用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合

摘要

本发明涉及用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合，其包括：上游引物：5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'；下游引物：5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；和探针：5'‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑3'。本发明提供了一种能够检测CA4的试剂组合，并达到较高的检测灵敏度。本发明还涉及该试剂组合在制备试剂盒中的用途；以及试剂盒。

权利要求

1.一种试剂组合，其用于与柯萨奇病毒A4型的检测相关的用途，所述试剂组合包括：上游引物：5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'；

下游引物：5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；和探针：5'‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑3'。

2.根据权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合用于柯萨奇病毒A4型的荧光定量PCR检测。

3.根据权利要求1或2所述的试剂组合，所述探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。

4.根据权利要求3所述的试剂组合，所述报告荧光基团选自由CY5、Cal Red610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXAS RED和VIC组成的组；所述淬灭荧光基团选自由BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse和TAMRA组成的组。

5.权利要求4所述的试剂组合，所述报告荧光基团为FAM。

6.权利要求4所述的试剂组合，所述淬灭荧光基团为BHQ1。

7.根据权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合还包括内标监控系统，所述内标监控系统含内标模板、内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

8.权利要求7所述的试剂组合，所述内标模板的核酸序列如SEQ ID No.4所示。

9.权利要求7所述的试剂组合，所述内标上游引物的序列如SEQ ID No.5所示、所述内标下游引物的序列如SEQ ID No.6所示，以及所述内标探针的序列如SEQ ID No.7所示。

10.根据权利要求1所述的试剂组合，所述试剂组合还包括用于从样本中提取和/或纯化柯萨奇病毒A4型RNA的试剂。

11.根据权利要求10所述的试剂组合，其中，所述样本来自血液、咽拭子、脑脊液或粪便。

12.根据权利要求11所述的试剂组合，其中，所述样本来自咽拭子或粪便。

13.根据权利要求10～12中任一项所述的试剂组合，所述提取或纯化使用磁珠法实现。

14.试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1～13中任一项所述的试剂组合。

15.权利要求1～13任一项所述试剂组合在制备用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂盒中的用途。

说明书

用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合

技术领域

[0001] 本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂组合。

背景技术

[0002] 柯萨奇病毒(Coxsackie virus，CV)最初于1948年由Dolldorf和Sickles在美国纽约州Coxsackie镇从临床诊断为脊髓灰质炎的患儿粪便中分离出来。柯萨奇病毒一种常见肠道病毒(Enterovirus)，分为A、B两组，其中A组病毒有24个血清型(A1～A24)，而B组病毒有6个血清型(B1～B6)。临床上，柯萨奇病毒感染诊断与分类的方法通常包括病毒培养、免疫学检验和核酸检测。

[0003] 其中，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，该技术使用带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。

[0004] 目前，对于柯萨奇病毒的一些常见血清型，如A6、A16型，已持续地进行了研究；针对它们的各自特点，研究者已设计出一些用于体外诊断的荧光定量PCR引物对和/或探针；它们中的一部分已经商业化并应用于基于实时荧光定量RCR的临床检测中。然而，由于此前柯萨奇病毒A4型的关注较少，其相对于A6、A16等血清型来说并不是研究热点，相关的报道寥寥；值得一提的是，国内尚无基于实时荧光定量PCR技术定量检测柯萨奇病毒A4型的商业化试剂盒。

[0005] 柯萨奇病毒A组4型(CA4)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，是导致手足口病发病的常见病原体。CA4在1950年首次出现在美国，1998年发展为肯尼亚株(GQ176232)、亚洲株(2008日本株AB457644)和亚洲欧洲株(GⅡ‑A)3种基因型别。文献资料报道显示CA4感染还可引起急性迟缓性麻痹、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎等多种疾病。近年来手足口病病原谱发生变化，非EV71和非CA16病毒感染引起手足口病比例有所增加，其中CA4感染占肠道病毒感染病例数的构成比约为1％。已经有多个地区爆发了由CA4病毒感染引起的手足口病疫情，研究显示我国广州地区目前的CA4流行株也是主要流行株，是由原始株发生了明显的基因变化而快速产生的流行毒株。然而，国内外目前对CVA4的研究较少，且多限于对病毒株的分离和鉴定。

[0006] 继而，基于荧光定量PCR的柯萨奇病毒A4型检测试剂盒逐渐受到了关注。

[0007] 就这方面来说，中国专利公开CN102816869A提供了一组用于柯萨奇病毒A4实时荧光PCR检测引物和探针，其能够在25μl体系下检测50拷贝的CA4，即检测灵敏度为2000拷贝/mL。而对于CA4拷贝数较低的情况，该引物和探针组合则难以实现有效检测。

[0008] 因此，在本领域中，存在着其他CA4荧光PCR检测试剂，尤其是具有较高检测灵敏度的检测试剂的强烈需求。

发明内容

[0009] 如前所述，如何基于荧光定量PCR的报道检测柯萨奇病毒A4型的问题已逐渐引起了人们的关注。而值得一提的是，由于对CA4检测的研究目前仍处于初期阶段，相关投入热度以及文献报道量均处于较低水平，因此在研发过程中所能借鉴参考的资料非常有限；相对于其他热门的血清型来说，这无疑给A4型检测的研究工作带来了更多困难。

[0010] 在大量工作的基础上，本发明提供一种基于荧光PCR的柯萨奇病毒A4型检测试；

[0011] 所述试剂组合可用于与柯萨奇病毒A4型的检测相关的用途，

[0012] 所述试剂组合包括：

[0013] CA4F1上游引物：5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'(SEQ ID No.1)；

[0014] CA4R1下游引物：5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'(SEQ ID No.2)；和

[0015] CA4P1探针：5'‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑3'(SEQ ID No.3)。

[0016] 在具体的实施方式中，CA4F1与CA4R1可分别以0.1μmol/L～0.5μmol/L的浓度存在；CA4P1可以0.1μmol/L～0.5μmol/L的浓度存在。

[0017] 在具体的实施方式中，所述试剂组合用于柯萨奇病毒A4型的荧光定量PCR检测。

[0018] 在具体的实施方式中，所述探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。例如，所述探针的5'端可标记有报告荧光基团，而3'端可标记有淬灭荧光基团。

[0019] 示例性的报告荧光基团可以是CY5、Cal Red 610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXAS RED和VIC等。示例性的荧光淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。

[0020] 在优选的实施方式中，所述报告荧光基团为FAM。

[0021] 在优选的实施方式中，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

[0022] 除上述引物与探针外，本发明的试剂组合还可以包括用于进行荧光定量PCR的其它反应试剂，如PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、mMLV酶、Taq DNA聚合酶、阳性对照或阴性对照等。

[0023] 在具体的实施方式中，阳性对照可为已知浓度的假病毒。

[0024] 在具体的实施方式中，阴性对照可为灭菌生理盐水。

[0025] 在优选的实施方式中，为了预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性防止检测结果出现假阴性、监控反应体系是否有效，本发明的试剂组合可额外提供有内标监控系统。

[0026] 具体地，所述内标监控系统可包括内标模板、内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

[0027] 在一个具体的实施方式中

[0028] 内标模板为为插入pUC18T载体的一段长为110碱基对的人工合成DNA序列的重组体，浓度为5.00E+03拷贝/ml～5.00E+05拷贝/ml，序列如下所示：5’‑ACCGAAAGGCTATCATTATGGCTCCAGTTCCTCGTTAATTCTCGATTCCGAGTACTTTAAAGGGGCTTCTGGTCGACTACGTACGCTCTCTTCTACTTCGAGTACGACAG‑3’(SEQ ID No.4)；

[0029] 内标上游引物为IC‑F：5’‑ACCGAAAGGCTATCATT‑3’(SEQ ID No.5)；

[0030] 内标下游引物为IC‑R：5’‑CTGTCGTACTCGAAGTA‑3’(SEQ ID No.6)；和[0031] 内标探针为IC‑P：5’‑GGCTCCAGTTCCTCGTTAATT‑3’(SEQ ID No.7)。

[0032] 在具体的实施方式中，内标上游引物与内标下游引物可分别以0.1μmol/L～0.4μmol/L的浓度存在；内标探针可以0.1μmol/L～0.4μmol/L的浓度存在。

[0033] 类似地，所述内标探针的两端可分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。

[0034] 示例性的报告荧光基团可以是CY5、Cal Red 610、FAM、HEX、JOE、ROX、TET、TEXAS RED和VIC等。示例性的荧光淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2、BHQ3、Eclipse、TAMRA等。

[0035] 优选的，所述内标探针与检测把多核苷酸的探针具有不同的报告荧光基团。

[0036] 优选的，所述内标探针与检测把多核苷酸的探针具有相同的报告荧光基团。

[0037] 在优选的实施方式中，内标探针的报告荧光基团可为HEX，内标探针的荧光淬灭基团可为BHQ1。

[0038] 在一些实施方式中，本发明的试剂组合还可包括用于从样本中提取和/或纯化柯萨奇病毒A4型RNA的试剂。示例性的提取或纯化方法可包括煮沸法、离心柱法、磁珠法。在优选的实施方式中，本发明的试剂组合包括使用磁珠法提取或纯化RNA的相关试剂。

[0039] 在一些实施方式中，本发明的试剂组合还包括处理样本的试剂，其中，所述样本来自受试者的血液、咽拭子、脑脊液或粪便，优选来自咽拭子或粪便。

[0040] 在另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明的试剂组合。

[0041] 在又一方面，提供了本发明的试剂组合在制备用于检测柯萨奇病毒A4型的试剂盒中的用途。

[0042] 经过大量设计和筛选，本发明选出一组引物和探针的组合，该组合的对柯萨奇病毒A4型的扩增与检测效果要优于本发明中类似的其它组合；另一方面，本发明请求保护的引物和探针组合的检测灵敏度为500拷贝/mL，检测范围为5.0E+02～1.0E+08拷贝/mL；同时，该组合还具有很好的特异性，不能检测出CA6、CA10、CA16、EV71、CB1、CB2、CB3、CB5等非CA4型的肠道病毒病原体。

附图说明

[0043] 图1示出了实施例3中组合A的荧光定量PCR扩增曲线图；

[0044] 图2示出了实施例3中组合B的荧光定量PCR扩增曲线图；

[0045] 图3示出了实施例3中组合C的荧光定量PCR扩增曲线图；

[0046] 图4示出了实施例3中组合D的荧光定量PCR扩增曲线图；

[0047] 图5示出了实施例3中组合E的荧光定量PCR扩增曲线图；

[0048] 图6示出了实施例3中组合A的检测范围验证试验结果；

[0049] 图7A示出了实施例4中CA6、CA10、CA16、EV71、CB1、CB2、CB3和CB5的检测结果；

[0050] 图7B示出实施例4中内标的检测结果。

具体实施方式

[0051] 下文将结合具体实施例阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

[0052] 实验材料

[0053] ‑样本：使用高浓度CA4病毒保存液，按照10倍使用TE溶液梯度稀释四个梯度，即A(5.00E+05拷贝/ml)、B(5.00E+04拷贝/ml)、C(5.00E+03拷贝/ml)和D(5.00E+02拷贝/ml)。

[0054] ‑RNA提取试剂，包括：

[0055] RNA提取溶液I：0.2～1.0w/v％十二烷基硫酸钠、1.0～4.0w/v％曲拉通、0.2mol/L～1.0mol/L异硫氰酸胍和100μg/ml～400μg/ml的磁珠；

[0056] RNA提取溶液II：100mmol/L～300mmol/L 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、100mmol/L～300mmol/L氯化钠，pH6.5±0.2；

[0057] RNA提取溶液III：0.1～1.0v/v％曲拉通、100mmol/L～300mmol/L氯化钠；

[0058] RNA提取溶液IV：矿物油。

[0059] ‑RNA洗脱液：0.8mol/L～1.2mol/L Tris‑HCl和0.1ml/L～1.0mol/L EDTA。

[0060] ‑PCR‑mix，包括：

[0061] PCR反应液38μl/份+酶混合液2μl/份；

[0062] 其中，PCR反应液包括5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.5μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，0.1μmol/L～0.5μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针0.1μmol/L～0.4μmol/L的用于检测内标的上下游引物，0.1μmol/L～0.4μmol/L的用于检测内标的探针；

[0063] 酶混合液：mMLV酶20U/μl～200U/μl和2U/μl～10U/μl H‑Taq DNA聚合酶。‑内标系统，包括：

[0064] 内标模板，其核苷酸序列为：

[0065] 5’‑ACCGAAAGGCTATCATTATGGCTCCAGTTCCTCGTTAATTCTCGATTCCGAGTACTTTAAAGGGGCTTCTGGTCGACTACGTACGCTCTCTTCTACTTCGAGTACGACAG‑3’；

[0066] 针对的内标模板的引物探针：

[0067] 内标上游引物(IC‑F):5’‑ACCGAAAGGCTATCATT‑3’；

[0068] 内标下游引物(IC‑R):5’‑CTGTCGTACTCGAAGTA‑3’；

[0069] 内标探针(IC‑P):5’HEX‑GGCTCCAGTTCCTCGTTAATT‑BHQ1‑3’；

[0070] ‑内CA4‑酶混合液：mMLV酶20U/μl～200U/μl，2U/μl～10U/μl H‑Taq DNA聚合酶。

[0071] ‑CA4‑阳性对照：标定已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05拷贝/ml。

[0072] ‑CA4‑阴性对照：灭菌生理盐水。

[0073] 实施例1

[0074] 1)RNA的提取与纯化

[0075] 使用磁珠法核酸提取或纯化试剂(湘长械备20150021)处理样本、阳性对照和阴性对照的RNA，具体步骤为：

[0076] S01裂解病毒：准备无核酸酶的1.5mL离心管，每管加入200μl～1ml RNA提取溶液I混匀，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心后备用；

[0077] S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟，室温静置10～30分钟；

[0078] S03去除杂质：静止结束后瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，保留磁珠备用；

[0079] S04洗涤：在备用的磁珠内加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

[0080] S05静止2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠保留备用；

[0081] S06在上述保留备用磁珠中加入10μl～100μl RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

[0082] S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个0.2mL PCR反应管加入40μl PCR‑mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照和阳性对照各10μl加入PCR‑mix中，盖好管盖，形成待测样品。

[0083] 2)荧光PCR反应：

[0084] 使用荧光定量PCR仪(ABI 7500)对1)中获得的待测样品进行测量检测通道选择：选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:None)检测CV A4；选择HEX(Reporter:HEX,Quencher:None)检测内标。

[0085] 荧光定量PCR反应条件为表1所示：

[0086] 表1

[0087]

[0088] 3)荧光PCR分析：

[0089] 反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。根据各样品检测结果的Ct值大小和扩增曲线形状进行判断。

[0090] 对于测定Ct值≤36的样本，报告为阳性；

[0091] 对于测定Ct值＞36且内标Ct值≤36，报告为阴性。

[0092] 实施例2

[0093] 根据柯萨奇病毒4型的基因序列，设计了众多上游引物、下游引物和探针。经前期实验筛选，得到上游引物5条(CA4F1～CA4F5)、下游引物5条(CA4R1～CA4R5)和探针3条(CA4P1～CA4P3)用于进一步研究。

[0094] 这些引物和探针具体为：

[0095] CA4F1(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)：

[0096] 5'‑ACATCCACCATACAGAGGGTCA‑3'；

[0097] CA4F2(其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)：

[0098] 5'‑CACATCCACCATACAGAGGGTCACA‑3'；

[0099] CA4F3(其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)：

[0100] 5'‑GCACATCCACCATACAGAGGG‑3'；

[0101] CA4F4(其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)：

[0102] 5'‑ACATCCACCATACAGAGGTCACA‑3'；

[0103] CA4F5(其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)：

[0104] 5'‑CATCCACCATACAGAGGGTCACA‑3'；

[0105] CA4R1(其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)：

[0106] 5'‑GCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；

[0107] CA4R2(其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示)：

[0108] 5'‑CATGCTGTAGACGAAGCTC‑3'；

[0109] CA4R3(其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)：

[0110] 5'‑ATGCTGTAGACGAAGCTCCT‑3'；

[0111] CA4R4(其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)：

[0112] 5'‑CATGCTGTAGACGAAGCT‑3'；

[0113] CA4R5(其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)：

[0114] 5'‑CATGCTGTAGACGTAGCTCCTG‑3'；

[0115] CA4P1(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)：

[0116] 5’‑FAM‑CAACAGCCGCCAACACCAC‑BHQ1‑3’；

[0117] CA4P2(其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示)：

[0118] 5’‑FAM‑TTACAACAGCCGCCAACAC‑BHQ1‑3’；

[0119] CA4P3(其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示)：

[0120] 5’‑FAM‑TTACAACAGCCGCCAACACCA‑BHQ1‑3’。

[0121] 实施例3

[0122] 将实施例2筛选到的引物和探针进行组合排列，共得到75种组合，利用实施例1中的实验方法对实验材料部分中的样本进行检测，以评价各组合方式的优劣。结合曲线形态、阳性率和Ct值结果可知，可将这75种组合大致分为五类：

[0123] 第一类扩增曲线形态挺拔、阳性率为100％，同时Ct值相对靠前，这样的引物探针组合仅有1组(组合A)；

[0124] 第二类扩增曲线形态挺拔、阳性率为100％，但Ct值相对拖后，这样引物探针组合有5组(例如，组合B)；

[0125] 第三类扩增曲线形态不挺拔、阳性率为100％，而且Ct值相对拖后，类似引物探针组合有8组(例如，组合C)；

[0126] 第四类扩增曲线形态不挺拔、阳性率约为80％，而且Ct值相对拖后，类似引物探针组合有24组(例如，组合D)；

[0127] 第五类扩增曲线形态不挺拔、阳性率约为60％或更低，而且Ct值相对拖后，类似引物探针组合数量最多，共有37组(例如，组合E)。

[0128] 其中，下表2及图1～5中给出了示例性的引物探针组合的检测结果。

[0129] 表2

[0130]

[0131] 随后，采用实施例1的方法，用组合A对CA4浓度为5.0E+02～1.0E+08拷贝/mL的系列样本进行检测，结果如图6所示。由此可知，使用组合A的检测范围可达5.0E+02～1.0E+08拷贝/ml。

[0132] 实施例4

[0133] 使用实施例3中组合A，根据实施例1中的方法对CA6、CA10、CA16、EV71、CB1、CB2、CB3、CB5阳性样本进行检测，结果均未为阴性(图7A)，而内标为阳性(图7B)。上述结果说明组合A的检测特异性好，不会交叉检出其他的肠道病毒。