的产生，并加强CD4+和CD8+ T细胞的增殖和存活(Weinberg et al.，(1998)，Semin Immunol 10(6)：471-480；Kjaergaard et al.，(2000)Cancer Res 60(19)：5514-5521；Willoughby et al.，(2017)，MolImmunol.，83：13-22；Croft et al.，(2003)Cytokine Growth Factor Rev.14(3-4)：265-273)。体内实验表明，OX40L对OX40受体的结合改善携带如淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌和神经胶质瘤的小鼠的无瘤存活期(Aspeslagh et al.，(2016)Eur J Cancer 52：50-66；Bell et al.(2016)Oral Oncol 52：1-10；Webb et al.，(2016)Clin Rev Allergy Immunol 50(3)：
312-332；Willoughby et al.，同上)。
312-332；Willoughby et al.，同上)。
[0004] 此外，OX40还在Treg发生和功能上起到重要作用。OX40信号通路在一些情况下加强Treg健全性和增殖，在肿瘤位点的OX40+Treg比例明显呈更高水平(Piconese et al.，(2014)Hepatology 60(5)：1494-1507；Ruby et al.，(2009)J Immunol 183：4853-4857；Piconese et al.，(2010)Eur J Immunol40：2902-2913)。然而，也有报道称，高剂量的激动性OX40抗体成功地经凋亡程序降低Treg活性，从而阻断Treg介导的抑制效应(Voo et al.，(2013)Immunol.191(7)：3641-3650)。
[0005] 因为上述的在免疫应答中的作用，OX40被认为是潜在的免疫疗法靶点。激活OX40信号通路的激动性OX40抗体已经用在临床前研究中，治疗肿瘤和感染性疾病(Boettler et al.，(2012)PLoS Pathog.8(9)：e1002913；Jahan et al.，(2018)Neuro Oncol.10；20(1)：44-54)，而阻断OX40信号通路的拮抗性抗体则用于治疗自免疫疾病或炎性疾病。在使用激动性OX40单克隆抗体的首个人类I期临床试验中，共有30例患有转移实体恶性肿瘤的患者参加，其中有12例在接受一个疗程的治疗后，有肿瘤消退的迹象(Curti et al.(2013)Cancer Res 73(24)：7189-7198)。OX40单疗法还与其他单克隆抗体、化疗和细胞因子相结合，用于改善疗效(Linch，McNamara et al.(2015)Front Oncol 5：34；Colombo et al.，(2017)，Clin Cancer Res 23(20)：5999-6001；Foote et al.，(2017)Cancer Immunol Res
5(6)：468-479)。
5(6)：468-479)。
[0006] 尽管对于OX40-OX40L相互作用的结构性基础进行了深入研究，OX40抗体是激动型还是拮抗型的决定性因素尚不清楚。存在对于具有所需药学特性的更多OX40抗体的需求。
发明内容
[0007] 本发明提供一种分离的单克隆抗体，例如，与OX40(例如，人OX40和猴OX40)结合的鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体。其可以是激活OX40信号通路的激动型OX40抗体。
[0008] 本发明的抗体可以用于多种应用，包括检测OX40蛋白，治疗或预防OX40相关疾病，例如癌症和感染性疾病。
[0009] 因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、3和6；(2)SEQ ID NOs：1、4和6；或(3)SEQ ID NOs：2、5和7的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0010] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包含SEQ ID NOs：14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0011] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：8、10和12；或(2)SEQ ID NOs：9、10和11的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0012] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包含SEQ ID NOs：23、24、25、26、27或28，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0013] 在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、3、6、8、10和12；(2)SEQ ID NOs：1、4、6、8、10和12；或(3)2、5、7、9、11和13的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0014] 在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：14和23；(2)SEQ ID NOs：15和24；(3)SEQ ID NOs：16和25；(4)SEQ ID NOs：17和26；(5)SEQ ID NOs：18和27；(6)SEQ ID NOs：18和28；(7)SEQ ID NOs：19和27；(8)SEQ ID NOs：19和28；(9)SEQ ID NOs：20和26；(10)SEQ ID NOs：21和27；(11)SEQ ID NOs：21和28；(12)SEQ ID NOs：22和27；或(13)SEQ ID NOs：22和28的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0015] 在一个实施方式中，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区和轻链恒定区分别包含SEQ ID NOs：29和30的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
[0016] 本发明的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4亚型。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。
[0017] 本发明的抗体或其抗原结合部分与人或猴OX40特异结合，并阻断OX40-OX40L相互作用。本发明的抗体是激动型OX40抗体，激活OX40信号通路，促进T细胞共刺激以及后续的IL-2分泌及T细胞增殖。本发明的抗体或其抗原结合部分具有与现有技术OX40抗体相当或更好的体内抗肿瘤效果。
[0018] 本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素相连接。本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本发明抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本发明的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本发明的抗体或其抗原结合部分可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒携带使用。
[0019] 本发明还提供组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、或免疫交联物或双特异性分子或CAR，以及药学上可接受的载体。
[0020] 本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本发明还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备OX40抗体的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
[0021] 另一方面，本发明提供一种增强受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。
[0022] 在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。
[0023] 在另一个方面，本发明提供在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。癌症可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于，淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和肠腺癌。在一些实施方式中，该方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码或承载抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本发明的抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
[0024] 在一个实施方式中，本发明的癌症疾病治疗方法还包括施用OX40表达激活剂。OX40的表达优选在T细胞的表面。OX40表达激活剂可以是TLR9配体，或者更具体地为非甲基化的CpG寡核苷酸。或者，OX40表达激活剂可以是血凝素-白细胞凝集素(PHA-L)、和/或IL-
2。
2。
[0025] 基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
[0026] 附图描述
[0027] 图1示出84个杂交瘤克隆培养基上清的OX40信号通路激动活性排名。
[0028] 图2示出OX40抗体对OX40-OX40L相互作用的抑制性作用。
[0029] 图3示出OX40杂交瘤抗体的OX40信号通路激动活性。
[0030] 图4A和4B示出OX40抗体参与在T细胞共刺激中，其中PBMC得自供体1(A)和供体2(B)。
[0031] 图5A和5B示出嵌合OX40抗体对HEK293A/人OX40细胞(A)或HEK293A/猴OX40细胞(B)的结合力。
[0032] 图6示出嵌合OX40抗体的OX40信号通路激动活性。
[0033] 图7示出嵌合OX40抗体对T细胞共刺激的效应，其中使用供体3的PBMC。
[0034] 图8A-8F示出人源化OX40抗体对人、猴或小鼠OX40的结合力。抗体71H8及其人源化抗体版本与人(A)和猴(B)OX40结合但不结合小鼠OX40(C)，抗体68C6及其人源化抗体版本与人(D)和猴(E)OX40结合但不结合小鼠OX40(F)。
[0035] 图9A-9D示出人源化抗体对HEK293A细胞表面人或猴OX40的结合力。抗体68C6及其人源化抗体版本与细胞表面的人(A)和猴(B)OX40结合，抗体71H8及其人源化抗体版本与细胞表面的人(C)和猴(D)OX40结合。
[0036] 图10A和10B示出抗体68C8及其人源化抗体版本(A)、以及抗体71H8及其人源化抗体版本(B)的OX40信号通路激动活性。
[0037] 图11A和11B示出人源化OX40抗体对IL-2分泌(A)和CD4+T细胞增殖(B)的效应，其中使用供体4的PBMC。
[0038] 图12A和12B示出人源化OX40抗体对IL-2分泌(A)和CD4+T细胞增殖(B)的效应，其中使用供体5的PBMC。
[0039] 图13示出由SPR测量的嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的结合亲和力。
[0040] 图14示出人源化OX40抗体对四个重组OX40ECD蛋白的结合亲和力。
[0041] 图15示出人源化OX40抗体对人OX40的结合特异性。
[0042] 图16A和16B示出本发明人源化OX40抗体对小鼠肿瘤生长的体内抑制效果，具体示出施用本发明抗体、对照抗体或溶剂前、中、后的各组小鼠的肿瘤体积均值变化(A)，以及各组小鼠的个体肿瘤体积变化(B)。
[0043] 图17示出在小鼠肿瘤模型中人源化OX40抗体对肿瘤浸润CD8+T细胞增殖的体内效果。
具体实施方式
[0044] 为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
[0045] 术语“OX40”是指肿瘤坏死因子超家族的第四个成员。该术语包括变体、异体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人OX40特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的OX40蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人OX40蛋白特异的抗体可以完全地对人OX40蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的OX40蛋白交叉反应。
[0046] 术语“人OX40”是指具有人氨基酸序列的OX40蛋白，例如Genbank登录号为NP_003318的氨基酸序列(SEQ ID NO.：32)。术语“猴OX40”和“鼠OX40”分别指猴和小鼠的OX40序列，例如分别具有Genbank登录号为NP_001090870(SEQ ID NO.：34)和Genbank登录号为NP_035789(SEQ ID NO.：36)的序列。
[0047] 本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
[0048] 本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，OX40蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
[0049] 本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与OX40蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合OX40蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人OX40蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的OX40蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
[0050] 术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
[0051] 术语“小鼠源抗体”是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠框架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。
[0052] 术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
[0053] 术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
[0054] 术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
[0055] 在本文中，“特异结合人OX40”的抗体是指与人OX40(还可能是其他非人物种的OX40)结合但是基本不与非OX40蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人OX40蛋白，即KD值为5.0x 10-8M以下，优选1.0x 10-8M以下，更优选为5.0x10-9M以下。
[0056] 术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x 10-6M以上，更优选1.0x 10-5M以上，更优选1.0x 10-4M以上、1.0x 10-3M以上，更优选1.0x 10-2M以上。
[0057] 术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x 10-6M以下，优选5.0x 10-8M以下，更优选1.0x 10-8M以下、5.0x 10-9M以下，更优选1.0x 10-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
[0058] 术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
[0059] 术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
[0060] 术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
[0061] 本文中所用的术语“激动型OX40抗体”是指能够与OX40结合并激活或引发OX40信号通路从而促进T细胞增殖和存活的OX40抗体。而术语“拮抗型OX40抗体”是指阻断OX40信号通路的OX40抗体，从而纠正过度活跃的T细胞病理，可以用于治疗例如哮喘、肠炎和关节炎。
[0062] 术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病严重程度的本发明抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
[0063] 本发明的多个方面在以下更加具体地加以描述。
[0064] OX40抗体具有对人OX40的结合特异性以及其他有益的功能特征
[0065] 本发明的抗体以高亲和力特异性地结合人OX40，例如，KD值为1x 10-8M以下。抗体还具有与猴OX40的交叉反应性，不与小鼠OX40结合。
[0066] 本发明的抗体是激活或引发OX40信号通路并参与T细胞共刺激的激动型OX40抗体，促进IL-2分泌和CD8+ T细胞增殖。
[0067] 本发明的抗体具有与良好的体内抗肿瘤效应。在抗体施用停止后，肿瘤不会生长，甚至肿瘤会完全消除。
[0068] 优选的本发明抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。
[0069] OX40单克隆抗体
[0070] 优选的本发明抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。OX40抗体的VH氨基酸序列为SEQ ID NOs：14、15、16、17、18、19、20、21或22。OX40抗体的VL氨基酸序列为SEQ ID NOs：23、24、25、26、27或28。抗体的重链/轻链可变区序列列于以下表1中，一些抗体具有相同的VH或VL。优选的抗体重链恒定区和轻链恒定区分别列于SEQ ID NOs：29和30。
[0071]
[0072] 与人OX40结合的其他OX40抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本发明抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。
[0073] 因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
[0074] (a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
[0075] (b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一OX40抗体的VL，其中该抗体特异结合人OX40。
[0076] 在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括：
[0077] (a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及
[0078] (b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一OX40抗体的CDR，其中该抗体特异结合人OX40。
[0079] 在另一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分包括OX40抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人OX40的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一OX40抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
[0080] 此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：
739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,
925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。
739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,
925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。
[0081] 在另一实施方式中，本发明的抗体包含OX40抗体的重链可变区的CDR2以及至少OX40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一OX40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人OX40。优选这些抗体(a)竞争结合OX40；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本发明OX40抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含OX40抗体的轻链可变区CDR2，或者另一OX40抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人OX40。在另一实施方式中，本发明的抗体可以包括OX40抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一OX40抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人OX40。
[0082] 保守修饰
[0083] 在另一实施方式中，本发明的抗体包含与本发明OX40抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)
Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
[0084] 因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
[0085] (a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0086] (b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0087] (c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
[0088] (d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
[0089] (e)该抗体特异结合人OX40。
[0090] 本发明的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人OX40的高亲和力，以及引发对OX40表达细胞的ADCC或CDC的能力。
[0091] 在多个实施方式中，抗体可以是例如鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
[0092] 本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本发明抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
[0093] 基因修饰的抗体
[0094] 本发明的抗体可以以具备本发明OX40抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，框架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
[0095] 在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的框架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0096] 因此，本发明的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本发明上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本发明单克隆抗体的VH和VLCDR序列，它们可以含有不同的框架序列。
[0097] 这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。
[0098] 通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschμl et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
[0099] 用于本发明抗体的优选框架序列是结构上与本发明抗体所用的框架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该框架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的框架区中。例如，在一些情况下，将框架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0100] 另一类的可变区修饰是将VH和/或VLCDRl、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
[0101] 此外，在另一实施方式中，本发明提供分离的OX40单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本发明的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
[0102] 本发明的基因改造抗体包括在VH和/或VL的框架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些框架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
[0103] 另一类的框架修饰包括对框架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
[0104] 此外，作为框架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本发明的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
[0105] 在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变Cm铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
[0106] 在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
[0107] 在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
[0108] 此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，且可以用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。
[0109] 本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本发明的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
[0110] 抗体的物理特性
[0111] 本发明的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。
[0112] 例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)JExp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选OX40抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
[0113] 在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
[0114] 各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选OX40抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
[0115] 编码本发明抗体的核酸分子
[0116] 在另一方面，本发明提供编码本发明抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本发明的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
[0117] 本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
[0118] 优选的本发明核酸分子包括编码OX40单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
[0119] 编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(Cm、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
[0120] 编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
[0121] 为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston ct al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature 348：552-554)。
[0122] 本发明单克隆抗体的制备
[0123] 本发明的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
[0124] 制备本发明单克隆抗体的转染瘤的生成
[0125] 本发明的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
[0126] 术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
[0127] 抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0128] 除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
[0129] 对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
[0130] 优选的用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
[0131] 免疫交联物
[0132] 本发明的抗体可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,
600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO
07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；
和20060247295中描述般进行制备。
600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO
07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；
和20060247295中描述般进行制备。
[0133] 双特异性分子
[0134] 另一方面，本发明涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本发明抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
[0135] 在实施方式中，除Fc结合特异性和OX40结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以是针对增强因子(EF)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。
[0136] 双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。
[0137] 编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒
[0138] 溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本发明的抗体与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本发明抗体的溶瘤病毒可以引入人体中。
[0139] 药物组合物
[0140] 在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗体或药物。本发明的药学组合物可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或抗微生物剂的联合疗法中进行施用。
[0141] 药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。
[0142] 优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本发明的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
[0143] 药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
[0144] 与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。
[0145] 给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
[0146] 对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本发明OX40的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血药浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
[0147] “治疗有效量”的本发明OX40抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防能力。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
[0148] 药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
[0149] 药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
[0150] 在某些实施方式中，本发明的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本发明的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：
9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
[0151] 本发明的用途和方法
[0152] 本发明的抗体(组合物、双特异性分子和免疫交联物)具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症的治疗和/或预防。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。
[0153] 考虑到本发明OX40抗体的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本发明的抗体，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本发明抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和肠腺癌，不管是原发癌还是转移癌。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本发明的抗体抑制。
[0154] 在另一方面，本发明提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，可以与本发明抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。
[0155] 总体而言，本发明的抗体可以用来增强受试者的免疫应答。
[0156] 本发明的这些和其他方法在以下进一步讨论。
[0157] 联合疗法
[0158] 本发明提供本发明OX40抗体或其抗原结合部分与一种或多种能有效抑制受试者中肿瘤生长的其他抗体一起施用的联合疗法。在一个实施方式中，本发明提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用OX40抗体以及一种或多种其他抗体，例如LAG-3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。
[0159] 在另一个方面，本发明提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用OX40抗体和OX40表达激活剂。OX40的表达优选在T细胞的表面。OX40表达激活剂可以是TLR9配体，特别是非甲基化CpG寡核苷酸。或者，OX40表达激活剂可以是血凝素-白细胞凝集素(PHA-L)、和/或IL-2。
[0160] OX40信号通路激活可另外与标准癌症治疗结合。例如，OX40信号通路激活可以与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断、以及化疗相结合。例如，化疗剂可以与OX40抗体一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-FU可以施用给接受OX40抗体疗法的患者。
[0161] 任选地，OX40与一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4抗体和/或LAG-3抗体和/或PD-1抗体)的组合还可以与免疫原性剂结合，免疫原型剂为例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、和转染有表达免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He et al.，(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原肽，例如gp100肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1、和/或酪氨酸酶、或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
[0162] 其他可以与OX40抗体联合的疗法包括但不限于白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
[0163] 本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
[0164] 此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
[0165] 本发明还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。
[0166] 实施例
[0167] 实施例1稳定表达人、猴或小鼠OX40的HEK293A细胞株的构建
[0168] 合成编码人、猴或小鼠OX40的cDNA序列(SEQ ID NOs：31、33和35，分别编码氨基酸序列SEQ ID NOs：32、34和36)，并经酶切克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体(北京英茂盛业生物科技有限公司，中国)中。将得到的pLV-EGFP(2A)-Puro-OX40与psPAX和pMD2.G质粒通过脂质体转染的方式转染到HEK293T细胞(南京科佰公司，中国)中，产生慢病毒，具体转染方法与Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific，美国)说明书步骤完全一致。转染三天后，从HEK293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。然后用慢病毒转染HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)，得到稳定表达人、猴、或小鼠OX40的HEK293A细胞(分别为HEK293A/hOX40、HEK293A/rhOX40、HEK293A/muOX40)。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的DMEM+10％FBS培养基中7天。人和猴OX40的表达通过流式分析仪经FACS分析，使用市售可得的人OX40抗体(PE-人OX40抗体，Cat#：350003Biolegend，美国)。相似地，小鼠OX40的表达通过市售可得的小鼠OX40抗体(PE-小鼠OX40抗体，Cat#no.：119409，Biolegend，美国)经FACS确证。
[0169] 实施例2制备分泌人OX40抗体的杂交瘤细胞系
[0170] 小鼠抗人OX40单克隆抗体通过常规杂交瘤融合技术获得，方案略做改动。
[0171] 接种
[0172] 20只BALB/C小鼠(维通利华，中国)通过交叉注射重组人OX40(ECD)-hFc蛋白(Sino Biological，CN，Cat#：10481-H08H)和猴OX40-hFc蛋白(Cat#：90846-C08H，义翘神州，中国)进行免疫，具体免疫流程如表2所示。人OX40(ECD)-hFc蛋白和猴OX40-hFc蛋白用等体积的完全Freund佐剂(Cat#：F5881-10*10ML，Sigma，美国)或不完全Freund佐剂(Cat#：F5506-6*10ML，Sigma，美国)或PBS超声乳化。
[0173] 表2.免疫进程
[0174]
[0175] 每次加强免疫后1周，从每只小鼠体内取50μl血清，经ELISA检测滴度，具体使用重组人OX40-his(Cat#：10481-H03H，义翘神州，中国)和猴OX40-his(Cat#：90846-C08H，义翘神州，中国)进行结合测试。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、小鼠OX40的HEK293A细胞经FACS进行滴度测试。
[0176] 基于最后一次加强之后的ELISA检测和FACS检测结果，血清滴度较高的7只小鼠被选出用于下一步的杂交瘤细胞系制备。
[0177] 杂交瘤细胞系的制备
[0178] 通过常规的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞系，方案略做修改。
[0179] 在细胞融合前，所选的小鼠腹腔注射溶于PBS的重组人OX40(ECD)-hFc进行免疫加强，剂量为每只小鼠50μg。4天后，将小鼠处死后取出脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone，美国)清洗3次。处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(CRL-1581，ATCC，美国)与上述分离的小鼠脾细胞按1：4的比例混匀后用DMEM清洗2次。细胞融合通过PEG(Cat#：P7181，Sigma，美国)融合的方式进行。融合后的细胞用DEME清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640+10％FBS+1XHAT)。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×104细胞每孔，将细胞放于37℃、5％CO2的潮湿细胞培养箱培养7天。在第7天时，将培养基换成新鲜培养基(DMEM+10％FBS+1X HAT)。2-3天以后，吸取细胞培养液上清，经ELISA和FACS筛选杂交瘤。
[0180] 通过ELISA筛选杂交瘤细胞系
[0181] 首先通过高通量的ELISA结合检测来筛选与人OX40结合的杂交瘤克隆。与人OX40结合的杂交瘤克隆进一步测试与猴或小鼠OX40结合的能力。
[0182] 对于ELISA检测，用人OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：10481-H03H，义翘神州，中国)、猴OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：90846-C08H，义翘神州，中国)或小鼠OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：E3350-B1707，中美冠科，中国)对96孔ELISA板铺板，100μl每孔，室温过夜。ELISA板用PBST(PBS+0.05％吐温20)溶液清洗3遍，用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温
20)室温封闭2小时，用PBST溶液清洗3遍。杂交瘤细胞培养基上清用稀释液(PBS+1％BSA、+
1％山羊血清+0.01％吐温20)稀释10倍后，吸取100μl加入样品检测孔。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍。每孔加入100μl山羊抗鼠Fc-HRP(1∶5000，Cat#：A9309-1ml，Sigma，美国)，室温孵育1小时，PBST清洗3遍，加入80μl TMB显色。5-10分钟后加入0.16M硫酸终止显色，用酶标仪(SpectraMaxR i3X，Molecμlar Devies，美国)检测OD450的读值[0183] 经上述ELISA，筛选出209个与人和猴OX40有特异结合力的杂交瘤细胞系。
20)室温封闭2小时，用PBST溶液清洗3遍。杂交瘤细胞培养基上清用稀释液(PBS+1％BSA、+
1％山羊血清+0.01％吐温20)稀释10倍后，吸取100μl加入样品检测孔。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍。每孔加入100μl山羊抗鼠Fc-HRP(1∶5000，Cat#：A9309-1ml，Sigma，美国)，室温孵育1小时，PBST清洗3遍，加入80μl TMB显色。5-10分钟后加入0.16M硫酸终止显色，用酶标仪(SpectraMaxR i3X，Molecμlar Devies，美国)检测OD450的读值[0183] 经上述ELISA，筛选出209个与人和猴OX40有特异结合力的杂交瘤细胞系。
[0184] 通过FACS检测筛选杂交瘤细胞系
[0185] 对筛选出的209个杂交瘤细胞系进一步测试其与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠OX40的结合能力。首先将105个实施例1中的制备HEK293A/人OX40细胞、HEK293A/猴OX40细胞、或者HEK293A/鼠OX40细胞加入96孔板的各检测孔中。杂交瘤培养物上清用稀释液(PBS，含1％BSA、1％山羊血清、0.01％吐温20)稀释10倍加入到样品检测孔，100μl每孔。4℃孵育1个小时后，用FACS洗液(PBS+1％BSA+0.01％吐温20)清洗3遍。之后，细胞用FACS洗液重悬，加入500倍稀释的APC山羊抗小鼠IgG二抗(Cat#：405308，BioLegen，美国)4度孵育1小时，板用PBS清洗3遍后上FACS检测仪(BD)检测细胞荧光。
[0186] 基于上述FACS筛选，得到177个对HEK293A/人OX40细胞以及HEK293A/猴OX40细胞有高结合力而不与HEK-293A/小鼠OX40细胞结合的杂交瘤克隆。
[0187] 产生OX40抗体的杂交瘤细胞的亚克隆
[0188] 对上述177个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行特征确证。经该步骤得到的亚克隆确定为单克隆杂交瘤细胞系。最终得到84个对人和猴OX40呈现出高结合力的亚克隆，每个亚克隆得自不同的原始母克隆。
[0189] 通过HEK-Blue活性检测筛选杂交瘤细胞系
[0190] 将上述筛选出来的84个亚克隆在96孔板中铺板，并培养5天。收集上清进行HEK-Blue活性检测，以识别对人OX40信号通路有激动活性的OX40抗体。
[0191] 通过用表达人OX40-CD40融合蛋白(SEQ ID NO.：37)的慢病毒(如实施例1般制备)侵染HEK-Blue null 1_v细胞(InvivoGen，美国)来构建表达该融合蛋白的HEK-Blue报告细胞系(HEK-Blue/OX40)，再用10μg/ml的嘌呤毒素进行加压筛选。
[0192] 对于HEK-Blue/OX40报告系统检测，将4×104个HEK-Blue/OX40细胞重悬在200μl细胞培养基(DMEM培养基(Hyclone，USA，Cat#：SH30243.01)+10％FBS(Excell，China，Cat#：FND500)+10μg/ml嘌呤霉素(GIBCO，USA，Cat#：A11138-03)+100μg/ml NormocinTM(Invivogen，USA，Cat#：ant-nr-2)+100μg/ml博来霉素(Invivogen，USA，Cat#：ant-Zn-5)中，于96孔板铺板，并于37℃培养过夜。第二天，各孔加入200μl DMEM培养基，替换原培养基。培养7小时后，用HEK-Blue检测缓冲液(Invivogen，US，Cat#：hb-det3)替换DMEM培养基，
200μL每孔。将1ml杂交瘤细胞培养物上清与20μl蛋白G琼脂糖珠子(Santa Cruz Biotechnology；US；Cat#：SC-2002)室温孵育30分钟，以富集抗体。富集的抗体加到上述HEK-Blue/OX40细胞中，细胞在37℃、5％CO2下孵育，直至显出蓝色。用SpectraMax酶标仪(Molecμlar Devices，美国)测定OD650处的读值。其中阴性对照是新鲜的杂交瘤的培养基，OX40L(Sinobiological，中国，Cat#：13127-H01H)作为OX40的天然配体作为阳性对照。
200μL每孔。将1ml杂交瘤细胞培养物上清与20μl蛋白G琼脂糖珠子(Santa Cruz Biotechnology；US；Cat#：SC-2002)室温孵育30分钟，以富集抗体。富集的抗体加到上述HEK-Blue/OX40细胞中，细胞在37℃、5％CO2下孵育，直至显出蓝色。用SpectraMax酶标仪(Molecμlar Devices，美国)测定OD650处的读值。其中阴性对照是新鲜的杂交瘤的培养基，OX40L(Sinobiological，中国，Cat#：13127-H01H)作为OX40的天然配体作为阳性对照。
[0193] 如图1所示，47个克隆显示出不同程度的OX40激动活性。
[0194] 实施例3 OX40单克隆抗体的纯化
[0195] 基于上述的HEK-Blue检测，共挑取33个具有高HEK-Blue活性的克隆(见以下表3)，进行进一步的研究。首先将33个所选克隆的单克隆抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清杂交瘤培养基(Gibco，美国，Cat#：12045-076)和1％HT补充液(Gibco，Cat#：11067-030)。细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养10天。收集培养物，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，GE，美国)来富集纯化。后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。
[0196] 通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(Thermal，美国，Cat#：26179)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Sigma，美国，Cat#：IS02-1KT)来确定纯化抗体的亚型，检测步骤与试剂盒说明书中的一致。所选33个克隆抗体的亚型和表达滴度总结在表3中。
[0197] 表3.OX40抗体的亚型和表达滴度
[0198]
[0199] 实施例4纯化的OX40抗体与人和猴OX40结合
[0200] 纯化的OX40单克隆抗体首先通过ELISA检测来确定其与重组人、猴或小鼠OX40蛋白的结合亲和力。
[0201] ELISA检测板用500ng/ml人OX40-his(实施例2)4℃包被过夜。各孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温下封闭2个小时，然后加入100μl梯度稀释的OX40抗体(最高浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍后加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Simga，美国，Cat#：A9309-1ml)，室温孵育1小时。板用R新鲜配制的Ultra-TMB(BD，美国，Cat#no.：555214)室温显色5分钟。之后用SpectraMaxi3X(MolecularDevies，美国)在450nm读值。
[0202] 33个OX40单克隆抗体对对猴或小鼠OX40的物种交叉反应性进一步通过直接ELISA进行测试。具体地，将500ng/ml猴OX40-his或小鼠OX40-his(实施例2)包被在96孔ELISA板中，并与100μl梯度稀释的OX40抗体(最高浓度40μg/ml)共同孵育。之后使用HRP-山羊抗小鼠IgG(Sigma，美国，Cat#：A9309-1ml)。MEDI0562和RG7888作为对照OX40抗体，两者的恒定区均为人IgG1/κ，使用分别在专利公开US2016/0137740A1和WO2015/153513A1中的氨基酸序列制备而成。
[0203] 上述结合测试的EC50值总结在表4中。可以看到，所有33种抗体均与猴OX40交叉反应而不与小鼠OX40交叉反应。
[0204] 表4. 33种OX40单抗对人、猴、或小鼠OX40的结合力
[0205]
[0206] 实施例5 OX40单克降抗体与HEK293A细胞表达的人和猴OX40结合
[0207] 为进一步确定OX40抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠OX40结合，分别使用稳定过表达人、猴或小鼠OX40的HEK293A细胞(见实施例1)进行FACS细胞结合检测。简单而言，将105个HEK293A细胞在96孔板上铺板，并加入梯度稀释的OX40抗体(最高浓度40μg/ml)。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC-山羊抗小鼠IgG(BioLegen，美国，Cat#：405308)。4℃孵育1小时后，细胞用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)监测细胞荧光。
[0208] 如表5所示，所有33个OX40单克隆抗体示出与人和猴OX40的高结合力，但是不结合小鼠OX40(数据未显示)。MEDI0562和RG7888作为阳性对照OX40抗体。
[0209] 表5.OX40抗体与人和猴OX40的结合亲和力
[0210]
[0211] 实施例6 OX40抗体抑制OX40-OX40L相互作用
[0212] 对纯化的OX40抗体进一步测试其阻碍人OX40L对人OX40结合的能力。简单而言，96孔ELISA板用500ng/ml的人OX40-his(实施例2)4℃包被过夜。之后，板用200μl封闭液(PBS+2％BSA)室温封闭2小时。梯度稀释的OX40抗体(最高浓度为40μg/ml)加入检测孔，室温孵育
1小时，然后在孔里加入100μl的2μg/ml的人OX40L-hFc(义翘神州，中国，Cat#：13127-H01H)。室温孵育1小时后，板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍，加入5000倍稀释的抗人IgG FC-HRP(Simga，美国，Cat#：A0170-1ML)，室温孵育1小时。板用PBST洗液洗3遍，各孔加入80μl TMB显色。5-10分钟后，加入0.16M硫酸来终止反应，之后用SpectraMaxRi3X(Molecμlar Devies，美国)进行OD450读值。MEDI0562和RG7888用作阳性对照。
1小时，然后在孔里加入100μl的2μg/ml的人OX40L-hFc(义翘神州，中国，Cat#：13127-H01H)。室温孵育1小时后，板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍，加入5000倍稀释的抗人IgG FC-HRP(Simga，美国，Cat#：A0170-1ML)，室温孵育1小时。板用PBST洗液洗3遍，各孔加入80μl TMB显色。5-10分钟后，加入0.16M硫酸来终止反应，之后用SpectraMaxRi3X(Molecμlar Devies，美国)进行OD450读值。MEDI0562和RG7888用作阳性对照。
[0213] 4个代表性的克隆的结果显示在图2中，所有抗体(6A12、26D9、68C8和71H8)均阻断OX40-OX40L结合，表现为OX40/OX40L结合(OD450值)随着OX40抗体浓度的增加而降低。
[0214] 实施例7 OX40抗体激活OX40信号通路活性的确定
[0215] 为确定所选的OX40抗体是否具有OX40信号通路激动活性，进行HEK-Blue活性检测。简单而言，将实施例2制备的HEK-Blue/OX40细胞孵育在DMEM培养基(Hyclone，美国，Cat#：SH30243.01)中，培养基还含有10％FBS(Excell，China，Cat#：FND500)、10μg/ml嘌呤TM霉素(GIBCO，美国，Cat#：A11138-03)、100μg/mlNormocin (Invivogen，美国，Cat#：ant-nr-
2)、100μg/ml博来霉素(Invivogen，美国，Cat#：ant-Zn-5)。将4×104个HEK-Blue/OX40细胞接种到96孔板的200μl细胞培养基中，37℃培养过夜(约12小时)。用200μl新鲜DMEM培养基替换原培养基，继续培养7小时。之后，将各孔的DMEM培养基替换成100μl HEKBlue检测缓冲液(Invivogen，美国Cat#：hb-det3；)，其中含有各种浓度的OX40抗体(浓度范围从100μg/ml到0.002ng/ml)。细胞继续在37℃培养，直至显出蓝色。使用SpectraMaxR i3X酶标仪(Molecμlar Devices，美国)检测OD650读值。
2)、100μg/ml博来霉素(Invivogen，美国，Cat#：ant-Zn-5)。将4×104个HEK-Blue/OX40细胞接种到96孔板的200μl细胞培养基中，37℃培养过夜(约12小时)。用200μl新鲜DMEM培养基替换原培养基，继续培养7小时。之后，将各孔的DMEM培养基替换成100μl HEKBlue检测缓冲液(Invivogen，美国Cat#：hb-det3；)，其中含有各种浓度的OX40抗体(浓度范围从100μg/ml到0.002ng/ml)。细胞继续在37℃培养，直至显出蓝色。使用SpectraMaxR i3X酶标仪(Molecμlar Devices，美国)检测OD650读值。
[0216] 这33个抗体在功能性HEK-Blue检测中显示出不同程度的激动性。EC50值总结在表6中，代表性单抗的激动性显示在图3中。一些抗体，例如68C8和71H8比两个对照，MEDI0562和RG7888，具有更低的EC50值，也就是说具有更高的激动性。
[0217] 表6.OX40抗体的激动性
[0218] 抗体 EC50(ng/mL)69A9 860.3
26D9 469.1
68C8 86.59
6A12 273.8
71H8 49.38
96B9 395.8
190A7 46.52
118D7 107.2
143D6 56.25
185A12 80.32
134G4 919.6
192E2 47.13
186G4 71.37
137A12 256.1
147H2 41.32
136B8 1179
118A7 118.2
204F7 408.4
285A2 518.1
276F 3251
299B3 436.7
222A11 141.8
295E10 98.03
262F2 105.8
295D8 99.54
279H4 3076
253E9 325
270E9 227.4
278G9 76.3
253G5 131.6
287G7 209.8
274F1 905.5
268D2 13400
MEDI0562 309.9
RG7888 120.6
26D9 469.1
68C8 86.59
6A12 273.8
71H8 49.38
96B9 395.8
190A7 46.52
118D7 107.2
143D6 56.25
185A12 80.32
134G4 919.6
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137A12 256.1
147H2 41.32
136B8 1179
118A7 118.2
204F7 408.4
285A2 518.1
276F 3251
299B3 436.7
222A11 141.8
295E10 98.03
262F2 105.8
295D8 99.54
279H4 3076
253E9 325
270E9 227.4
278G9 76.3
253G5 131.6
287G7 209.8
274F1 905.5
268D2 13400
MEDI0562 309.9
RG7888 120.6
[0219] 实施例8抗原表位竞争
[0220] 通过竞争ELISA的方法检测抗体之间的抗原结合表位竞争。简单而言，96孔ELISA检测板用5μg/ml的MEDI0562或RG7888包被。这些孔用200μl封闭液(PBS+1％BSA+1％山羊血清+0.05％吐温20)室温封闭2小时。0.5μg/ml人OX40-his蛋白(SinoBiological，CN，Cat#：10481-H03H)加入检测板中，室温继续孵育1小时。板用PBST清洗3遍，加入1μg/ml纯化的抗体，室温孵育1小时。ELISA板用PBST洗3遍后加入20000倍稀释的抗小鼠Fc-HRP(Cat#：
A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。继续用PBST洗液洗3遍后，用新鲜配制的Ultra-TMB(Huzhou Yingchuang，中国，Cat#：TMB-S-003)室温显色5分钟，并用酶标仪(Thermo Multiscan FC)在450nm进行读值。
A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。继续用PBST洗液洗3遍后，用新鲜配制的Ultra-TMB(Huzhou Yingchuang，中国，Cat#：TMB-S-003)室温显色5分钟，并用酶标仪(Thermo Multiscan FC)在450nm进行读值。
[0221] 结果总结在表7中。具有最高激动性的两个抗体68C8和71H8可能与MEDI0562、RG7888结合相同或相似的表位。
[0222] 表7.竞争ELISA测试的表位竞争
[0223]
[0224] Y：存在竞争；N：不存在竞争
[0225] 实施例9激动型OX40抗体促进T细胞共激活
[0226] 为进一步确定OX40抗体对OX40信号通路的激动性，进行人原代T细胞共激活检测。简单而言，两个健康人供体血样中的PBMC通过梯度密度离心的方式获得。CD4阳性T细胞通过Invitrogen Dynabeads Untouched人CD4+ T细胞分离试剂盒(Thermal Fisher Scientific，美国，Cat#：11346D)从PBMC中分离出来，具体分离步骤跟试剂盒提供的说明书完全一致。
[0227] CD4+T细胞用完全RPMI培养基重悬，调整细胞密度为1.0×106/ml。加入终浓度为2μg/ml的血凝素-白细胞凝集素(PHA-L，sigma，Cat#：L1668-5MG)和20IU/ml重组人IL-2(R&D；Cat#：202-IL)，细胞在37℃、5％CO2的潮湿组织培养箱中培养2天，以激活T细胞并上调OX40蛋白的表达。
[0228] 初步激活的人CD4+T细胞离心收集，用完全RPIM培养基清洗3遍并将细胞密度调整成2×105活细胞/ml。板用5μg/ml CD3抗体(Cat#：GMP-10977-H001，OKT3，义翘神州，中国)和梯度稀释的OX40抗体于4℃包被过夜。板用PBS清洗3遍并用含1％BSA的PBS于37℃封闭90分钟。板用PBS清洗3遍后加入150μl上述调整好密度的CD4+T细胞(30000每孔)。细胞在板中37℃培养72小时，取100μl细胞培养上清用于IL-2分泌测量，使用IL-2检测试剂盒(R&D，美国)。MEDI0562和RG7888用作阳性对照。HEL抗体(LifeTein，LLC，US，Cat.#：LT12031)作为阴性对照抗体。
[0229] 如图4A和4B所示，单克隆抗体68C8和71H8能够促进T细胞的共激活，并以剂量依赖的方式增加IL-2分泌量。
[0230] 实施例10嵌合OX40抗体的表达和纯化
[0231] 选取3个抗体(6A12、71H8和68C8)进行进一步的研究。首先通过PCR方法对这三个抗体的杂交瘤细胞进行可变区序列的克隆，使用文献中提及的引物(Juste et al.，(2006)，AnalBiochem.，1；349(1)：159-61.)。通过将编码可变区和各自的人IgG1/k恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：29和30)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI来构建表达载体。可变区的氨基酸SEQ ID编码总结在表1中。
[0232] 将上述获得表达载体转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free StyleTM293表达培养基(Gibco，Cat#：12338-018)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO2的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，按照实施例3的方法步骤纯化单克隆抗体。
[0233] 实施例11 OX40嵌合单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人或猴OX40结合
[0234] 根据实施例5的方法步骤，对获得的3个嵌合抗体检测它们与实施例1制备的HEK293A/人OX40细胞和HEK293A/猴OX40细胞的结合力。
[0235] 如图5A和5B所示，嵌合抗体与人和猴OX40均有高亲和力。6A12、71H8和68C8嵌合抗体与HEK293A/人OX40细胞结合的EC50值分别是177.1ng/ml、144ng/ml和133.9ng/ml，而它们与HEK293A/猴OX40细胞结合的EC50值分别是882.7ng/ml、151.3ng/ml和80.65ng/ml。
[0236] 实施例12 OX40嵌合抗体具有OX40信号通路激动性且促进T细胞共激活
[0237] 根据实施例7和实施例9的方法步骤，对嵌合抗体进一步检测其对OX40信号通路的激活和对T细胞共刺激的作用。如图6和图7所示，三个嵌合抗体表现出与其母单抗相似的功能活性。
[0238] 实施例13 OX40抗体的人源化改造
[0239] 基于上述相关的功能试验，挑选两个鼠源抗体，68C8和71H8，进行人源化改造和进一步研究。小鼠源抗体的人源化改造通过互补决定区(CDR)移植法(美国专利5,225,539)进行，具体方法详见下文。
[0240] 为选出鼠源抗体68C8和71H8的人源化受体框架，将68C8和71H8的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与68C8和71H8同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化改造的框架。所选择的轻链种系受体序列是人IGKV1-33*01，所选择的重链种系受体序列是人IGHV1-46*01。
[0241] 对68C8和71H8的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。简单来说，所选结构模板分别与68C8和71H8具有相同类型的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、和H-CDR3环状结构。利用所选择的结构模板，通过用人种系重链和轻链框架序列代替小鼠框架而构建人源化68C8和71H8的结构模型。随后进行三维结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链连接起重要作用的关键框架氨基酸残基。当鼠源抗体框架与人种系受体框架在某一位点上拥有相同的氨基酸残基时，保留人种系氨基酸残基。另一方面，当鼠源框架与人种系受体框架在某一位点上拥有不同的氨基酸残基时，通过结构模拟来评价该残基的重要性。如果发现人种系受体框架内的某一氨基酸残基与CDR区残基相互作用并对CDR残基产生影响，那么该残基就会回复突变为鼠源残基。
[0242] 表8.抗体结构模拟模板
[0243]
[0244] 在上述结构建模的基础上，68C8重链鉴定出5个潜在的回复突变(A40R、K43Q、M48I、M70L、E72V)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(A43T、P44V、F71Y、Y87F)。71H8重链鉴定出6个潜在的回复突变(D27Y、A40R、K43Q、M48I、M70L、E72V)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(A43T、P44V、F71Y、Y87F)。
[0245] 如表1所示，针对68C8，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。相似地，对于71H8，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。
[0246] 合成编码人源化重链和轻链可变区以及人IgG1/k恒定区的序列，并利用BamH I和Xho I限制性酶切位点克隆到pCDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen，美国)中。所有表达构建均经测序证实。用表达载体转染HEK293F表达系统(Invitrogen，美国)，并瞬时表达10个人源化OX40抗体(68C85个，71H85个)，方法步骤如实施例10所述。人源化抗体按照实施例3所述进行纯化。
[0247] 实施例14人源化OX40抗体与人或猴OX40结合
[0248] 根据实施例2中的方法步骤，对人源化OX40抗体进一步测试其与人、猴或小鼠OX40的结合力。
[0249] 如图8A-8F所示，所有的人源化抗体均保持了与人和猴OX40蛋白的结合力，但是不与小鼠OX40结合，与其鼠源母抗体以及嵌合抗体一致。
[0250] 实施例15.人源化OX-40抗体与HEK-293A细胞表达的人或猴OX40
[0251] 根据实施例5中所述的FACS分析的方法步骤，对人源化OX40抗体进一步其与HEK293A/人OX40细胞以及HEK293A/猴OX40细胞的结合力。
[0252] 如图9A-9D所示，所有的人源化OX40抗体都显示出对HEK293A/人OX40细胞和HEK293A/猴OX40细胞的高亲和力，与其鼠源母抗体以及嵌合抗体一致。
[0253] 实施例16人源化OX40抗体对OX40信号通路有激动性
[0254] 参照实施例7，通过HEK-Blue对人源化OX40抗体进一步检测其对OX40信号通路的激活力。RG7888和MEDI0562作为阳性对照。如图10A和10B所示，所有的人源化抗体均能激活OX40信号通路。
[0255] 实施例17人源化抗体对T细胞有共激活作用
[0256] 根据实施例9中的方法步骤，对人源化抗体进一步测试其对T细胞的共激活作用。T细胞来源于2个健康人供体的血样。除IL-2的分泌外，还检测了OX40抗体对CD4+T细胞增殖的作用。
[0257] 具体地，根据制造商的说明，将PHA和IL-2预激活的人原代CD4+T细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Cat#：C34554I，invitrogen，美国)进行标记，改动之处在于使用2.5μM的CFSE，并于37℃孵育10分钟。标记后，将细胞重悬于RPMI完全培养基(RPMI+10％FBS)中，并将细胞密度调整成1.5×105活细胞/ml。板子用5μg/ml的CD3抗体(OKT3，Cat#：GMP-10977-H001，义翘神州，中国)和梯度稀释的OX40抗体4℃包被过夜。板用PBS清洗3遍并用封闭液(PBS+1％BSA)37℃封闭90分钟。板用PBS清洗3遍后每孔加入150μl上述调整好密度的CD4+T细胞(30000个细胞每孔)。细胞在37℃孵育72小时后通过FACS检测其CSFE信号，确定其细胞增殖情况。RG7888和MEDI0562作为阳性对照抗体，HEL抗体(LifeTein，LLC，Cat.#：
LT12031)作为阴性对照抗体。如图11A、11B、图12A和12B所示，所有的人源化OX40抗体均能增强T细胞活性、剂量依赖性地提高T细胞中IL-2的分泌，且剂量依赖性地促进T细胞的细胞增殖。
LT12031)作为阴性对照抗体。如图11A、11B、图12A和12B所示，所有的人源化OX40抗体均能增强T细胞活性、剂量依赖性地提高T细胞中IL-2的分泌，且剂量依赖性地促进T细胞的细胞增殖。
[0258] 实施例18嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的亲和力
[0259] 通过BIAcoreTM8K(GE LifeSciences，美国)来定量测定嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的结合亲和力。
[0260] 具体地，将100-200RU(反应单位)的人OX40-his蛋白(Cat#：10481-H03H，义翘神州，中国)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences，美国)上，随后用1M氨基乙醇封闭芯片未反应基团。梯度稀释(浓度从0.3μM到10μM)的抗体注入到SPR反应液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE LifeSciences，美国)中，速度控制在30μL/分钟。抗体的结合力计算时，扣减空白对照孔的RU。结合速率(ka)和解离速率(kd)使用BIA评估软件中的1∶1配对模型的公式进行计算。平衡解离常数KD通过kd/ka计算得到。SPR确定的抗体结合解离曲线如图13所示，表9则总结嵌合抗体和人源化抗体的结合亲和力数据。RG7888和MEDI0562抗体作为阳性对照。
[0261] 表9.OX40抗体对人OX40的结合亲和力
[0262]抗体 ka kd KD
MEDI0562 8.63E+4 1.54E-4 1.79E-9
RG7888 3.22E+5 1.76E-6 5.49E-12
68C8 3.93E+05 7.35E-05 1.87E-10
68C8-H0L0 4.1E+05 1.84E-03 4.49E-09
68C8-H2L2 2.07E+05 1.05E-03 5.07E-09
68C8-H2L3 4.73E+5 9.27E-4 1.96E-9
68C8-H3L2 1.65E+05 1.57E-03 9.55E-09
68C8-H3L3 2.03E+05 8.21E-04 4.04E-09
71H8 5.25E+05 8.28E-05 1.58E-10
71H8-H0L0 2.97E+05 2.74E-03 9.21E-09
71H8-H2L2 3.58E+05 1.72E-03 4.81E-09
71H8-H2L3 4.34E+5 1.98E-3 4.57E-9
71H8-H3L2 2.34E+05 8.71 E-03 3.72E-08
71H8-H3L3 3.25E+05 2.07E-03 6.36E-09
MEDI0562 8.63E+4 1.54E-4 1.79E-9
RG7888 3.22E+5 1.76E-6 5.49E-12
68C8 3.93E+05 7.35E-05 1.87E-10
68C8-H0L0 4.1E+05 1.84E-03 4.49E-09
68C8-H2L2 2.07E+05 1.05E-03 5.07E-09
68C8-H2L3 4.73E+5 9.27E-4 1.96E-9
68C8-H3L2 1.65E+05 1.57E-03 9.55E-09
68C8-H3L3 2.03E+05 8.21E-04 4.04E-09
71H8 5.25E+05 8.28E-05 1.58E-10
71H8-H0L0 2.97E+05 2.74E-03 9.21E-09
71H8-H2L2 3.58E+05 1.72E-03 4.81E-09
71H8-H2L3 4.34E+5 1.98E-3 4.57E-9
71H8-H3L2 2.34E+05 8.71 E-03 3.72E-08
71H8-H3L3 3.25E+05 2.07E-03 6.36E-09
[0263] 实施例19人源化OX40抗体的抗原结合表位鉴定
[0264] 通过ELISA测试人源化OX40抗体的抗原结合表位。
[0265] OX40的胞外区(ECD)包含4个半胱氨酸富集结构域(CRD)，分别命名为CRD1、CRD2、CRD3和CRD4。基于OX40的结构，构建了4个重组OX40蛋白：全长OX40ECD-mFc(含CRD1/2/3/4，SEQ ID NO.：38)、截短体1-mFc(含CRD2/3/4，SEQ ID NO.：39)、截短体2-mFc(含CRD/3/4，SEQ ID NO.：40)和截短体3-mFc(含CRD/4，SEQ ID NO.：41)。这几个蛋白均在N端连有信号肽信号肽(SEQ ID NO.：42)，用以蛋白表达分泌，在C端连有mFc标签(SEQ ID NO.：43)，用于ELISA检测。合成DNA序列并克隆到pcDNA3.1载体中。重组蛋白表达和纯化根据实施例10中的方法步骤进行。按照实施例2所述的方法步骤进行ELISA检测，来评估单抗对重组OX40蛋白的结合力。RG7888和MEDI0562作为阳性对照抗体。
[0266] 如图14所示，所有的抗体均与全长OX40ECD-mFc、截短体1-mFc以及截短体2-mFc结合，但是不与截断体3-mFc结合。结果表明，68C8H2L3和71H8H2L3抗体以及两个阳性对照抗体均与位于CRD3/4的表位结合。
[0267] 实施例20人源化OX40抗体与人OX40特异结合
[0268] 为检测抗体对OX40的结合特异性，根据实施例2所述的方法步骤，通过ELISA法检测人源化抗体与人OX40以及序列同源性较高的TNFRSF家族其他成员的结合力。
[0269] 具体而言，检测了人源化抗体与人CD40-his(TNFRSF5，Cat#：10774-H08H，义翘神州，中国)、人HVEM-mFc(TNFRSF14，Cat#：HVM-H5255，ACRO，中国)、人4-1BB(TNFRSF9，Cat#：41B-H522a，ACRO，中国)、人NGFR(TNFRSF16，Cat#：13184-H08H，义翘神州，中国)、人DR6(TNFRSF21，Cat#：10175-H08H，义翘神州，中国)、和人RANK(TNFRSF11，Cat#：RAL-H5240，ACRO，义翘神州，中国)的结合亲和力。
[0270] 如图15所示，68C8-H2L3抗体和71H8-H2L3抗体不与CD40(TNFRSF5)、HVEM(TNFRSF14)、4-1BB(TNFRSF9)、NGFR(TNFRSF16)、DR6(TNFRSF21)或RANK(TNFRSF11)结合，表明68C8-H2L3抗体和71H8-H2L3与OX40的结合是特异性的。
[0271] 实施例21人源化抗体有体内抗肿瘤效果
[0272] 对抗体68C8H2L3和71H8H2L3的体内抗肿瘤效果进行研究，所使用的动物模型通过对OX40靶点人源化的转基因小鼠(GemPharmatech Co.Ltd，中国)植入MC38小鼠肠腺癌而建立。各小鼠在第0天腹部皮下注射1×106MC38细胞，。待肿瘤长到80mm3时，随机分成五组(每组8只)。小鼠在第5、8、12、15和18天腹腔注射68C8-H2L3、71H8-H2L3、对照抗体或PBS，10mg/kg/天。
[0273] 随时间追踪肿瘤大小，用游标卡尺隔天测量肿瘤的长边(D)和短边(d)，并通过公式TV＝0.5x D x d2计算肿瘤体积。在抗体组肿瘤达到3.5cm3前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。
[0274] 在第20天，各组取4只小鼠用于T细胞分析，其他小鼠继续进行肿瘤大小测量，直至第60天。用于T细胞分析的小鼠在第20天处死后，立即取肿瘤放置在有胶原酶的Hanks缓冲液中。用剪刀将肿瘤组织剪成小块，并将剪碎的肿瘤组织继续孵育在含胶原酶的Hanks缓冲液中，37℃轻缓震摇30分钟。之后，向各样品加入10ml RPMI 1640+10％FBS，终止胶原酶活性，保持免疫细胞活力。将样品通过70μm细胞滤膜(Coming，Cat#：352350)，进行过滤，并放置在新离心管中。样品离心后重悬到PBSF缓冲液中(PBS+2％FBS)，细胞密度为1×107细胞/ml。样品用PBSF清洗2遍，然后将相应的荧光标记CD45抗体(小鼠CD45抗体，BrilliantViolet 785TM，Cat#：103149，Biolegend，美国)和CD8抗体(小鼠CD8抗体，APC，Cat#：100712，Biolegend，美国)加入样品进行染色。将所得的混合物4℃孵育半个小时。细胞用PBSF清洗2遍，然后经FACS仪器(BD)进行分析。
[0275] 如图16A和16B所示，与阴性对照组相比，OX40抗体的治疗显著地抑制肿瘤生长，尽管个体反应不同。可以看到，在抗体停药后，在所有(71H8H2L3组)或大部分(68C8H2L3组，8只中的6只)小鼠中观察到肿瘤生长抑制或停止。在第60天的时候，71H8H2L3组剩余的4只小鼠均表现出完全肿瘤消退(CR)，而其他抗体组只有一半小鼠表现出完全肿瘤消退。此外，如图17所示，抗体71H8H2L3和68C8H2L3均显著增加CD8+CD45+细胞数量。
[0276] 尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。