20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用转让专利
申请号 : CN201910362833.5
文献号 : CN110106092B
文献日 : 2021-03-12
发明人 : 刘桂清 , 曹莉 , 韩日畴
申请人 : 广东省科学院动物研究所
摘要 :
本发明公开了20‑羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用。本发明针对冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝体时间长，冬虫夏草人工培养周期长和效率低等问题，在冬虫夏草菌培养基中添加20‑羟基蜕皮激素对芽生孢子进行菌丝诱导培养，培养第2天即发现芽生孢子萌发形成菌丝，培养第8天芽生孢子萌发形成长菌丝，菌丝形成率较不添加诱导物质对照提高32.25～171.44％。本发明促进芽生孢子以形成菌丝的方式生长，提高了冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的效率。
权利要求 :
1.20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是在冬虫夏草菌培养基中加入
20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培养。
3.20-羟基蜕皮激素在制备促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝制剂中的应用。
4.一种促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的方法，其特征在于，在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培养，冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的冬虫夏草菌培养基为液体培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的20-羟基蜕皮激素，其在液体培养基中的浓度为0.5mM以上。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培养，其芽生孢子的接种终浓度不高于107个/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的芽生孢子的接种终浓度为105-107个/mL。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基为每150mL含有30g土豆、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖或葡萄糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1，余量为水。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的诱导培养，其培养条件为：12±2℃，100转/分，黑暗培养。
说明书 :
20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝
中的应用
技术领域：
[0001] 本发明属于真菌培养技术领域，具体涉及20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用。
背景技术：
背景技术：
[0002] 冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis是我国传统的名贵中药材，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。冬虫夏草是由冬虫夏草菌(又名中华被毛孢，中国被毛孢)侵染蝙蝙蝠
蛾科Hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体。冬虫夏草生境特殊(仅在高海拔高寒
草甸环境自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限。虽然冬虫夏草已被列入
《国家重点保护野生植物名录》二级保护物种，但冬虫夏草的过度采挖并没有得到有效遏
制。在栖息地退化、全球气候变暖，尤其是冬虫夏草的过度开发利用等多种因子的综合影响
下，天然冬虫夏草资源蕴藏量急剧下降(Hopping KA,Chignell SM,Lambin EF.The demise
ofcaterpillar fungus in the Himalayan region due to climate change and
overharvesting.Proc Natl Acad Sci USA.2018,115:11489-11494)。
蛾科Hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体。冬虫夏草生境特殊(仅在高海拔高寒
草甸环境自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限。虽然冬虫夏草已被列入
《国家重点保护野生植物名录》二级保护物种，但冬虫夏草的过度采挖并没有得到有效遏
制。在栖息地退化、全球气候变暖，尤其是冬虫夏草的过度开发利用等多种因子的综合影响
下，天然冬虫夏草资源蕴藏量急剧下降(Hopping KA,Chignell SM,Lambin EF.The demise
ofcaterpillar fungus in the Himalayan region due to climate change and
overharvesting.Proc Natl Acad Sci USA.2018,115:11489-11494)。
[0003] 近年来，通过模拟青藏高原生态环境，利用冬虫夏草菌侵染蝙蝙蝠蛾幼虫成功培养冬虫夏草，冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫进入血腔后，主要以芽生孢子形式存在血淋巴中，
芽生孢子以出芽萌发产生新的芽生孢子的方式进行增殖，需要5个月以上的时间芽生孢子
才形成菌丝体，而且有些蝙蝠蛾幼虫携带芽生孢子生长1年以上而不形成菌丝体，而芽生孢
子发育形成菌丝是冬虫夏草菌致死幼虫并长出子实体的关键环节。因此，如何促进芽生孢
子发育形成菌丝从而缩短子座培养时间是目前冬虫夏草人工培养产业面临的重要问题。
芽生孢子以出芽萌发产生新的芽生孢子的方式进行增殖，需要5个月以上的时间芽生孢子
才形成菌丝体，而且有些蝙蝠蛾幼虫携带芽生孢子生长1年以上而不形成菌丝体，而芽生孢
子发育形成菌丝是冬虫夏草菌致死幼虫并长出子实体的关键环节。因此，如何促进芽生孢
子发育形成菌丝从而缩短子座培养时间是目前冬虫夏草人工培养产业面临的重要问题。
[0004] 20-羟基蜕皮激素是昆虫前胸腺中合成后分泌到血液中的一种甾醇类化合物，在昆虫变态发育过程中起到关键作用，目前尚未见该物质对真菌生长影响方面的报道。
发明内容：
发明内容：
[0005] 基于上述问题，本发明的目的是提供20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用，从而解决冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的时间长，人工培
养冬虫夏草周期长的问题。
养冬虫夏草周期长的问题。
[0006] 本发明通过实验发现，在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素可以促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝。
[0007] 因此，本发明的第一个目的是提供20-羟基蜕皮激素在促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝中的应用。
[0008] 所述的应用是在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培养。
[0009] 本发明的第二个目的是提供20-羟基蜕皮激素在制备促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝制剂中的应用。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种促进冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的方法，在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培
养，冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝。
养，冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝。
[0011] 所述的冬虫夏草菌培养基优选为液体培养基。
[0012] 所述的20-羟基蜕皮激素，其在液体培养基中的浓度为0.5mM以上。
[0013] 所述的在冬虫夏草菌培养基中加入20-羟基蜕皮激素，然后接种冬虫夏草菌芽生孢子进行诱导培养，其芽生孢子的接种终浓度不高于107个/mL，进一步优选为105-107个/
mL。
mL。
[0014] 所述的液体培养基可以用冬虫夏草菌的常规培养基，优选为每150mL含有30g土豆、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖或葡萄糖、0.08g硫酸镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1，余量为
水。
水。
[0015] 所述的诱导培养，其培养条件为：12±2℃，100转/分，黑暗培养。
[0016] 本发明针对冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝体时间长，冬虫夏草人工培养周期长和效率低等问题，在冬虫夏草菌培养基中添加2mM的20-羟基蜕皮激素对芽生孢子进行菌
丝诱导培养，培养第2天即发现芽生孢子萌发形成菌丝，培养第8天有45％以上的芽生孢子
萌发形成长菌丝，菌丝形成率比不添加诱导物质提高82.37％以上。本发明促进芽生孢子以
形成菌丝的方式生长，提高了冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的效率。
附图说明：
丝诱导培养，培养第2天即发现芽生孢子萌发形成菌丝，培养第8天有45％以上的芽生孢子
萌发形成长菌丝，菌丝形成率比不添加诱导物质提高82.37％以上。本发明促进芽生孢子以
形成菌丝的方式生长，提高了冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝的效率。
附图说明：
[0017] 图1是本发明接种培养液的冬虫夏草菌芽生孢子(荧光28染色，400×)。
[0018] 图2是本发明诱导冬虫夏草菌芽生孢子发育形成菌丝(荧光28染色，400×)。具体实施方式：
[0019] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0020] 以下实施例使用的芽生孢子是冬虫夏草菌的芽生孢子。
[0021] 芽生孢子接种母液是通过以下方法制备：
[0022] 将含有冬虫夏草菌芽生孢子的菌液经三层擦镜纸或滤网过滤，然后在10℃，5000转/分条件下离心15分钟，弃部分上清，血球计数板计数芽生孢子数量，得到浓缩芽生孢子
液，将浓缩芽生孢子液分别稀释至芽生孢子浓度为1.5×109个/mL和1.5×107个/mL作为芽
生孢子接种母液接种(图1)。
液，将浓缩芽生孢子液分别稀释至芽生孢子浓度为1.5×109个/mL和1.5×107个/mL作为芽
生孢子接种母液接种(图1)。
[0023] 实施例1：
[0024] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL的芽生孢子接种
母液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的
作为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，
培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，
于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到46.50％(图2)，较不添加20-羟基蜕皮激素的
对照提高88.49％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL的芽生孢子接种
母液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的
作为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，
培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，
于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到46.50％(图2)，较不添加20-羟基蜕皮激素的
对照提高88.49％。
[0025] 实施例2：
[0026] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到31.33％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
32.25％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到31.33％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
32.25％。
[0027] 实施例3：
[0028] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
7
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×10 个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为1mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到45.01％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
82.45％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
7
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×10 个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为1mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到45.01％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
82.45％。
[0029] 实施例4：
[0030] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为0.5mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，
培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，
于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到35.67％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提
高44.59％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为0.5mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，
培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，
于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到35.67％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提
高44.59％。
[0031] 对比例1：
[0032] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
5
液使芽生孢子终浓度为10个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到24.67％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
5
液使芽生孢子终浓度为10个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到24.67％。
[0033] 对比例2：
[0034] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g麦芽糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到23.69％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到23.69％。
[0035] 实施例5：
[0036] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g葡萄糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到44％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
171.44％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×107个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到44％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
171.44％。
[0037] 实施例6：
[0038] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g葡萄糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到25.35％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
89.32％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，并加入20-羟基蜕皮激素(以不加20-羟基蜕皮激素的作
为对照)使其终浓度为2mM，放置于转速为100转/分的摇床，于12±2℃，黑暗条件下培养，培
养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培养第8天，取出1mL培养菌液，于
显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到25.35％，较不添加20-羟基蜕皮激素的对照提高
89.32％。
[0039] 对比例3：
[0040] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g葡萄糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
7
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×10 个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到16.21％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
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于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×10 个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为105个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到16.21％。
[0041] 对比例4：
[0042] 冬虫夏草菌液体培养基的制备：将30g煮熟土豆过滤液(称取30g去皮土豆，加适量水煮20min，过滤，取过滤液，即为30g煮熟土豆过滤液)、1.5g蛋白胨、3g葡萄糖、0.08g硫酸
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到13.39％。
镁、0.25g磷酸二氢钾、3mg维生素B1装入500mL三角瓶中，用水定容至150mL。经高压灭菌，置
于12±2℃培养室预冷，每150mL液体培养基接入1mL浓度为1.5×109个/mL芽生孢子接种母
液使芽生孢子终浓度为107个/mL，不加入菌丝诱导物质，放置于转速为100转/分的摇床，于
12±2℃，黑暗条件下培养，培养第2天，取出1mL培养菌液，镜检发现芽生孢子开始萌发，培
养第8天，取出1mL培养菌液，于显微镜下镜检芽生孢子的菌丝形成率达到13.39％。